MXPA06010916A - Novedoso metodo de proteccion neurologica mediante inhibicion farmacologica de proteina quinasa activada por amp. - Google Patents

Abstract

Un metodo de proteccion neurologica que comprende la administracion de un inhibidor de AMPK a un paciente que esta experimentando o que ha sufrido un accidente cerebrovascular, el compuesto es un inhibidor de AMPK. Los tratamientos con estos agentes reducen significativamente el tamano de los infartos, y por lo tanto reducen al minimo la perdida de tejido cerebral y de neuronas. Asi, puede conservarse la funcion despues del accidente cerebro vascular o del dano isquemico en el cerebro. De manera similar, se puede reducir al minimo la perdida neuronal en enfermedades degenerativas que ocasionan compromiso neuronal perturbando el uso de energia y la disponibilidad en las neuronas.

Description

NOVEDOSO MÉTODO DE PROTECCIÓN NEUROLOGICA MEDIANTE INHIBICIÓN FARMACOLÓGICA DE PROTEINA QUINASA ACTIVADA POR AMP Antecedentes de la Invención El accidente cerebro vascular, definido como una anormalidad en las funciones cerebrales resultado de la interrupción de la circulación sanguínea cerebral, es una de las principales causas de muerte en los Estados Unidos de América. Aun cuando un accidente cerebro vascular no tenga como consecuencia la muerte, los costos que impone a la victima pueden incluir daños muy serios tanto físicos como emocionales, que pueden a su vez dar como resultado una pérdida de productividad. Estos costos son generados por el terrible daño causado por el accidente vascular en el cerebro de la víctima. Con una reducción en los niveles de oxígeno y glucosa, las células presentan una rápida interrupción de la síntesis de proteínas, agotamiento de los almacenes energéticos intracelulares, desestabilización de la membrana celular y activación del receptor NMDA, que resulta en daños de excitoxicidad y oxidación de las células cerebrales. En un intento por sobrevivir y reparar el daño causado por la oxidación, y recobrar la homeóstasis de la célula, se activan numerosos procesos de compensación que provocan un alto consumo de energía. Sin embargo, la activación excesiva de estos procesos puede agravar el cuadro, provocando un aceleramiento de la pérdida de energía celular, y resultando en un mayor daño cerebral. Estos daños cerebrales son, por lo general, irreversibles. De acuerdo con lo antes señalado, un método que proteja el tejido cerebral (protección neurológica) durante un accidente cerebro vascular sería tremendamente importante. La proteína Quinasa activada por AMP (AMPK), miembro de la familia proteínica Quinasa sensible a los metabolitos, es un sensor conocido del balance de energía periférica (Carling D., "The AMP-activated protein inasa cascade- a unifiying system for energy control". Trends Biochem Sci 6:314 (2): 580-585, 2004). La AMPK es una proteína heterotrimérica compuesta por una subunidad catalítica a(a1 o a2) y dos subunidades reguladoras (ß y ?). La AMPK se fosforila y se activa cuando los niveles de energía celular se encuentran bajos. Al mismo tiempo, la AMPK regula el metabolismo celular y también en forma crónica regula la expresión genética para restaurar los niveles de ATP. Se sabe que los aumentos en el cociente AMP/ATP, cambios en el pH de las células y el estado redox, así como los aumentos en los niveles del cociente creatina/fosfocreatina activan la AMPK (Hardie DG, Salt IP, Hawley SA, Davies SP, "AMP-activated protein kinase: an ultrasensitive system for monitoring cellular energy charge" Biochem J 338:717-22, 1999; Hawley SA, Davison M, Woods A, et al. "Characterization of the AMP-activated protein kinase from rat liver and identification of threonine 172 as the major site at which it phosporylates AMP-activates protein kinase" J Biol Chem 271 :27879-87, 1996). La AMPK aumenta la oxidación del ácido graso y restringe su síntesis en un intento por aumentar los niveles de ATP en las células que ha perdido toda su energía. Sin embargo, en las neuronas que presentan una capacidad restringida para la oxidación que provoca el ácido graso, este efecto podría resultar detrimental (Almeida A, Moneada S, Bolaños JP, "Nitric Oxide switches on glycolysis through the AMP protein kinase and 6-phosphofructo-2-kinase pathway" Nature Cell Biology 6:45-51 , 2004). La inhibición del sintetizador del ácido graso (FAS), la enzima que es responsable de la síntesis de sales de esteres de ácido palmítico, por medio del C75, un inhibidor sintético incluido en la patente estadounidense número 5,981 ,575 (incorporada aquí mediante referencia), eleva los niveles de ATP en varios tipos de células, incluyendo las neuronas. La AMPK está altamente expresada en las neuronas del hipotálamo, donde parece jugar un papel en la regulación de la cantidad de alimentos ingeridos. El nivel del AMPK fosforilado del hipotálamo (pAMPK) se eleva con la inanición; el tratamiento con C75 desactiva y desfosforíla a la AMPK e induce una profunda anorexia. Las consecuencias de la activación de la AMPK en las neuronas que no tienen acceso a fuentes de energía son desconocidas. Hasta la presente invención, no está claro si la activación de la AMPK bajo estrés fue protectora o dañina. No existen estudios previos que examinen el papel de la AMPK durante un accidente cerebro vascular. Breve descripción de la invención Los solicitantes han inventado un método de protección neurológica que comprende administrar un compuesto a un paciente que está experimentando o que ha experimentado un accidente cerebro vascular. Este compuesto en esencia es un inhibidor de la AM PK. Los tratamientos con estos agentes reducen significativamente el tamaño de los infartos, y por lo tanto reducen al mínimo la pérdida de tejido cerebral y neuronas. Gracias a esto muchas funciones cerebrales pueden ser preservadas después de un accidente cerebro vascular o una lesión isquémica en el cerebro. De manera similar, la pérdida neuronal puede ser reducida al mínimo en enfermedades degenerativas que causan daño neuronal, perturbando la utilización adecuada de la energía celular y la disponibilidad de esta en las neuronas. Breve Descripción de las Figuras FIG. 1 - Localización inmunohistoquímica de la AMPK y la pAMPK en el cerebro de ratón isquémico. FIG. 2 - Localización inmunohistoquímica de la pAMPK y el NeuN en la corteza cerebral y en el hipocampo de ratón isquémico. FIG. 3 - Elevación de la pAMPK después de un accidente cerebro vascular en el transcurso del tiempo. FIG. 4 - Análisis de detección Western que demuestra que la fosforilación de la AMPK se eleva como resultado de la privación de oxígeno y glucosa (OGD) in-vitro.

