CN104349805A - 制备单供体凝血酶血清的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

一种制备凝血酶血清的方法，包括：获得血液样品；使第一份血液与促凝剂接触，以形成结合到促凝剂表面上的凝血酶原酶复合物，从而获得可储存的活化促凝剂。然后，该活化促凝剂可与含有凝血酶原的第二份血液接触，以获得凝血酶血清，可以提取该凝血酶血清，并使其与血纤蛋白原接触，以获得血纤蛋白。

Description

制备单供体凝血酶血清的方法和装置
相关申请
本专利申请是于2012年9月25日提交的美国临时专利申请61/705,535的非临时申请，并要求该专利申请的优先权，该专利申请的全部内容并入本文而形成一体的文件。
技术领域
本发明涉及血液中的凝血酶原向凝血酶的转化，尤其涉及一种用于提高血液中的活化级联凝血蛋白的浓度的装置和方法。
背景技术
血浆凝结被认为是通过一系列的自我扩增型酶原-酶转化(图1)发生的，在这种转化过程的倒数第二步中产生凝血酶(FIIa)，凝血酶是一种强大的丝氨酸蛋白酶。在被称为“凝血级联”的最后步骤中，凝血酶原被称为凝血酶原酶复合物的含钙多蛋白复合物转化为凝血酶。凝血酶是一种酶，它把纤维蛋白原水解为血纤维蛋白单体，这些血纤维蛋白单体聚合为细网状，而这种细网又使血浆形成凝胶或凝块。凝血酶是胰蛋白酶族的丝氨酸蛋白酶，其分子量约为34kDa。它由两个多肽链构成。
凝血级联过程通常分为两个分支，以便论述和进行凝血障碍试验。内源性分支和外源性分支可分别强化，但可合并为一条引生凝血酶的公共途径。外源性途径负责止血控制，并对血管受伤做出响应。当血液与促凝物质接触时，内源性途径开始发挥作用，导致XII因子活化。在《J Biomed Mater Res.(生物医学材料研究学报)》1995年8月刊的29(8):1005-16部分和29(8):1017-28部分中，对促凝物质对凝血的接触活化作用进行了深入研究，这些文献的完整内容通过引用结合于此。
促凝物质指使血液形成凝血酶调节蛋白凝块的任何元素或活性物质。促凝剂包括各种带负电荷的表面，包括高岭土、棉花、陶瓷、玻璃、鞣花酸等有机和无机材料。促凝剂已知可单独使用或联合使用。
与这些带负电荷的表面结合会引起XII因子(FXII)发生构造变化，从而能够以蛋白水解的方式活化前激肽释放酶(PK)。PK以蛋白水解的方式活化FXII，从而形成一个正反馈回路，该正反馈回路使系统增强，并在激肽释放酶的作用下导致FXI活化和高分子量激肽原(HK)解理。
促凝物质的XIIa因子活化作用的后续产物是形成凝血酶原酶复合物，该复合物由丝氨酸蛋白酶、Xa因子、蛋白辅助因子、以及Va因子构成。在钙离子存在的条件下，该复合物聚合在带负电荷的磷脂膜上。向柠檬酸盐抗凝血液添加钙盐以使凝血级联过程继续进行常常被称为复钙。凝血酶原酶复合物催化从凝血酶原(II因子，一种不活跃的酶原)向凝血酶(IIa因子，一种活跃丝氨酸蛋白酶)转化的过程。虽然实验表明Xa因子在不与凝血酶原酶复合物结合时可活化凝血酶原，但是在这种情况下凝血酶形成速率会显著降低。
在正常血液中循环的重要凝血因子的浓度比种类繁多的其它血液蛋白(其中大约有490种，其浓度差异超过60倍)的浓度低得多。在许多未解决的问题中，一个问题是，白蛋白、纤维蛋白原或IgG等高浓度血液蛋白由于什么机制未能与活化复合蛋白在由血液浓度低得多的蛋白质所构成的促凝表面上的聚合(称为“吸附-稀释”效应)竞争。在2007年10月刊的《Biomaterials(生物材料学报)》的28(30):4355-4369页上，周氏等人揭示了：在始终存在活化表面的条件下，FXIIa在全血浆中的积聚速率会随时间而降低，从而导致FXIIa的产生量趋于稳态，该产生量取决于悬浮在血浆中的促凝微粒的初始FXII溶液浓度。该文献的完整揭示内容通过引用结合于此。作者解释说，这个结果有力地表明活化作用与自动抑制作用竞争，在自动抑制作用中，FXIIa本身抑制FXII→FXIIa。在2009年4月刊的《Biomaterials(生物材料学报)》的第30(10)：1857-1869页上，埃尔温A.福格尔和克里斯多佛A.谢德莱茨基全面考查了接触活化凝血化学过程(包括自动活化、自动水解和自动抑制反应)中存在的其它不确定性。参见图1。
凝血酶原酶复合物的聚合从Xa因子和Va因子结合到血浆膜上的带负电荷的磷脂上时开始。在结合到血浆膜上后，Xa因子和Va因子迅速地按1：1化学计量比联合，从而形成凝血酶原酶复合物。凝血酶原酶复合物的聚合取决于钙。完全聚合后的凝血酶原酶复合物会催化凝血酶原向丝氨酸蛋白酶凝血酶的转化。当与凝血酶原酶复合物联合时，Xa因子的催化效率会提高300000倍。
凝血系统受化学计量系统和动态抑制系统的异常严格的调控。血浆促凝剂、化学计量抑制剂、以及动态抑制过程的构成成分的浓度在很大程度上控制产生的凝血酶的最终量。例如凝血酶原酶复合物的Va因子在被活化蛋白C解理后失去活性，这降低了V因子结合到Xa因子上的能力。凝血酶原酶复合物的Xa因子被抗硫胺素III抑制，抗硫胺素III还有抑制凝血酶的作用。由于血浆蛋白抗硫胺素III的抑制性质，凝血酶在血浆中仅短暂地保持稳定，其半存留期约为10-15秒(《Advanced Engineering Materials(先进工程材料期刊)》第11卷第12期，B251-B260页，2009年12月，其完整内容通过引用结合于此)。