FIG. 5 - El análisis colorimétrico TTC y el análisis de detección Western muestran que los niveles de pAMPK se elevan en los hemisferios cerebrales isquémicos y no isquémicos. FIG. 6 - El tratamiento con el compuesto C causa una disminución significativa en los volúmenes regional y total del accidente cerebro vascular. FIG. 7 - La administración de C75 lleva a una significativa protección neurológica. FIG. 8 - La administración de AICAR, que es un activador de la AMPK, exacerba el accidente cerebro vascular. FIG. 9 - Niveles de AMPK y pAMPK en ratones de tipo natural (WT) y en ratones con deficiencia de sintasa de óxido nítrico neuronal (nNOS-/-). FIG. 10 - Niveles de AMPK y pAMPK en ratones de tipo natura! (WT) y en ratones con deficiencia de poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP-1 ). Descripción Detallada de la Invención Por "protección neurológica" entendemos proteger las células cerebrales, preferiblemente las neuronas, contra daños permanentes causados por un accidente cerebro vascular, durante y después de éste. Por "accidente cerebro vascular" entendemos una anormalidad en las funciones cerebrales resultado de la interrupción de la circulación sanguínea cerebral.

Por "Inhibidor de AMPK" entendemos un compuesto que inhibe la AMPK, como se determinó en el método descrito por Witters, et al., Journal of Biological Chemistry, 267, pp. 2864-2867 (1992). Preferiblemente, el inhibidor de AMPK debe elegirse de un compuesto que no sea un péptido u otro material biológico (o derivado biológico), pero que sea una molécula pequeña. Las composiciones de la presente invención pueden ser presentadas para suministrarse a seres humanos y otros animales en formas de dosis unitaria, como tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, granulos, soluciones o suspensiones estériles parenterales, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite que contienen cantidades adecuadas del compuesto, supositorios y en suspensiones o soluciones líquidas. Para su uso en esta especificación, los términos "diluyente farmacéutico" y "transportador farmacéutico" tienen el mismo significado. Para administrarse por vía oral se pueden preparar dosis unitarias en forma sólida o líquida. Para preparar composiciones sólidas, como las tabletas, el compuesto puede ser mezclado con ingredientes convencionales como el talco, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio, silicato de magnesio y aluminio, sulfato de calcio, almidón, lactosa, acacia, metílcelulosa y materiales funcionalmente similares como diluyentes o transportadores farmacéuticos. Las cápsulas se preparan mezclando el compuesto con algún diluyente farmacéutico inerte y rellenando con la mezcla una cápsula de gelatina duras de tamaño apropiado. Las cápsulas de gelatina blandas son elaboradas mediante el encapsulado mecánico de la mezcla del compuesto con algún aceite vegetal aceptable, petrolato ligero líquido, u otro aceite inerte. También es posible preparar dosis unitarias fluidas para administración oral, como jarabes, elíxires y suspensiones. Las formas pueden ser disueltas en algún vehículo acuoso junto con azúcar, agentes saborizantes y aromáticos para formar un jarabe. Las suspensiones pueden prepararse mediante el uso de algún agente de suspensión como la acacia, goma tragacanto, metilcelulosa y similares. Para administración parenteral es posible preparar dosis unitarias utilizando el compuesto y algún vehiculo estéril. Al preparar las soluciones, el compuesto puede ser disuelto en agua para inyectarse, previa filtración, y después vaciarse en un frasco o ampolleta adecuados y sellarse. Se puede disolver adyuvantes, tales como un anestésico local, agentes conservadores y reguladores de pH en el vehículo. El compuesto puede ser congelado después de ser embotellado y se le puede eliminar el agua por medio de vacío. El polvo resultante puede entonces ser sellado dentro del frasco, y reconstituirse antes de usarlo. El sujeto es preferiblemente un mamífero y de manera más preferible, un ser humano. La dosis y la duración del tratamiento dependerán de una variedad de factores, entre los que se encuentra (1 ) la edad, peso corporal, y funcionamiento de los órganos (por ejemplo, función de hígado y ríñones); (2) la naturaleza y extensión del proceso de enfermedad que será tratado, así como cualquier otro padecimiento significativo coexistente, y cualquier otro medicamento que esté siendo tomado de manera concomitante, y (3) parámetros relacionados con el fármaco, como la vía de administración, la frecuencia y duración de la dosis necesaria para efectuar una cura, y el índice terapéutico del fármaco. En general, la dosis será elegida de modo que se logren niveles en suero de 1 ng/ml a 100 ng/ml con la finalidad de obtener concentraciones efectivas en el rango meta de aproximadamente 1 µg/ml hasta 10 µg/ml. De manera ideal, el compuesto será administrado lo más pronto posible después del inicio del accidente cerebro vascular. Antes de esta invención se desconocía el papel que juega el metabolismo neuronal en respuesta a una lesión cerebral. Sin el deseo de atarnos a la teoría, con esta invención hoy se sabe que el pAMPK se eleva después de un accidente cerebral isquémico en un modelo de reperfusión focal en ratones. El nivel de AMPK se eleva antes de que hayan pasado 90 minutos de una agresión isquémica, y se multiplica por cuatro durante la reperfusión temprana. Con esta invención se sabe ahora también que la administración de inhibidores de AMPK no solo dio como resultado la disminución de la activación de la AMPK (como lo muestra la fosforilación disminuida de la AMPK), sino también proveyó una protección neurológica significativa. También se descubrió que la administración de activadores de la AMPK puede exacerbar el daño causado por un accidente cerebro vascular. Sin deseos de apegarnos a la teoría, se cree que la AMPK, además de jugar un papel importante en la regulación fisiológica de la energía, tiene efectos de largo plazo en la supervivencia celular después del estrés isquémico. La demanda de energía es alta durante una situación de estrés isquémico, pero los niveles de energía son bajos debido a la falta de substrato (oxígeno y glucosa). Al interferir en la percepción de energía celular y la activación de la AMPK, puede aumentarse el umbral isquémico de las células, lo que permite a las células sobrevivir en una situación de baja energía en estado latente hasta que la producción de energía pueda ser normalizada. La modulación de las rutas metabólicas con inhibidores sintéticos de FAS o estimuladores de CPT-1 , como el C75, puede alterar el metabolismo neuronal y crear un balance positivo de energía. El C75 inhibe a la AMPK tanto en los cultivos de la corteza como en el hipotálamo in vivo, lo que nos indica que la AMPK responde al balance de energía neuronal. La administración de C75 lleva a aumentos sostenidos de niveles neuronales de ATP en neuronas cultivadas. Bajo condiciones isquémicas, la pérdida continua del ATP puede exceder los procesos recuperadores de energía, conduciendo a la incapacidad de la célula para morir por el proceso altamente consumidor de energía conocido como apoptosis (muerte celular programada), empujando a las células hacia la muerte celular necrótica. Por ello, detectar los niveles de ATP puede ser importante enlas respuestas neuronales a la isquemia y los inhibidores de AMPK podrían restaurar los niveles de ATP y salvar las neuronas. La activación de la AMPK ocurre después de la isquemia cerebral; en este escenario, su activación es perjudicial para la supervivencia neuronal. La AMPK se ubicó en las neuronas y mantuvo este patrón de distribución (a diferencia de la localización glial) en el cerebro postisquémico. La AMPK se activo rápidamente, antes de que pasaran noventa minutos de la oclusión vascular in vivo, y antes de 2 horas en una privación de oxígeno y glucosa (OGD) in-vitro. Se observaron aumentos en los niveles de AMPK en el cerebro, tanto en las áreas penumbrales como en áreas alejadas sacadas de la lesión isquémica. Inicialmente se pensó que dicho aumento representaba una respuesta de adaptación al estrés neuronal, como un mecanismo mediante el cual el cerebro podría incrementar los niveles de producción de ATP en momentos de demanda incrementada de energía. Sorpresivamente, sin embargo, nuestros estudios farmacológicos claramente demuestran que la inhibición de la activación de AMPK bajo condiciones de isquemia neuronal redujo el daño causado por el accidente cerebro vascular. La administración del compuesto C, inhibidor de la AMPK, o el inhibidor de FAS C75, proveyó protección neurológica significativa en nuestro modelo. En contraste, la administración del compuesto AICAR, activador de la AMPK, exacerbó el daño causado por el accidente cerebro vascular. Por último, los ratones con deficiencia de nNOS no sólo tuvieron infartos más pequeños, sino también niveles más bajos de pAMPK después del accidente cerebro vascular, mientras que los ratones con deficiencia de PARP-1 tuvieron niveles de AMPK similares a los de los ratones en estado natural (WT) a pesar de presentar infartos más pequeños. Estas observaciones sugieren que las rutas de nNOS y ONOO son importantes activadores de la AMPK in vivo, en condiciones de estrés neuronal. La activación de la AMPK neuronal es perjudicial en un modelo in vivo de isquemia y lesión causada por reperfusión, y esa prevención la fosforilación de la AMPK inducida por un accidente cerebro vascular provee protección neurológica. Una citotoxina bien caracterizada que se forma en las células isquémicas es el peroxinitrito (ONOO), un sub producto que es un potente oxidante, el cual se genera cuando el superóxido y el NO se producen en cantidades casi equimolares. Existe una constante fuga de superóxido proveniente de la cadena de respiración mitocondrial, que es desactivada por antioxidantes endógenos, como el superóxido dismutasa (SOD). Bajo condiciones de producción incrementada de NO, el NO puede reemplazar al SOD como superóxido, dando como resultado la formación del ONOO. El ONOO inhibe a las enzimas irreversiblemente, daña el ADN y activa la enzima reparadora de ADN poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP-1 ), que consume mucha energía y agota el NAD. La exposición de células endoteliales bovinas a ONOO sintetizado químicamente activó la AMPK sin que se dieran cambios en la concentración de AMP, y reprodujo el efecto con hipoxia/re-oxigenación. Estos efectos fueron mejorados por sobre expresión adenoviral de SOD o administración de inhibidores de NOS, lo que sugiere que la activación de la AMPK mediada por ONOO es mediada por NO. Recientemente se descubrió que el fármaco antidiabético Metformina también puede activar la AMPK independientemente de los niveles de AMP por medio de un mecanismo similar. Esto sugiere que la ruta NO/ONOO puede ser un importante estímulo para la activación de la AMPK. Nuestros estudios en ratones nNOS-/- apoyan esta hipótesis, pues las reducciones en la formación de NO y ONOO observadas en estos animales llevaron a una reducción dramática en la activación de la AMPK inducida por un accidente cerebro vascular. Sin embargo, los ratones nNOS machos tienen accidentes cerebro vasculares significativamente más pequeños que sus contrapartes WT. Es posible que cualquier manipulación que reduzca el daño isquémico resulte también en una reducción de la activación de pAMPK debido al "más leve" estrés isquémico que experimenta el cerebro. Las elevaciones en el nivel de AMPK podrían simplemente representar un marcador del aumento del daño isquémico. Atendimos a estas interrogantes examinando los niveles de pAMPK en ratones machos con eliminación programada de PARP-1. Sorpresivamente, los ratones sin PARP-1 presentaban un aumento equivalente de pAMPK inducido por el accidente cerebro vascular, comparado con sus contrapartes WT, a pesar de presentar infartos significativamente más pequeños (> 50 %). Esto sugiere que la elevación en los niveles de pAMPK no es simplemente un marcador del aumento en el daño isquémico, sino que puede estar relacionado mecánicamente con el ONOO y el nNOS. Antes, las consecuencias de la activación de la AMPK para la supervivencia de las células después de un accidente isquémico in vivo eran desconocidas. La mayor parte del trabajo ha sido realizada in-vitro, frecuentemente utilizando líneas transformadas de células. La activación de AMPK mediante AICAR mejoró la supervivencia bajo condiciones de disponibilidad de energía reducida (privación de la glucosa y excitoxicidad de glutamato) en neuronas hipocámpicas cultivadas. Sin embargo, numerosos investigadores han documentado ahora un efecto pro-apóptico del AICAR en numerosas líneas celulares, incluyendo hepatocitos, células de neuroblastoma y células MMIN de ratón mediante la estimulación de la quinasa c-jun-N-terminal (JNK), c-myc y capsasa 3. En contraste, el AICAR tiene un efecto protector en los cardiomiocitos isquémicos y previene la apoptosis astrocítica, lo cual sugiere que los efectos del AICAR dependen del tipo de célula y del sistema modelo utilizado. El AICAR es absorbido por la célula y se acumula en su citoplasma como el nucleótido monofosforilado, ZMP, que imita los efectos del AMP y activa la AMPK sin alterar los niveles celulares de ATP. Sin embargo, el AICAR es no específico y provoca otros numerosos efectos en la célula, incluyendo la inducción de adenosina, un conocido vasodilatador que funciona por medio de competencia con el transporte nucleósido. El AICAR redujo la muerte retrasada de las células del hipocampo después de una isquemia global en cobayos, pero en este caso el AICAR fue utilizado como un activador de la adenosina. Adicionalmente, el modelo de daño isquémico es muy diferente a nuestra lesión de isquemia por reperfusión. Nuestros datos demuestran que la activación de la AMPK ocurre durante un accidente cerebro vascular, y que esta respuesta, al aumentarse por medio del AICAR, exacerba el daño a los tejidos. Nuestros datos fisiológicos demostraron una limitación para el uso de AICAR en estudios in vivo, ya que revelaron una caída transitoria pero significativa en MAP en los ratones tratados con AICAR. La reducción en MAP podría por si misma haber incrementado el infarto independientemente de los efectos en la AMPK por medio de una disminución en la perfusión de áreas periinfárticas. Dada la brevedad de la caída, el mantenimiento del CBF (vía LDF (flujo láser Doppler)), y la fuerte protección neurológica observada en la inhibición farmacológica de la AMPK, es poco probable que esta sea la explicación primaria. Adicionalmente, datos recientes sugieren que la activación de la AMPK es dañina también para el corazón en estado isquémico, ya que la lesión cardiaca inducida por H2O2 fue mejorada parcialmente mediante un tratamiento a base del Compuesto C, similar a nuestros hallazgos en el CNS. Aun cuando la activación de la AMPK pudiera ser beneficiosa en algunos tejidos periféricos como respuesta a la hipoxia, la situación en el CNS podría ser diferente. Por ejemplo, en las células endoteliales en estado hipóxico, el eNOS es activado mediante fosforilación directa mediante la AMPK, para alterar presumiblemente el tono vascular para mejorar el flujo sanguíneo. Sin embargo, durante un accidente cerebro vascular, este supuesto efecto benéfico de la AMPK podría resultar de utilidad limitada, ya que el flujo sanguíneo cerebral (CBF) se ve drásticamente