凝血系统的自动活化、自动水解和自动抑制反应的精确化学过程仍未知。为了解决改进接触活化反应方案的问题，可能需要解决蛋白质吸收和蛋白质吸附竞争的烦恼问题，并大大增加对酶原表面活化中涉及的生物化学作用的了解。
例如，在J.R.Soc.Interface(2009)10,1-10页上，詹姆妮等人考查了凝血酶在凝血级联中的作用以及其在血纤蛋白胶体生物工程应用中的用途，该文献的完整内容通过引用结合于此。凝血酶在临床上用于在烧伤和某些创伤状况的外科手术中进行止血。牛凝血酶也是某些商售组织胶产品中的成分。
常规的商售凝血酶治疗剂是从人和动物的混合血液制品提纯而成的，因此存在着染有病毒的危险，例如HIV和肝炎病毒。在比较这些商售凝血酶制剂时，铃木和桜川发现，这种制剂含有污染性蛋白，人源制剂含有免疫球蛋白G、乙型肝炎表面抗原抗体和人类免疫缺陷抗体。据报道，使用牛凝血酶进行异种免疫时，在病人体内产生了对人凝血酶和人凝血因子V(凝血因子V是牛凝血酶制剂中的污染物)的自反应抗体。另外，近来对带有病原体的牛类制品(例如牛海绵状脑炎药剂)可能造成的污染的关注程度有所提高，而这种病原体是通过常规手段无法检测或灭活的。人血治疗药品也易受到肝炎病毒和人类免疫缺陷性病毒等病毒微粒的污染。牛凝血酶被认为不适合于临床使用还有着文化和宗教原因。
重组凝血酶最近获得了FDA的批准，并且正在被商业宣传为是基于牛血浆的凝血酶产品的替代品，因为基于牛血浆的凝血酶可能导致形成牛凝血酶抑制抗体，并且还存在着与动物血液制品相关的安全考虑。但是，重组凝血酶已被证明在接受这种产品的某些病人中也具有致免疫性问题。
但是，业界长期以来所理解的是，对于需要血纤蛋白粘合剂的手术病人来说，最安全的状况是采用双组分生物粘合剂制剂，凝血酶组分与纤维蛋白原组分是从同一个供体获得的--这能形成完全自体同源的生物粘合剂或粘合胶，从而避免血源性疾病传播的任何危险。
利用源自于正在接受医疗过程的同一个病人的凝血酶和/或纤维蛋白原的理念可追溯到1974年，并不是一个新奇的理念。塞德霍尔姆-威廉的PCT专利(W094/00566-10，1994年1月)中说明了一种经过改进的血纤蛋白胶，其中，凝血酶组分与源自于同一个供体的血浆的纤维蛋白原组分结合，该凝血酶组分需要经过十三个步骤来制备，包括离心处理、中间析出物的分离、以及血液离子浓度和血浆pH值的调节。但是，这么多的制备步骤太耗费时间，因而在处理时间应短于一小时的围术期室中变得不实用。
三年后，在1997年，赫什等人(美国专利5,643,192)继承塞德霍尔姆-威廉的理念，揭示了准备血纤蛋白胶的另一种方法，其中，血纤蛋白胶的纤维蛋白原和凝血酶组分都源自于同一个供体的血浆。赫什的专利说明了一种制备凝血酶的方法，其中，首先沉淀并去除血浆中的大部分纤维蛋白原，以制备上清液，然后，使上清液中的剩余纤维蛋白原块凝。该方法不同于塞德霍尔姆-威廉揭示的方法，并且比塞德霍尔姆-威廉的方法更简单，但是未能形成可商用的凝血酶，因为凝血酶仅能在4分钟内维持五秒或短于五秒的块凝速度，并且仅能在47分钟内维持短于10秒的块凝速度。
这种块凝速度不能满足外科医生的需求，外科医生无法在赫什等人的血纤蛋白胶的限制内规划其整个外科手术。
外科医生主要要求快速块凝时间(<5秒)，以实现止血和组织封合或粘合。慢速块凝生物胶(>5秒)常常会被渗血或流血从创口处冲走，来不及发挥作用。利用赫什血纤蛋白胶的外科医生需要安排其外科手术，使得采用赫什血纤蛋白胶处理的止血和组织封合能在块凝速度短于5秒的4分钟时间窗口内实现，这对于需要在手术时间可能长达六个小时的外科手术中进行快速止血和组织粘合的大多数外科医生来说，赫什的发明完全不实用。
斯滕伯格在《Br J ExpPathol.(病理学期刊)》的1947年6月刊28(3):168-177页上揭示了乙醇可用于稳定血浆中的凝血酶活性，该文献的完整内容通过引用结合于此。科埃略等人在美国专利7,056,722中揭示了一种使用乙醇作为凝血酶稳定剂从供体的血液制备稳定的人凝血酶的简单、实用、快速的方法。该方法通过添加8％至18％浓度的乙醇实现了在很长的外科手术中(例如六个小时)稳定的快速块凝(短于5秒)。科埃略等人还说明了使用乙醇从未经过稳定化的血液制备凝血酶的装置对于很广泛的使用凝血酶的外科手术范围完全不实用。这些发明人不得不确定一个很窄的乙醇浓度范围，该乙醇浓度足够低，以避免凝血级联的抑制，从而避免妨碍凝血酶的产生，但是该乙醇浓度也要足够高，以便稳定凝血酶。
库马尔等人在JECT 2005；37:390-395和JECT 2007；39:18-23中揭示了向枸橼酸钠血浆添加钙离子是使凝血酶开始产生的最简单途径，该文献的完整内容通过引用结合于此。此时，过量的钙会使凝血级联开始发生，并开始产生凝血酶。库马尔还说明了，这个过程的缺点是，在产生的凝血酶中，凝血酶活性的稳定时间很短，由于S蛋白、C蛋白和抗凝血酶III对凝学级联的抑制作用，凝血酶的活性通常在凝血酶产生后20分钟内降低至不起作用的状态。库马尔等人还揭示了绕过这些限制的一种方法和装置，其中，当使用乙醇对抑制酶进行部分地钝化时，能够产生稳定的凝血酶产物。为了浓缩和活化凝血酶，在存在带负电荷的表面的条件下，向枸橼酸钠抗凝血浆添加氯化钙和乙醇的混合物。带负电荷的表面开始形成凝血酶原-FV-FXa复合物，而氯化钙和乙醇的混合物(凝血酶剂)提供钝化凝血酶抑制剂和部分地稳定凝血酶的化学组分，从而使凝血酶能够在产生后有效数小时。库马尔和查普曼在JECT 2007；39:18-23中还揭示了一种在30分钟周期内从作为起动源生物液的全血而不是血浆来产生自体同源的人凝血酶的方法，但是，像许多其它的现有技术一样，该方法仍利用乙醇作为添加剂来稳定凝血酶产物，然而，即使在4℃存储温度下，这种凝血酶的活性也会随时间不断降低。