reducido durante la oclusión aguda (por el filamento), haciendo que la vasodilatación inducida por eNOS sea un proceso inútil, consumidor de energía. Adicionalmente, bajo condiciones hipóxicas la producción aumentada de NO (vía eNOS) puede llevar a niveles aumentados de ONOO, propagando las lesiones por radicales libres. El análisis de ambos sistemas, tanto in vivo como in-vitro, es crucial para determinar el resultado fisiológico de la activación de AMPK. Los graves efectos de la pérdida de ATP por exposición excesiva al NO de las neuronas in-vitro son mediados por un efecto inhibitorio en la respiración mitocondrial y por la inhibición de la glicólisis, que lleva a reducciones en la producción de energía tanto oxidativa como glicolítica. Sin embargo, en los astrocitos la inhibición de la respiración por el NO lleva a un aumento en la glicólisis astrocítica con una reducción de la apoptosis. Esta rápida activación de la glicólisis astrocítica que no depende del NO es regulada por la activación de la AMPK, con la subsiguiente activación de la fosfofructo-2-quinasa (PFK-2). Los astrocitos, por lo tanto, responden al estrés y la hipoxia con un aumento compensatorio de la glicólisis, que provee de energía y evita la muerte de la célula. La transfección de los astrocitoscon ARNsi de AMPK hace que los astrocitos sean incapaces de aumentar la glicólisis en respuesta al NO y aumenta los niveles de apoptosis. Las neuronas, a diferencia de los astrocitos, carecen de la maquinaria enzimática para aumentar la glicólisis, pues presentan muy bajos niveles de PFK2 y una capacidad restringida para la oxidación del ácido graso. Por lo tanto, la activación de la AMPK bajo condiciones patológicas tales como un accidente cerebro vascular, pudieran no aumentar la supervivencia neuronal. Aunque un accidente cerebro vascular focal involucra una parte pequeña del cerebro, mecanismos compensatorios, incluyendo cambios en el flujo sanguíneo cerebral (CBF) y demanda metabólica, ocurren en áreas lejanas sacadas del "núcleo" de la lesión isquémica. Por ejemplo, se puede observar edema cerebral en el hemisferio contra-lateral "no afectado" después de lesiones unilaterales grandes y focales, lo cual sugiere que el contenido de agua en el cerebro puede variar en áreas lejanas a la lesión original. La comunicación con el cerebro no isquémico puede ocurrir mediante "diasquisis" transcallosa o interhemisférica, que conduce a deficiencias en el CBF, en la actividad electrofisiológica y en el metabolismo. Es probable que la señal para la activación de la AMPK sea transmitida globalmente por todo el cerebro, como lo sugiere el robusto aumento contra-lateral de los niveles de pAMPK. La activación de AMPK incrementa el estrés en neuronas que ya se encuentran de por si comprometidas. Interferir con la percepción de energía celular podría aumentar el umbral isquémico, permitiendo a las células sobrevivir en estado isquémico pero latente hasta que la producción de energía sea restaurada. Reducir la activación de AMPK podría alentar la "hibernación neuronal" en etapas tempranas de la cascada isquémica, previniendo una falla de energía neuronal completa, y prolongando la viabilidad neuronal hasta que la sangre y el suministro de nutrientes puedan ser reestablecidos. Mejorar la dinámica de energía en las neuronas isquémicas permite prolongar la "ventana terapéutica" en un caso de accidente cerebro vascular. La idea de que los procesos metabólicos de las neuronas pudieran representar un novedoso e importante objetivo para la protección neurológica está demostrada por nuestros descubrimientos. La invención se describe con mayor profundidad mediante los siguientes ejemplos no limitativos: Ejemplos Animales para Experimento Los experimentos que a continuación se detallan fueron realizados en concordancia con los lineamientos NIH para el cuidado y uso de animales en investigación y bajo los procedimientos aprobados por el Comité para el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins. Modelo Isquémico Se indujo isquemia cerebral mediante una oclusión reversible de 120 minutos en la arteria cerebral derecha media (MCAO) bajo anestesia con halotano, seguida por reperfusión en varias ocasiones para ratones C57B6 machos (Charles River) o ratas machos, como describen McCullough, et al., Stroke, 32, 796-802 (2001 ) y McCullough, et ai. , J. Neuroscience, 24, pp. 257-268 (2004), respectivamente. Los déficits neurológicos inter-isquémicos y los déficits de 22 horas post reperfusión (NDS) se calificaron de la siguiente manera: 0, sin déficit; 1 , debilidad en las patas delanteras y torso girando hacia el lado ipsilateral al ser sujetados por la cola; 2, correr en círculos hacia el lado afectado; 3, incapaz de mantener peso en el lado afectado; y 4, ninguna actividad locomotora espontánea ni vueltas en el barril. Cualquier animal sin déficit fue excluido del estudio. En la isquemia final, el animal fue anestesiado brevemente y se inició la reperfusión mediante el retiro del filamento. A los animales con el papel de falsos se les dio la preparación quirúrgica equivalente, pero la sutura no se avanzó dentro de la carótida interna. Para los estudios de protección neurológica farmacológica, los ratones sobrevivieron por 22 horas después de la reperfusión, tiempo en el que se realizó la calificación de comportamiento. Después el cerebro fue extraído para realizar un análisis patológico con histología TTC (ver la sección de histopatología). En cohortes de animales separadas fueron evaluadas también las medidas fisiológicas, la presión sanguínea arterial femoral y la perfusión cortical (medición de flujo con láser Doppler) fueron evaluadas mediante MCAO y reperfusión temprana como se explica en el trabajo de 2001 de McCullough mencionado arriba. Animales adicionales fueron expuestos a la isquemia o cirugía falsa después de aplicarles un tratamiento farmacológico o de vehículo, y fueron sacrificados después de 4 o 24 horas para realizarles análisis de detacción Western. Los ratones machos con deficiencias de nNOS y PARP-1 (véase Huang, et al., Science, 256, 1883-1885 (1994); Eliasson, et al., Nat. Med., 3, 1089-1095 (1997)) fueron sometidos a MCAO derecha por dos horas o a cirugía falsa y comparados con cohortes WT adicionales (C57-BL6 para nNOS-/- y SVEV para PARP-1 ). Histopatología Terminal El volumen de infarto fue analizado por medio de colorimetría con 2,3,5-trifeniltetrazolio en 5 rebanadas de 2 milímetros. El volumen de infarto fue determinado por video microscopio y análisis de imágenes (Investigación 3, Loats y Asociados), como describió previamente McCullough, et al., J. Neuroscience 23, pp. 8701 -8705 (2003). Análisis de detección Western Se obtuvieron muestras de los cerebros de cráneos de ratón y rata con accidente cerebro vascular y falsos, mediante remoción rápida, resección del cerebelo, seguido de la disección inmediata de los hemisferios derecho (D) e izquierdo (I). Las muestras fueron congeladas instantáneamente en nitrógeno líquido. Las muestras de ratas fueron sub-disecadas en regiones de centro y penumbrales para ambos hemisferios. Las muestras fueron almacenadas a -80 °C hasta su uso. Cada muestra fue homogenizada en 200 µL de regulador de lisis (50 mM de Tris-HCl , pH 7.5, 250 mM de sacarosa, 5 mM de pirofosfato de sodio, 50 mM de NaF, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 1 mM de DTT, 0.5 mM de PMSF, 0.1 mM de benzamidina, 50 µg/mL de leupeptina, 50 µg/mL de inhibidor de tripsina de soya). Se añadió detergente SDS hasta obtener una concentracón final de 0.2 %, y se hirvieron los lisados durante 5 minutos. Luego de que el supernatante fue recolectado, se determinó la concentración de proteína utilizando un equipo BCA (Bio Rad). Se cargaron 40 µg de proteína por carril en un gradiente de 4-15 % de SDS-gel se poliacrilamida, y se transfirieron a una membrana de polivinilideno difluorado. Las manchas fueron sucesivamente sondeadas, desprendidas y probadas nuevamente para detección de antígenos. Se determinó la fosforilación de la AMPKa utilizando un anticuerpo anti-fosfo-AMPKa (Thr 1 y a.2) (1 :1000, Cell Signaling). Se obtuvieron anticuerpos ACC (1 :500), p-ACC (1 :1000), pAkt (1 :500) y Akt (1 :500) en Lake Piacid, Nueva York. Se usaron anticuerpos anti-AMPKa (anti-a1 y -a2, 1 : 1000; Cell Signaling), hsp-70 (1 : 1000; Santa Cruz) y a-actina (1 :5000; Sigma) como controles de carga. Todas las manchas fueron incubadas durante una noche en el anticuerpo primario a 4 °C en regulador TBS que contenía 5% de BSA y 0.1 % de Triton-X-100. El anticuerpo secundario (IgG anticonejo de cabra, Chemicon) fue diluido a 1 :5000, y se utilizó el equipo para detección ECL (pico) para la detección de las señales. Inmunohistoquímica Se prepararon secciones flotantes de cerebro como se describe en Kim, et al. , J. Biol, Chem., 279, 19970-19976 (2004) con algunas modificaciones. Las secciones que flotaban libremente fueron bloqueadas en un PBS que contenía 5% de suero de cabra, 1 mg/ml de BSA, 0.05% de Triton-X-100 y 1 mM de NaF durante una hora a temperatura ambiente, seguido por incubación con el anticuerpo anti-fosfo-AMPKa (1 :100), GFAP (1 : 1000, DAKO; para astrocitos), NeuN (Chemicon 1 :100; un marcador para neuronas maduras) o VWF (Santa Cruz; 1 :400 para células endoteliales) en PBS que contenía 1 % de suero de cabra, 1 mg/ml de BSA, 0.05% de Triton-X-100 y 1 mM de NaF durante la noche a 4 °C. El anticuerpo secundario (1 :200; Vector Laboratories; Burlingame, California) fue incubado en PBS que contenía 1 % de suero de cabra durante 1 h 30 min (Texas Red, FITC). La señal fue visualizada con un microscopio de inmunofluorescencia confocal y utilizando el software para obtención de imagen Zeiss (Zeiss LSM 510). Cultivo de cortes de Hipocampo y OGD Se prepararon cortes de cultivos organotípicos hipocampales como se describe en McMullough, et al., Stroke, 32, 796-802 (2001 ). Se obtuvieron cortes hemisféricos coronales de 350 mieras, de crías de rata de 7 días de nacidas utilizando un cortador de tejidos (Cortador de Tejido Mcllwain; Vibratome Company, St Louis, Missouri). Los cortes hipocampales fueron transferidos a insertos de membranas permeables Millicell de 30 mm (0.4 µm; Millipore, Bedford, Massachussets), en placas de seis receptáculos, cada uno con 1 mL de medio (50% de MEM, 25% de HBSS, 25 % de suero de caballo desactivado por calor, 6.5 mg/mL de D-glucosa, 5 U/mL de penicilina G y 5 µg/ml de sulfato de estreptomicina). Los cultivos fueron conservados en un incubador humidificado bajo 5% de CO2 a 37°C durante 13 días. Se realizó un cambio completo de medio 2 veces a la semana. La inducción de anoxia fue realizada el día 13 in-vitro. Los cortes de cultivo fueron enjuagados 2 veces con BBS tibio (en mM: 125 de NaCI, 5 de KCl, 1 .2 de NaH2PO4, 26 de NaHCO3, 1 .8 de CaCI2, 0.9 de MgCI2, 10 de HEPES y 10 de glucosa), y se regresaron al incubador para equilibrarse durante 30 minutos. Los cortes de cultivo fueron enjuagados dos veces con BBS tibio desoxigenado y libre de glucosa, transferidos a una cámara sellada a prueba de aire, limpiados con gas anóxico (5% de CO2, 85% de N2 y 10% de H2) y mantenidos a 37°C por 60 minutos. Los cortes de control fueron enjuagados con BBS y transferidos a un incubador normal aireado por una hora. El periodo de anoxia fue concluido regresando los cultivos a un medio fresco (50% de MEM, 25% de HBSS, 25% de suero de caballo desactivado por calor, 6.5 mg/mL de D-glucosa, 5 U/mL de penicilina G y 5 µg/mL de sulfato de estreptomicina) y las muestras fueron preparadas para el análisis Western a 2, 4, 6 y 24 horas (como arriba). Los cortes de control y los tratados con OGD fueron incluidos en cada experimento con receptáculos por triplicado o 15 cortes por condición para cada grupo experimental. Análisis Estadístico Todos los datos están expresados como + SEM (error estándar de la media). Las variables fisiológicas y la histología fueron analizadas por ANOVA unidireccional con un Newman-Keuls post-hoc para corregir comparaciones múltiples. Los registros neurológicos postisquémicos fueron analizados con la prueba U de Mann-Whitney. Los valores fueron considerados estadísticamente significativos con *, p<0.05; **, p<0.01 ; ***, p<.001 . Resultados La AMPK se expresa en las neuronas después de la isquemia Las secciones de tejido cerebral obtenidas de ratones sometidos a 2 horas de MCAO seguidas por 2 horas de reperfusión, mostraron prominente teñido neuronal tanto para AMPK como para pAMPK (Fig. 1 , n=5/gp). También fueron teñidos con NeuN (para neuronas maduras), y GFAP (para astrocitos). El microscopio confocal demostró la co-localización de NeuN y AMPK/pAMPK, con co-localización ausente en astrocitos. El microscopio confocal demostró la distribución de la AMPK (Fig. 1 A-C) y la pAMPK (Fig. D-F) localizada en las neuronas en la arteria cerebral media (MCA), tal como lo mostró la inmunofluorescencia con marcado doble utilizando el marcador para células maduras NeuN. Una amplificación mayor de las neuronas corticales inmunoteñidas para NeuN y pAMPK (Fig. 1 G-l) muestra inmunotinción nuclear y citoplásmica para la isoforma a. Mientras la AMPK puede encontrarse solo de forma mínima, expresada en astrocitos no estimulados del cerebro intacto, estudios previos han descubierto reactividad inmunológica de la AMPK en astrocitos cultivados. Para aclarar la localización de AMPK y pAMPK in vivo, examinamos tejidos normales no isquémicos, así como cerebros obtenidos a 4 y 24 horas después del infarto (a 2 ó 22 horas de la reperfusión) para determinar si la AMPK se expresa en los astrocitos después de un accidente cerebral vascular. Existió localización conjunta mínima de GFAP con AMPK o con pAMPK cuatro horas después de la MCAO (Fig. 1 J-L y Fig. 1 M-O, respectivamente). De igual manera que en el tejido a las 4 horas, no se observó localización conjunta de AMPK o pAMPK con GAF en la corteza cerebral 24 horas después del accidente cerebro vascular (Fig. 1 P-R). Adicionalmente, no se observó etiquetado conjunto ya sea en AMPK o en pAMPK con el marcador endotelial Factor Von Willebrand (VWF), en las muestras de cerebro intacto o isquémico (no se muestran datos). Para determinar si este patrón de localización de pAMPK fue mantenido regionalmente, se obtuvieron imágenes de baja potencia de pAMPK y doble etiquetado de NeuN, 24 horas después del infarto (22 horas después de la reperfusión) (Fig. 2). Niveles similares de tinción fueron observados en la corteza (Fig. 2 A-C) y en el hipocampo (Fig. 2 D-F), con un nivel prominente de etiquetado conjunto de pAMPK con NeuN en ambas regiones. No se observó ninguna señal en las secciones de control sin la adición del anticuerpo primario (no se muestran datos). Estos resultados muestran que la AMPK se expresa principalmente en las neuronas tanto del cerebro isquémico como del no isquémico, donde podría funcionar en forma autónoma a nivel celular para influir en el balance de energía neuronal. El nivel de AMPK aumenta después de la MCAO Se sometió a ratones machos C57B16 de tipo natural (WT) a 2 horas de MCAO derecha o a cirugía falsa, con tiempos variables de reperfusión. Los parámetros fisiológicos, como la temperatura, se mantuvieron constantes. No existieron diferencias significativas en las medidas fisiológicas entre cada grupo de tratamiento comparado con animales tratados con un vehiculo respectivo en C75 y con compuesto C (Cpd C). Los MAP y LDF se muestran con resultados promedio durante las 2 horas de isquemia. Los animales