科埃略等人在美国专利7,056,722中揭示的和库马尔所揭示的凝血酶血清/乙醇制剂与森普尔等人在J Oral Maxillofacial Surg 66:632-638,2008(其完整内容通过引用结合于此)中揭示的制剂不是生物相容的溶液。这种制剂是有细胞毒性的，除非其在施用前被充分地稀释至小于4％的最终乙醇浓度。
在美国专利公开文件2004/0120942中，麦金尼斯等人也揭示了使用乙醇作为凝血酶稳定剂的方法，该文献的完整内容通过引用结合于此。麦金尼斯等人还揭示了一种使用“接触活化剂”的方法，该接触活化剂指在内源性凝血途径中涉及的药剂，并且包括但不局限于玻璃、玻璃珠、硅藻土、陶瓷、高岭土、以及它们的任何组合。
在美国专利公开文件2009/0044852(其完整内容通过引用结合于此)中，卡纳因科等人揭示了：使凝血酶组分与稳定剂接触，以形成稳定寿命超过约10小时的凝血酶组分，其中，该稳定剂包括8％至25％浓度范围的乙醇、多元醇、PEG、硫酸铵、非极性溶剂、极性溶剂、甲基异丁基酮醇、乙二醇、三氯乙酸、乙酸盐或它们的任何组合。虽然此系统确实能提供更长寿命的凝血酶产生组分，但是由于稳定剂的存在，会使生物相容性复杂化。
在2000年12月12日公布的美国专利6,159,232、2002年11月12日公布的美国专利6,478,808、2002年11月19日公布的美国专利6,482,223、以及2006年1月4日公布的美国专利6,989,022和2006年8月10日公布的美国专利公开文件2006/0178610中(这些文献的完整内容通过引用结合于此)，诺瓦科夫斯基揭示了一种创口封合方法和装置，其中，当血液处于体外并处于基本上封闭的无菌容器中时，首先开始血液的凝学级联。凝血级联启动装置可包括促凝剂(能够使血液形成为凝块的组分)、大致中和抗凝血剂的机制(例如向血液添加液体硫酸鱼精蛋白，以抑制肝素抗凝血剂)、或大致中和抗块凝剂的机制(抗块凝抑制剂的例子有抗血纤溶环酸和血纤蛋白溶酶原粘结物质)。然后，在持续发生块凝的创口周围堆积块凝活化血液。
近来，业界研究了凝血酶除了在块凝过程中的关键角色之外的重要作用。在《J Cell Physiol(细胞生理学)》2009；219(3):744-751中(其完整内容通过引用结合于此)，巴氏等人声称，凝血酶除了通过把纤维蛋白原解理为血纤蛋白在血块形成过程中扮演着核心角色外，还有与炎症、过敏、肿瘤生长、转移病变、细胞凋亡、以及组织重塑相关的多种生物活性。在许多情况中，凝血酶的调节各种细胞功能的能力是通过与特定细胞表面受体的相互作用实现的。所有已知的凝血酶受体都属于蛋白酶活化受体(PAR)族系，其特征是具有特殊的蛋白酶活化机制。当凝血酶解理接触系锁配体的受体的胞外域时，发生受体活化。具体而言，在PAR族系的受体之中，凝血酶可与PAR-1、PAR-3和PAR-4相互作用。另外，对于某些细胞，凝血酶还是强大的有丝分裂促进剂。
虽然业界已取得了上述的进展，但是在医护场所仍缺少制备单供体凝血酶血清的理想方法。理想的凝血酶制备装置和方法必须可在人体内安全使用，因此必须源自于病人的自有血液，而且不应需要利用乙醇等有细胞毒性的添加剂来克服凝血酶稳定性的问题。
上述的现有技术说明反映了申请人对当前技术的了解，包含在此的目的是表明申请人已履行揭示相关现有技术的既定义务。但是，应说明的是，这些参考文献之中的任何一个的教导或它们的任何可设想的组合都不会使下文中更详细说明的和在权利要求中具体主张的本发明显而易见。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备凝血酶血清的新型改进方法和装置。对所属技术领域的专业人员来说，通过阅读说明书和所附的权利要求，能够更清晰地理解本发明的其它目的和优点。本发明更好地满足了对于在医护场所从单个供体的血液制备安全有效的医用凝血酶血清的简单、实用、快速的方法的需求。本发明揭示一种制备凝血酶血清的方法和装置，其中，可根据治疗医师的需求以快速、可重复的方式从血液制备凝血酶血清。本发明揭示了一种从血液获得凝血酶血清的两阶段方法。在第一阶段中，通过在促凝剂表面上获得凝血酶原酶复合物而把促凝剂转化为活化促凝剂。该凝血酶原酶复合物源自于血液中存在的凝血蛋白。在第二阶段中(此步骤可根据操作人员的需求即刻执行)，通过使活化促凝剂与包含凝血蛋白(包括凝血酶原)的生物液接触而从凝血酶原获得凝血酶。由于这些凝血途径的反应依赖钙，因此必须向反应混合物添加适当浓度的钙离子。本发明还揭示了一种用于盛装反应混合物的装置以及一种用于添加和抽取输送流体的构件。
就本发明之目的来说，促凝剂是能够把血液系统的凝血级联活化到至少能够产生凝血酶的程度的物质，该促凝剂优选是能够把血液系统的凝血级联活化到能够获得血纤蛋白的程度的物质(图1)。使优选的促凝剂与血液接触，从而具有很大的表面面积，此过程最好使用粒径小于5毫米的促凝剂微粒或多孔颗粒来完成。活化步骤是通过在有游离钙离子存在的条件下使促凝剂与第一份血液(first blood fluid aliquot)接触而完成的。虽然不应被理论所局限，但是业界普遍认为，在分子水平上，所述装置的第一阶段活化是由于在促凝剂的表面上产生亚稳定型的凝血酶原酶复合物。在使用血液时，所述装置的活化仅需要五至十分钟。活化状态以较高的水平维持至少十小时，然后在二十四小时内逐渐衰退到无效水平。活化状态的这种维持时间归因于具有这种功能稳定性持续时间的凝血酶原酶复合物，考虑到凝血级联的其它成分的半寿命期都很短以避免过度块凝，这种功能稳定性持续时间即是令人惊讶的，也是不可预测的。十小时促凝剂活化维持时间是很幸运的，因为它比大多数外科手术的时间都长。在活化后，该装置可立即用于从添加至该装置的第二份血液(second blood fluid aliquot)快速制备(例如，约1分钟)可医用量的凝血酶。能够快速产生凝血酶归因于在促凝剂的很大表面面积上形成的大量凝血酶原酶复合物对凝血酶原向凝血酶转化的催化作用。由于凝血酶原酶复合物的反应动力学与凝血酶和抗凝血酶III形成不活跃复合物的反应动力学的差异，凝血酶的形成速度远远超过抗凝血酶III等凝血酶中和剂中和凝血酶的速度。凝血酶产生和凝血酶中和之间的动力学差异产生了能够获得可临床使用的凝血酶量的时间窗口。能够达到的凝血酶产生速度越快(例如，形成的凝血酶原酶复合物越多)，则可临床使用的凝血酶量在凝血酶血清中存留的持续时间就越长。而且，通过实验得知，凝血酶和抗凝血酶III的反应动力学比凝血酶产生的反应动力学对温度更敏感(在温度低于10℃时会被抑制)，因此，若使用冷冻的血液制品，则能够储存更多可用的凝血酶量，并且通过冷藏能够显著延长形成的凝血酶血清的可用储存寿命。因此，本发明支持根据手术人员的需求从病人的自有血液快速产生生物相容的凝血酶血清。本发明还揭示了一种重复使用所述装置的方式，即，可以按相同的方式向同一个装置添加第二、第三、第四份血液，等等，以产生更多份凝血酶血清。而且，本发明还揭示了：每次使用所述装置制备凝血酶血清时，都会使促凝剂的活化状态延续另外十个小时，从而支持操作人员从单个设备连续不断地快速产生凝血酶。通过支持在医护场所使用病人的自有血液产生大量凝血酶，本发明的另一个有益方面是其经济价值和节省成本的潜力。
血浆是血液的非细胞性成分，它包含大量蛋白，包括凝血级联蛋白和血纤蛋白原。当血纤蛋白原在凝血酶的作用下被转化为血纤蛋白时，血浆中的血纤蛋白原浓度会显著降低，此时血浆被称为血清，而不再是血浆。就本发明之目的来说，凝血酶血清是用于描述含有可检测的把血纤蛋白原转化为血纤蛋白的凝血酶块凝活性的任何生物液的一个术语，此术语中不考虑该生物液的细胞性成分。就本发明之目的来说，血液在此是用于描述源自于具有在凝血级联活化时能产生凝血酶原酶复合物的功能容量的供体的生物液的一个术语，该生物液可选自全血、柠檬酸盐抗凝全血或血浆、或具有凝血酶原成分的任何其它适当的血液成分、血浆(包括富血小板血浆、富血沉棕黄层血浆、贫血小板血浆)、全骨髓、柠檬酸盐抗凝骨髓、全脐带血、柠檬酸盐抗凝骨髓、以及任何其它的能够发生凝血级联的血液制剂。而且，本发明还揭示了不同的血液可在同一个装置中使用。在本发明中，通过非限定性的例子说明，促凝剂的第一活化阶段可通过向装置添加全血来完成，对于产生凝血酶血清的第二阶段，所用的血液可以是不同的血液，例如富血小板血浆。
在下文中更详细地说明和在权利要求中具体主张的本发明是通过一系列意外、不可预测和令人惊讶的实验观测所发现的，包括以下发现：1)在所述装置中，在血液、钙与促凝剂混合的最初数分钟内，凝血酶原酶复合物在优选的促凝剂的很大表面面积上形成，凝血酶原酶复合物在形成后保持持续的酶活性功能状态，在至少六个小时(但不超过二十四小时)的可临床使用时间内，能够促进凝血酶原向凝血酶的快速转化，从而支持“按需地”从储存的活化装置制备凝血酶；2)在凝血酶原血源与活化促凝剂接触时，在数秒内而不是数分钟内就能极快速地大量产生凝血酶，从而支持比以前(例如1分钟培育时间)更快的速度可靠地到达可临床使用的凝血酶浓度，因而支持“按需地”从储存的活化装置制备凝血酶；3)在低于10℃的温度下储存收获的凝血酶血清能够显著提高凝血酶的稳定性，而无需像库马尔等人在2007年揭示的那样需要有乙醇作为稳定剂，这进一步使“按需地”制备生物相容的凝血酶血清的方法具有实用性；4)可重复使用单个装置产生多批凝血酶，并且，每次产生凝血酶时，还能使装置内的促凝剂药剂保持活化状态至少另外10个小时，这进一步支持使用单个装置从单个供体产生大量新鲜凝血酶的商用可行性；5)不再像现有技术揭示的那样需要血液中存在乙醇才能制备单供体凝血酶，这样，能够支持更快速地活化促凝剂，从而仅需要10分钟就能获得产生可临床使用的凝血酶的能力，而不是像现有技术揭示的那样在向血液添加乙醇的情况下需要30至60分钟才能获得这种能力，因而能够更快速地向病人提供单供体凝血酶；10)在促凝剂的第一活化阶段完成后可添加乙醇，通过这种方式，仍然可采用向血液添加18％至25％浓度(体积百分比)的乙醇的方法，以稳定凝血酶，从而改进了现有技术，即，在现有技术中，由于乙醇必须以精确的浓度存在以避免凝血级联弱化(乙醇浓度过高)或无法稳定凝血酶(乙醇浓度不足)，因此凝血酶的产生速度很慢并且不可靠。