tratados con AICAR tuvieron una reducción significativa en el MAP a los 15 minutos (p< 0.05), sin ninguna diferencia general durante 2 horas devigilancia. Las reducciones en el LDF interisquémico fueron equivalentes en los animales con vehículo y con AICAR. Sin embargo, existió una reducción significativa (p< 0.05) en el LDF a 30 minutos de la reperfusión (n = 4/grupo): Tabla 1 : Valores de las Variables Fisiológicas Intraisquémicas v Flujo por Láser Doppler (LDF) en Cada Grupo Experimental Como puede apreciarse en la figura 3, la pAMPK (como se detecto por medio de un anticuerpo de subunidad pana para un sitio de fosforilación Thr (véase Hawley, et al. , J Biol Chem 271 , 27879- 27887 (1996)) se elevó durante un accidente cerebro vascular isquémico, tan pronto como 90 minutos después de la isquemia, comparado con los animales q ue habían pasado por cirugías falsas (falsos) (n=6 por punto de tiempo para animales isquémicos; 4 por punto de tiempo para controles con operación falsa). Los niveles de pAMPK fueron elevados en hemisferio derecho isquémico (D) y en el hemisferio izquierdo no isquémico (I), y se mantuvieron elevados por 24 horas (22 horas a partir de la reperfusión) , tanto el hemisferio izquierdo no isquémico como en el derecho isquémico. En contraste, los niveles de AMPK en los cerebros de los controles falsos mostraron cambios mínimos. Se observaron aumentos apropiados de hsp-70 en el hemisferio isquémico aunque estos fueron más notables en puntos de tiempo más tardíos (por ejemplo, 6, 12 y 24 horas después). La ß-actina funcionó como un control de carga. El aumento global de los niveles de pAMPK sugiere que la AMPK es activada de forma secundaria a las anormalidades metabólicas y reacciones compensatorias no sólo en el área isquémica, sino también en el lado contra lateral no isquémico. La AMPK es activada después de la OGD In Vitro Además de los hallazgos realizados in vivo, también determinamos si la AMPK se activa in-vitro en cultivos provenientes de cortes hipocampales después de la privación de oxígeno y glucosa (OGD), de un modelo in-vitro de accidente cerebro vascular. Observamos un fuerte aumento en los niveles de pAMPK 2 horas después de la OGD, comparado con los cultivos de control normoglicémicos normóxicos (Fig. 4A). El aumento de pAMPK persistía a las 6 horas, pero se normalizó a las 24, como se observó en nuestros estudios in vivo. Un objetivo corriente abajo de la activación de la AMPK es la acetil-CoA carboxilasa (ACC), que es la enzima que marca el paso en la síntesis de novo de los ácidos grasos; cuando se activa, la AMPK regula la fosforilación de la ACC, y por tanto activa la ACC, además de que limita el proceso anabólico de la síntesis de ácido graso en momentos de deficiencia de energía. La evaluación de las muestras de cortes 4 horas después de la OGD demostró un aumento en los niveles de acetil-CoA carboxilasa fosforilada o inactivada (Figura 4B), apoyando la idea de que los aumentos observados en pAMPK son fisiológicamente relevantes. Los niveles totales de AMPK y ACC cambiaron de forma mínima en todos los puntos de tiempo examinados, tanto en las muestras de cortes que presentaban OGD como en las de control. se observa aumento de AMPK en la penumbra isquémica Asumiendo que las anormalidades metabólicas en un accidente cerebro vascular podrían ser más graves en el centro necrótico de un infarto, por lo que los procesos a favor de la supervivencia podrían ser activados en la penumbra en un intento por salvar un cerebro con funcionamiento marginal, disecamos tejidos de centro (CC) y penumbrales, tanto del hemisferio isquémico derecho (IH, hemisferio isquémico) como del hemisferio no isquémico izquierdo (NIH, hemisferio no isquémico) para realizar análisis de detección Western de cerebros de rata (n=6/grupo) 6 horas después del accidente cerebro vascular (Fig. 5). Para este experimento se utilizaron ratas, ya que las disecciones del centro y la penumbra se pueden realizar más rápido y con más confiabilidad en el cerebro de la rata, por ser más grande; esto también nos permitió corroborar nuestros hallazgos en una especie diferente. La visualización de las áreas de disección y de isquemia fue realizada utilizando tinción con TTC a las 24 horas (Fig. 5B). Los niveles de pAMPK fueron elevados apreciablemente en el hemisferio cortical penumbral no isquémico y en el hemisferio contra lateral no isquémico (PC NIH y CC NIH, respectivamente), en comparación con los niveles de pAMPK en cualquier hemisferio del cerebro de los controles falsos (PC y CC) (Fig. 5B). Los niveles de pAMPK en el centro isquémico (CC en el hemisferio isquémico) fueron más bajos que en las demás áreas del cerebro, pero fueron elevadas en comparación con aquella de los controles quirúrgicos falsos (CC y PC falsos). Es posible que el nivel más bajo de AMPK en el centro represente una falla en la síntesis de proteínas y fosforilación dependiente de energía en el centro isquémico del infarto. Sin embargo, fueron observados aumentos esperados en la proteína 70 (véase Kury, et al. , Eur J Neurosci, 19, 1708-1720 (2004)), por golpe de calor. Alternativamente, la activación de AMPK podría representar un proceso compensatorio protector en la penumbra. La pAMPK podría ser regulada en neuronas que están dañadas, pero permanecen viables, como una estrategia para aumentar el suministro de energía disponible. Este aumento en AMPK contralateral sugiere que las neuronas que se encuentran alejadas del área del accidente también podrían estar recibiendo la señal que les ordena aumentar la disponibilidad de energía. Por lo tanto, los aumentos en los niveles de pAMPK y la actividad resultante podrían representar una vía de protección neurológica adaptativa endógena. Para atender a este problema, procedimos a manipular farmacológicamente los niveles de AMPK a fin de determinar el efecto de cambiar los niveles de pAMPK en el resultado final del accidente cerebro vascular. El compuesto C reduce los niveles de activación de pAMPK v provee protección neurológica Para examinar los efectos funcionales de la activación de AMPK en nuestro modelo isquémico, exploramos el efecto final de un accidente cerebro vascular en ratones tratados con el compuesto C, un inhibidor farmacológico de la AMPK descrito en J. Clin Invest 108, pp. 1 167-1 174 (2001 ). Se determinó el efecto de un accidente cerebro vascular en los animales tratados con el compuesto C (20 mg/kg suministrados intraperitonealmente; n=14) o vehículo (n=8) al inicio del accidente cerebro vascular (a 2 horas de la MCAO con reperfusión de 22 horas) (Fig. 6). El compuesto C redujo significativamente el volumen total del infarto (medido por porcentaje de hemisferio no isquémico, corregido por edema utilizando TTC), así como los volúmenes de infarto estriatal (CP; 64+5.7 contra 21 ±3.9; p>0.001 ) y cortical (CTX; 63±3.4 contra 19.4±3.3; p<0.01 ), comparado con los animales tratados con vehículo (Fig. 6A). Una reducción de la gravedad de los déficit de comportamiento a las 24 horas reflejó estas diferencias (vehículo 3.3±0.3 contra Compuesto C 1 .9±0.2, p<0.01 ). No existió diferencia en el flujo sanguíneo cerebral relativo (CBF), según medición realizada con Láser Doppler, ni durante el periodo intraisquémico (vehículo=9.8±0.54 contra Compuesto C=10.6±0.9; porcentaje de la línea base; p=n.s.), o durante los 30 minutos transcurridos después de la reperfusión, lo cual sugiere que las diferencias en el flujo sanguíneo no pueden ser responsabilizadas de las diferencias en el daño isquémico. No se apreciaron diferencias en medidas fisiológicas entre grupos de tratamiento (Tabla 1 ), lo cual demuestra la equivalencia en la contribución de estos factores al resultado del accidente cerebro vascular.