本发明揭示了一种重复使用和储存已在有钙离子存在的条件下通过与第一份血液接触被活化的单个装置的方法，该方法能够极大地加速凝血酶的获得和增加凝血酶的数量，所述凝血酶包含在按需地在10小时内通过与附加的一份或多份血液接触而制备的一份或多份凝血酶制剂中。由本发明产生的暂时稳定的凝血酶在制备时不采用凝血酶稳定添加剂。相应地，本发明的优选实施例揭示了一种按需地从血液产生可临床使用的凝血酶制剂的实用方法，从而改善或克服了现有技术的一个或多个严重缺点，所述血液选自包括血、单供体全血、血浆、混合血浆、富血小板血浆、贫血小板血浆、或全血成分，包括具有完好的凝血级联的血浆(在此称为血液)。在使用本发明制备凝血酶时，可在控制、效能、可靠性、安全性和性价比方面实现显著改善。具体而言，本发明所揭示的方法和装置支持在很长的外科手术时间内利用单个装置快速、可复现、可重复和有计划地从随时可用的生物液制备大量可临床使用的凝血酶制剂，以实现止血，促进伤口愈合，或提供细胞成分，该制备过程能够由普通技术人员轻松进行。本发明还提供一种执行上述方法的装置，从而提供一种可方便地实施上述方法的凝血酶血清制备方式。
所述促凝剂优选选自与功能性凝血酶原酶复合物相关的并且被定义为活化促凝剂的玻璃、玻璃珠、玻璃纤维、陶瓷、鞣花酸和硅藻土等，但不局限于这些物质。优选的促凝剂是粒径在50微米和2毫米之间的硼硅酸盐玻璃珠，它们易于容纳在反应室中，并且可通过所属领域的技术人员所熟知的构造(例如滤网、深层滤芯等)使血细胞(约6-10微米直径)穿过。为促凝剂提供较大的表面面积、使其平铺在反应室的底部上比较有利。在反应室中布置具有较大直径和较大质量的其它分散的物体尤其有利，这些物体可用于通过物理搅动(例如手工地摇动所述装置)来磨碎已形成的血纤蛋白胶。例如，适当的分散物体可以是由可医用的材料制成的用于与血液接触的粒径为6至8毫米的珠子，例如玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚乙烯，当然，可以理解的是，也可利用其它构造来磨碎已形成的血纤蛋白胶。所述装置的所有部分优选是与人类使用生物相容的，并且能够承受通过一种或多种已知的消毒方法进行消毒，包括射线照射、电子束照射、或者不太推荐的环氧乙烷气消毒。
虽然在反应混合物中存在凝血酶原酶复合物抑制物质(抗凝血酶III和活化C蛋白和S蛋白)以及大量的其它吸附性蛋白，例如白蛋白和免疫球蛋白，但是出乎意料并且令人惊讶的是，凝血酶原酶复合物在很长的一段时间内保持足够的稳定性。但是，这种增强的凝血酶产生化学作用不是永久的，在室温下储存24小时后会失效。值得注意的是，延长稳定性的原因是未知的，并且大多数凝血蛋白因凝血系统的相互制衡而失效的速度出奇的快，因此没有科学证据可支持所属领域的技术人员在不经实验的情况下就能预见到可发现这种稳定性时间。所属领域的技术人员不能预见到可实现至少10小时但短于24小时的稳定性。
本发明提供一种易用、手持型、廉价和可靠的装置，该装置可用于在医护场所优选利用单供体或优选利用自体同源的血源工作(参见图4-6)。
本发明为医师提供了一种与现有凝血酶产品相比对凝血酶制剂的受体更安全的凝血酶制剂。提高安全性的第一个手段是，本发明通过避免添加作为稳定剂的化学掺杂剂(例如有细胞毒性浓度的乙醇)降低了与现有凝血酶制剂有关的危险。不具有这种化学添加剂特别有价值，因为它消除了在向受体输送凝血酶制剂时化学中毒反应的危险。提高安全性的第二个手段是，本发明所述的凝血酶制剂不是像牛凝血酶或转基因鼠类细胞系列产品那样源自于异类生物，从而避免了病原体传播和免疫原性反应的危险。提高安全性的第三个手段是，本发明使得凝血酶制剂源自于单个供体，而不是像目前的惯例那样源自于数百或数千供体的混合血浆，从而降低了混合制品中残存的传染性疾病传播的危险。提高安全性的第四个手段是，凝血酶的制备非常简单且快速，完全可以在医护场所制备，从而支持使用病人的自有血液制备凝血酶。自体同源的血液制品被广泛认可为最安全的生物制剂。提高安全性的第五个手段是，本发明的方法和装置非常简单，完全可以在手术室的无菌现场使用，避免了把材料转出无菌现场然后在转回无菌现场的要求，从而避免了增加无菌现场的微生物污染危险，并且最终避免了增加病人受到医院感染的危险。
已知的是，按照本发明的方法产生的凝血酶也可用于常规的凝血酶治疗应用，并且，哈姆等人最近在《Journal of Blood Medicine(血液医学杂志)》的2010:1135-142中对此进行了考查，该参考文献的完整内容通过引用结合于此。本发明提供一种产生凝血酶制剂的方法，所产生的凝血酶制剂在使用时具有足够的凝血酶浓度，对于从血纤蛋白原产生血纤蛋白的预定目的很有效。本发明特别适合于产生用于输送细胞(例如血小板和干细胞)的血纤蛋白胶。根据Akingboye等人在2010年3月刊的AA,J Extra CorporTechnol的42(1):20-9页上发布的最近考查内容，向富血小板血浆添加凝血酶制剂以形成富血小板凝胶在医疗行业中应用很广泛。
本发明所说明的用于产生所揭示的凝血酶制剂的方法和材料都很实用，因为它们可快速、可靠、方便地使用，可用于各种不同的环境中，包括手术室、医护场所、或实验室环境等，或者，它们可由具有不同水平的技能的用户和手术室护士使用。而且，该装置和方法能够最大限度缩短上手时间，并把整个操作过程的总时间缩短到10分钟左右，这短于现用的任何方法所需的时间。该方法不需要使用机电装置(例如离心机或加热器)来制备凝血酶血清。
诺瓦科夫斯基、科埃略、库马尔提出的技术以及其余现有技术没有单独地或相互结合地揭示、推荐或启发出：1)本发明所揭示的制造凝血酶血清的两阶段过程；2)通过储存活化促凝剂来克服凝血酶血清不稳定性的实用方法；3)重复使用活化促凝剂从单个设备制备多批凝血酶血清的方法；或4)包含用于磨碎在反应室中形成的血纤蛋白胶的构件，以便使用分散的物体从血纤蛋白胶释出凝血酶血清。
考虑到现有技术的缺陷，本发明之主要目的是，通过简单到可由医务人员(例如医护场所的手术护士)操作的过程，按需从单个供体的血液提供生物相容的凝血酶，并且不需要使用有细胞毒性的凝血酶稳定化学药剂。
本发明之另一个目的是提供一种制备凝血酶血清的实用方法，该方法的最短处理时间为10分钟左右。
本发明之再一个目的是提供一种生物相容的凝血酶血清，该凝血酶血清能在短于10秒的时间内实现块凝。
本发明之另一个目的是提供一种可单独地或与血纤蛋白原源液一起通过很小的管口喷出或通过细管输送的凝血酶。
本发明之另一个目的是提供一种制备生物相容的凝血酶的方法，该方法包括：获得第一份血液；向第一份血液添加足量的氯化钙(CaCl2)以再次钙化血液，添加促凝剂，并形成第一混合物，该形成步骤包括：短暂地搅动第一组分，使其混合；储存第一组分至少10分钟左右，但短于六个小时；储存所述第一混合物一段时间，直到预计该凝血酶血清可以使用；获得第二份血液；向第二份血液添加足量的氯化钙(CaCl2)以再次钙化血液，向储存的第一混合物添加第二份含氯化钙(CaCl2)的血液，以产生第二混合物组分；短暂地搅动第二混合物组分，使其混合；培育第二组分，直到形成血纤蛋白胶，磨碎血纤蛋白胶以释出凝血酶血清；以及，过滤凝血酶血清以去除颗粒，从而使凝血酶通过滤膜，该滤膜的孔径足以使流体向凝血酶血清流动，但能防止促凝剂透过(例如,20微米孔径)；在室温下或更优选地在冰水混合物上(<10℃)储存收获的凝血酶血清，并最终使凝血酶血清与血纤蛋白原源液接触，以产生血纤蛋白。
本发明之另一个目的是提供一种产生凝血酶血清的方法，该方法适合于把活细胞悬浮液制备为血纤蛋白胶，以便准备组织组织移植，进行细胞培养，进行诊断性试验、或者用于利用血纤蛋白粘合剂组合细胞和组织技术领域中的其它目的。在准备活细胞复合物移植时，为了保持血纤蛋白移植物中的细胞的活性，使用生物相容的凝血酶特别重要。
本发明之另一个目的是提供一种装置，该装置可重复用于多次提取凝血酶血清，而无需活化。在上一次向该装置添加一份血液后的10小时内，通过向该装置添加第三、第四、第五份血液或更多份血液可实现上述目的。若使用柠檬酸钠等钙螯合剂作为抗凝血剂，则每份血液应使用氯化钙(CaCl2)溶液处理，以再次钙化血液。本发明不适合于与已使用肝素进行抗凝的血液，除非采用由诺瓦科夫斯基揭示的步骤从血液去除肝素。
本发明通过克服本领域中其它发明成果所示的限制提供了一种产生医用凝血酶的改进方法。本发明提供的凝血酶的浓度使其在冗长的外科手术中(例如，十个小时)当根据需要与血纤蛋白原源液结合时能实现快速块凝(<5至10秒)。本领域的以前成果(希尔施等人)以实例说明了凝血酶的稳定性非常低，因而凝血酶只能在极短的四至五分钟时间内实现血纤蛋白原的快速块凝(即，短于5秒)的问题，或者需要太多的制备步骤和时间，因而不适合于围术期制备的问题，这两个问题都使得该技术对于很宽范围的外科手术完全不实用。本领域中以前的努力(例如，科埃略等人)曾尝试通过添加乙醇作为凝血酶化学稳定剂的方法来克服凝血酶血清的稳定性非常短的限制，但是由于需要达到细胞毒性浓度的乙醇来改善凝血酶的稳定性，因此这样做会带来新的生物相容性问题。
相应地，在本发明中以更完美的方式解决了凝血酶不稳定性的问题。通过产生一个两阶段过程，可以制备并储存活化促凝剂，直至到达需要使用凝血酶血清的时间，通过这样的方式，延缓了凝血酶血清的制备，从而克服的众所周知的凝血酶暂态稳定性的问题。当在室温下储存从活化装置收获的凝血酶制剂时，该凝血酶制剂能保持其快速块凝能力至少15分钟，当在低于10℃的温度下储存时，该凝血酶制剂能保持其快速块凝能力至少1小时，而无需化学添加剂。通过储存活化装置而不是储存由科埃略、库马尔和其他人的现有技术揭示的用乙醇稳定的凝血酶血清，本发明提供了在医护场所从单个供体更快速地提供可临床使用的凝血酶血清制剂的方法，该凝血酶血清制剂具有快速的块凝速度(例如，短于10秒)，并且是生物相容的。
附图说明
通过参考下文中参照附图做出的详细说明，能够更好地理解本发明的上述方面和许多附带优点，在附图中：
图1是现有技术中已知的凝血级联的概图；
图2是详细说明本发明的优选实施例中的方法的一个流程图；
图3是详细说明本发明的优选实施例中的方法的一个流程图；
图4a是本发明的一个实施例的反应室顶盖的一个实施例；
图4b是本发明的一个实施例的反应室顶盖和反应室的俯视图；
图4c是本发明的一个实施例的反应室顶盖和反应室的侧视图；
图4d是本发明的一个实施例的反应室顶盖和反应室的分解透视图；
图5是示例性的已组装好的反应室及用于收获凝血酶血清的布置的示意图；
图6是示例性的反应室及与该示例性反应室结合使用以收获凝血酶血清的注射器的示意图；
图6A是现有技术的用于输送收获的凝血酶以便在需要位置形成血纤蛋白的喷嘴施用器的示意图；
图7是从本发明的一个实施例的示例性反应室收获凝血酶血清的示意图；以及
图8示出了形成的血纤蛋白胶具有支撑其自重的足够强度。
具体实施方式