Grupos adicionales de ratones tratados con vehículo o con compuesto C que fueron sometidos ya sea a 2 horas de MCAO (n=6/grupo) o a cirugía falsa (n=4/grupo) fueron sacrificados 4 (Fig. 6B) ó 24 (Fig. 6C) horas después del infarto, con el fin de determinar los niveles de AMPK y pAMPK. Se analizaron lisados tanto del hemisferio isquémico (derecho, D) como del hemisferio no isquémico (izquierdo, I) por medio del análisis de detección Western en animales con accidente cerebro vascular y animales controles falsos. El aumento esperado de pAMPK 4 horas después del infarto (2 horas después de la reperfusión) fue observado en los animales tratados con vehículo (Fig. 6B, líneas 1 y 2) con relación a los animales controles falsos (líneas 5 y 6); los niveles totales de AMPK no sufrieron cambios. El efecto del compuesto C fue transitorio; los niveles de pAMPK fueron similares a los observados en los animales tratados con vehículo hacia las 24 horas (Fig. 6C, líneas 1 y 2 comparados con las líneas 5 y 6). Estos resultados sugieren que la inhibición de AMPK mediante el Compuesto C provee protección neurológica, y que este efecto neuroprotector se correlaciona con una reducción en los niveles de pAMPK. La reducción de los niveles de pAMPK mediante el inhibidor de FAS C75 provee protección neurológica en un accidente cerebro vascular Administramos el inhibidor de FAS C75 (20 mg/kg i.p.) o vehículo (RPMI) inmediatamente antes del inicio de la isquemia (n=9/gp). Basamos esta dosis en datos previos tomados in vivo que demostraron un efecto en el comportamiento al alimentarse y una inhibición de actividad C75 en el hipotálamo. Hubo una reducción significativa en el volumen regional y total del infarto observado en el grupo tratado con C75 (p<0.001 ). Se observaron mejoras en la calificación de comportamiento (vehículo 3.2±0.05 contra C75 2.0±0.03, p<0.01 ). Al igual que con el Compuesto C, no se observaron diferencias en el LDF o en las variables fisiológicas (n =4). Los grupos adicionales de ratones tratados con vehículo o con C75 sometidos ya sea a MCAO de 2 horas y reperfusión (N=6/grupo) o a cirugía falsa (n=4/grupo) fueron sacrificdos 4 h (Fig 7B) o 24 h (Fig. 7C) después de el accidente cerebrovascular para analizar sus niveles de AMPK y de pAMPK. El aumento esperado en pAMPK a las 2 horas de la reperfusión fue observado tanto en los ratones tratados con C75 como en los ratones tratados con vehículo (figura 7B, líneas 1 y 2 contra líneas 5 y 6, respectivamente), si bien el aumento en los niveles de pAMPK fue mitigado por el tratamiento con C75. Al igual que con el compuesto C, la reducción del aumento en los niveles de pAMPK fue más pronunciada en el hemisferio isquémico derecho (D), comparado con el hemisferio no isquémico izquierdo (I). En comparación con los ratones tratados con vehículo, el C75 redujo prominentemente los niveles de pAMPK tanto en los ratones control falsos como en los que sufrieron un accidente cerebro vascular a 24 horas de este (Fig. 7C, líneas 1 -4 contra líneas 5-8 respectivamente), lo que indica un efecto central más duradero del C75 (comparado con el compuesto C) en la reducción de los niveles de pAMPK). Como se muestra en la figura 5A, hubo una reducción significativa en el volumen regional y total del infarto observada en el grupo tratado con C75 (P<0.001 ). No existieron diferencias significativas en el flujo sanguíneo intraisquémico o en el de reperfusión, según mediciones con Láser Doppler, y tampoco se observaron diferencias en MAP, en pH o en mediciones de gases sanguíneos en la cohorte que no sobrevivió (n=4, no se muestran datos). Los grupos adicionales de ratones tratados con vehículo o con C75, y sometidos ya sea a 2 horas de MCAO (n=6/gp) o a cirugía falsa (n=4/gp), fueron sacrificados a 4 h (Fig. 5B) o a 24 h (Fig. 5C) después del accidente cerebro vascular, para obtener sus niveles de AMPK y pAMPK. Se pudo observar el aumento esperado en pAMPK a dos horas de la reperfusión en ratones tratados con vehículo y con C75. También se observaron reducciones en los niveles de pAMPK en animales tratados con C75 a 24 horas, tanto en animales controles falsos como en aquellos con infarto, documentando el efecto central más duradero del C75 (comparado con el compuesto C) en la reducción de los niveles de pAMPK. La activación de la AMPK con el activador de AMPK 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleósida (AICAR) exacerba el accidente cerebro vascular El activador de AMPK comúnmente utilizado, 5-aminoimidazol-4-carboxamida ribonucleósida (AICAR), (véase Cortón, et al., Eur J Biochem, 229, 558-565 (1995)) fue administrado al inicio del accidente cerebro vascular (500 mg/kg i.p. ; n=1 1 /grupo). El AlCAR es absorbido por las células y fosforilado para formar ZMP, que imita los efectos de la AMP en la activación de la AMPK. Se observó exacerbación significativa en los volúmenes de los accidentes cerebrovasculares totales y corticales (CTX) en animales tratados con AlCAR (Fig. 8A). La vigilancia fisiológica demostró una caída significativa en la presión arterial media (MAP) en los animales tratados con AlCAR, que se corregía por sí sola 15 minutos después de la inyección (vehículo MAP 84 contra AlCAR, 69 mmHg, p<0.05). No hubo diferencias en el CBF isquémico, pero una reducción en el CBF se observo en ratones tratados con AlCAR en contraste con ratones de control 30 minutos después de la reperfusión (98 contra 82.7 % de la línea base, p<0.05). Esto sugiere que parte de los efectos perjudiciales del AlCAR pueden ser secundarios para la presión de perfusión disminuida, además de sus efectos en la AMPK. El análisis de detección Western mostró elevaciones de pAMPK, cuatro horas después del accidente cerebro vascular (dos horas después de la perfusión) en animales tratados con AlCAR contra animales tratados con vehículo (Fig. 8B líneas 5-8 contra líneas 1 -4, respectivamente), las cuales regresaron a la línea base después de 24 horas (no se meustran datos). La pérdida de nNOS previene las elevaciones en los niveles de pAMPK inducidas por un accidente cerebro vascular Ya que el ONOO (peroxinitrito) proporciona una contribución significativa para el daño neuronal causado por un accidente cerebro vascular, y que la AMPK es activada por el ONOO al igual que la hipoxia in vitro, evaluamos el papel del NOS (nNOS) neuronal en la activación de la AMPK después de dicho accidente (Fig. 9). Los animales noqueados con nNOS tienen infartos significativamente más pequeños que sus contrapartes de tipo natural, principalmente debido a su reducción en la producción de ONOO. Nos fue posible confirmar el efecto de protección neurológica de la eliminación del nNOS en nuestro modelo de MCAO (infarto total: 55.8±4.9% en WT; 31.9±4% en nNOS-/-; p<0.01 ). Se sometió a ratones machos nNOS-/- y de tipo natural (WT) a MCAO derecha, y los cerebros fueron extraídos ya sea 4 horas (Fig. 9A) o 24 horas (Fig. 9B) después del infarto (22 horas después de la reperfusión). A las 4 horas, los ratones WT mostraron una elevación de la pAMPK comparados con los ratones WT de control falso, tanto en el hemisferio derecho (D) isquémico, como en el hemisferio izquierdo (I) no isquémico. Sin embargo, en los ratones nNOS-/-, el aumento en la pAMPK provocado por el accidente cerebro vascular fue abrogado, y los niveles de pAMPK fueron similares a aquellos presentados por los controles falsos. Se observaron resultados similares a las 24 horas (Fig. 9B). Los niveles de Akt fosforilado también se redujeron en los ratones nNOS-/-, en comparación con los ratones WT a 24 horas del infarto (22 horas después de la reperfusión), lo que sugiere una posible relación entre Akt, AMPK y NOS (Fig. 9C).