以下说明之目的是使所属领域的普通技术人员能够产生和使用本发明的各个方面和例子。具体材料、技术和应用的说明仅是示例性的。对于所属领域的普通技术人员来说，显而易见的是，能够对本文所述的例子做出各种修改，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，在此规定的总体原则也适用于其它例子和应用。因此，本发明不限于所述和所示的例子，其范围仅由所附的权利要求限定。
首先请参考图2，本发明的优选实施例中的过程包括四个步骤，这些步骤优选按顺序发生：1)通过结合在有游离钙离子存在的条件下具有凝血级联能力的第一份生物液并对其培育约10分钟来制备活化促凝剂；2)然后，可把该活化促凝剂储存最长约10小时；3)在从添加第一份血液算起的大约1分钟至10小时范围内，当预计需要使用凝血酶时(预定的凝血酶使用)，向该活化促凝剂添加另外一份生物液和游离Ca++离子；以及4)磨碎随后形成的血纤蛋白胶，以释出凝血酶血清，然后可以收获该凝血酶血清。可以把该凝血酶用于血纤蛋白原源液，以产生血纤蛋白。该凝血酶可作为独立使用的液体以外用方式使用，以喷雾方式使用，或者与另一种载剂(例如可吸收止血剂，包括海绵胶、氧化再生纤维素、以及微纤维胶原)一起使用，或与血纤蛋白原结合以产生“胶体”或“凝胶”。
对于这种应用，应注意的是，“活化”促凝剂与促凝剂是不一样的。与未活化的促凝剂相比，活化促凝剂能使血浆以快得多的速度发生胶凝。在一种识别方案中，可通过比较两种促凝剂样品使含有作为抗凝血剂的柠檬酸盐的新鲜冰冻血浆发生胶凝所需的时间来识别活化促凝剂，其中，血浆已在其预定使用前两小时内解冻。具体而言，在第一个12毫米×75毫米聚苯乙烯试管中，加入已经与血液接触过的0.5克促凝剂。在第二个相似试管中，加入未与血液接触的相同促凝剂，作为控制样品。向每个试管加入含有作为抗凝血剂的柠檬酸盐的已解冻新鲜冰冻血浆(血浆已在其预定使用前两小时内解冻)，并把添加时间记为零时。记录每个试管中的液体血浆转变为凝胶所需的时间，若被测促凝剂使血浆发生胶凝所需的时间是控制促凝剂使血浆发生胶凝的时间的两倍或更多，则被测促凝剂可确定为活化促凝剂。若被测促凝剂使血浆发生胶凝所需的时间与控制促凝剂使血浆发生胶凝的时间相比不到两倍，则被测促凝剂可确定为不是活化促凝剂。
现在回到本发明的优选实施例，还应注意的是，收获的凝血酶仅是短暂稳定的，可在室温下存储的30分钟内添加至血纤蛋白原源液，以形成血纤蛋白。若需要快速形成血纤蛋白(快速块凝时间)，则优选在15分钟内使血纤蛋白原与收获的凝血酶接触，更优选的是在收获凝血酶以后之后立即接触(在5分钟内)。若推迟凝血酶的预定使用时间，则可被凝血酶放在冰上储存(<10℃)，这会显著增强凝血酶的稳定，从而可在3小时内使用，更优选的是在60分钟内使用。
使用含有多孔膜(例如，20至80微米孔径)的过滤器对凝血酶溶液进行过滤可保留促凝剂并去除血纤蛋白颗粒物质，否则的话，血纤蛋白颗粒物质可能妨碍凝血酶从小喷嘴喷出，或者妨碍使用如图6A所示的装置使凝血酶通过细管输送到创口处。图6A是现有技术的一种喷嘴施用器的示意图，其中，一个注射器充有血纤蛋白原源液，另一个注射器充有凝血酶血清，两个注射器内的液体在通过喷雾元件喷射的同时彼此混合，产生气溶胶喷雾，这会使混合物以液体形式输送，由于血纤蛋白的形成，并且血纤蛋白起着密封剂的作用，该液体会迅速变为固体。
现在请看图4A至图4D，其中示出了本发明的一个方面。图4A至图4C示出了用于实践所述方法的装置的不同视图。该装置包括封装反应室2的壳体1。反应室2优选为圆筒形腔室，具有宽端2a和窄端2b。宽端2a具有护帽结构3，该护帽结构3配置为压入配合在宽端2a的开口中。窄端2b配置为接收接头4。现在请参考图4D，它是本发明的一个实施例的护帽结构3和接头4的部件分解图。窄端2b配置为形成喷嘴状结构2c，该喷嘴状结构2c连接至接头4(参见图4A至图4C)。接头4包括双鲁尔接口内螺纹接头5。双鲁尔接口内螺纹接头5具有第一端5a和第二端5b。第一端5a适合于配装到喷嘴状结构2c中。第二端5b适合于接收无针入口孔6的第一端6a。无针入口孔6的第二端6b配置为形成螺纹结构6b。无针入口孔6的螺纹结构6b连接至护帽7。护帽7能防止无针入口孔6被污染。护帽结构3包括密封件8。密封件8为环状构造，内圈8a配置为收纳到护帽9中，外圈8b配置为适贴配合到容器2的宽端2a中。护帽9具有凹部9a，该凹部9a配置为接收并保持滤膜10。滤膜10通过挡环11被保持在护帽9的凹部9a中。
在此所述的装置包括无菌的无热源液路容器，该容器具有引入、盛装和排空流体的构件，并且不会发生泄漏，优选能防止流体与室内空气直接接触，从而降低微生物污染的危险，该容器还作为用于活化凝血级联的反应室，反应室盛有足够数量的促凝剂，并具有能够高效地活化待使用的生物液中的凝血级联的表面面积，反应室还具有能够在每个培育步骤中使促凝剂与生物液密切接触的形状，并包括磨碎形成在其中的血纤蛋白胶的构件(优选通过盛有质量比促凝剂大的较大分散物体来实现)，反应容器在腔室内具有足够的内表面积，从而当操作人员对反应室进行机械搅动(例如摇动)时，较大的分散物体会运动，并磨碎较小的促凝剂颗粒周围的血纤蛋白胶。容器的容积优选至少为生物液、促凝剂和分散的大物体的总体积的两倍。在研磨凝胶时，较大的分散物体在反应室内的运动会产生可听到的声音，从而向操作人员警示已完成研磨。较大的分散物体由医用级塑料小球或玻璃珠构成。这种较大的分散物体的优选形状为球形，其优选粒径为5至15毫米，并由医用级塑料或玻璃制成。反应室优选提供用于引入钙离子溶液的构件，其引入量优选小于预定的一份血液的体积的10％，并且钙离子源自于氯化钙。需要添加的钙离子的量可由本领域技术人员通过实验确定，但应足够对所述的一份血液进行再钙化，其中，增加的氯化钙的最终浓度是5至30mM，更优选的是10至20mM。钙可在可切换阀门后的液路中的任何位置添加，因为注入系统的血浆会把钙携带至反应室。下文中更详细地说明的一个不太优选但很有用的例子表明，可在旋塞阀和单向鸭嘴阀之间的位置添加干钙。