Tomando en cuenta la posibilidad de que la reducción en la activación de la AMPK en los ratones nNOS-/- podría ser simplemente un reflejo de la disminución en el daño isquémico observado en el área de estrés, también examinamos ratones machos con deficiencias en la enzima reparadora de ADN Poli(ADP-ribosa)polimerasa-1 (ratones noqueados en PARP-1 ), que tienen reducciones similares en el volumen de los accidentes cerebro vasculares a los de los ratones machos nNOS-/- (Fig. 10). Sorprendentemente, los ratones con deficiencia de PARP-1 tuvieron niveles similares de activación de pAMPK en el hemisferio isquémico en comparación con sus contrapartes WT. (Fig. 10, sólo se muestra el hemisferio isquémico) a pesar de presentar infartos más pequeños. Esto sugiere que la reducción en las producciones de NO y ONOO observadas en los ratones con deficiencia de nNOS lleva al mejoramiento selectivo de la activación de AMPK.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1 . Un método de protección neurológica que comprende administrar un compuesto a un sujeto que está experimentando o que ha experimentado un accidente cerebro vascular, u otra interrupción de flujo sanguíneo al cerebro por otras etiologías, el compuesto es un inhibidor de la AMPK.

2. El método de la reivindicación 1 , donde el compuesto no es un péptido u otro material biológico o derivado biológico.

3. El método de la reivindicación 2, donde el compuesto es C75.

4. El método de la reivindicación 2, donde el compuesto es el Compuesto C.

5. El método de la reivindicación 2, donde el compuesto no es C75 o Compuesto C.

6. El método de la reivindicación 1 , donde el compuesto es una molécula pequeña.

7. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un accidente cerebro vascular, que contiene un inhibidor de la AMPK.

8. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, donde el inhibidor de la AMPK es un inhibidor directo.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, donde el inhibidor de AMPK es un inhibidor indirecto.