下面详细说明本发明的一个优选实施例中用于从人血浆制备凝血酶血清的一种示例性方法。
用于实践所述方法的一个示例性装置在图5中示出。在此示例性实施例中，该装置包括盛有促凝剂12的反应室2。反应室2还盛有用于磨碎血纤蛋白胶的分散球体13。提供一个包括流量控制手柄14A的四通旋塞阀14，用于控制流体从反应室2流出和向反应室2流入。单向鸭嘴阀15连接至反应室2，防止流体从反应室2流出。在四通旋塞阀14的一端连接有过滤罩16，过滤罩16包含孔径为20微米左右的滤膜，用于留住颗粒物质，包括促凝剂和血纤蛋白颗粒。该装置还包括可切换的单向无针入口孔17，用于避免在向反应室2输送流体和从反应室2排出流体的过程中防止与室内空气接触，以提高装置的微生物安全性。
反应室的准备：虽然可以使用各种适当的容器，但是在此示例性实施例中，一个60毫升注射器提供了方便的原型反应室2。反应室2可通过去除注射器柱塞并添加作为促凝剂12的玻璃珠来准备。在此示例性方法中，例如可使用粒径在0.5毫米和5毫米之间的20克玻璃珠作为促凝剂12。另外，可以向反应室添加7克大聚苯乙烯球(10毫米直径)或其它适当的材料，作为用于磨碎已形成的血纤蛋白胶的固体分散物体13。然后，可以把柱塞推回到注射器上的50毫升标记的位置，以产生足够的空间，使较大的分散珠子13在摇动过程中能够运动，从而打碎(磨碎)已形成的血纤蛋白胶。在产生凝血酶血清的过程中，柱塞不需要移动，可以保持在固定位置。本发明的商用实施方式可使用注塑成型容器作为反应容器，而不是使用注射器。在优选实施例中包括带有手柄14a的四通旋塞阀14，以提供控制流体流入反应室和从反应室流出的方向的手段。旋塞阀14旋至第一位置A，在该位置时，液路始于第一无针入口孔17，通过单向鸭嘴阀15，然后进入反应室2(在此例子中为注射器筒)。图6是示例性的反应室及与该示例性反应室结合使用以收获凝血酶血清的注射器的示意图。在此所述的示例性反应室与其它的注射器19、20和21结合使用，以便输送流体，例如生物液和含钙离子的流体。当旋塞阀处于位置A时，可向装置注入流体。旋塞阀手柄14a可转至第二位置B，在该位置，液路始于第二无针入口孔18，通过过滤器16，然后进入反应室2(在此例子中为注射器筒)。在此旋塞阀手柄位置B时，注射器可附接至第二可切换入口孔，可外抽注射器柱塞，以便产生低压空间或真空，从而使凝血酶血清通过过滤器16从反应室2被抽出，并进入注射器。在本发明的优选实施例中，包括具有多孔膜的过滤器，过滤器的孔径尺寸足够小，能够留住促凝剂(由于太小，无法在此图中示出)和血纤蛋白微粒，但是允许凝血酶血清流过。通过包含用于允许注射器探入该装置的防泄漏、无菌的可切换入口孔，实现了一种封闭系统，从而提高了该装置的微生物安全性。
氯化钙(CaCl 2 )溶液的制备：可通过在200毫升水中溶解15.5克氯化钙来制备354mM六水氯化钙溶液(在此购自密苏里州圣路易斯市Sigma公司，产品编号为21110-1KG-F，批号为#BCBC3343，MW 219.08)。对于每5毫升柠檬酸盐抗凝血液，可添加0.2毫升CaCl2溶液，以便把血液溶液再钙化为大约14mM最终浓度。可使用1毫升注射器通过可切换入口把CaCl2输送到反应室中。或者，在过程开始前，也可在反应室中预先加入干钙，若存在干钙，则无需在此方法的后续步骤中使用液体钙。
血液：例如，可以使用柠檬酸盐抗凝全血或柠檬酸盐抗凝新鲜人血浆作为方便的实验用血液，但不仅限于这些。
凝血酶血清的喷施：在收获凝血酶血清时，可以使用喷嘴施用器来喷施凝血酶血清，使其与作为血纤蛋白原源液的另一份解冻血浆结合，例如，可以使用由明尼苏达州圣保罗市的Micromedics Corp.制造的喷嘴施用器(参见如图6A所示的带有喷嘴SA-3674的Fibrijet混合连接器)。
下面说明本发明的用于产生凝血酶血清的优选过程的一个实施例：
第1步：向按如上所述准备的反应室加入用于第一次培育的反应物：
a.通过无针入口孔把盛有CaCl2溶液的1毫升注射器附接至反应室，并注入0.2毫升，然后拆下注射器。
b.通过无针入口孔把盛有5毫升血浆的5毫升注射器附接至反应室，并向反应室注入全部血浆，然后拆下注射器。
c.使反应室保持在水平位置，充分摇动反应室，使促凝剂和分散的大塑料珠运动，从而使反应室中的物质混合，使促凝剂完全浸湿。
第2步：第一次培育
a.把注射器放在平坦表面上，使促凝剂分布均匀，并开始第一次培育过程，这个过程可能需要大约10分钟至大约10小时。
b.在经过约10分钟后，产生了足够的凝血酶，从而把生物液中的可溶血纤蛋白原转化为不溶性血纤蛋白，因而导致形成第一血纤蛋白胶。通过用肉眼观察混合物丧失流动性，并观察即使当反应室处于竖直位置时促凝剂和塑料珠也在反应壁上结块，能够很明显地发现血纤蛋白胶。
第3步：在需要使用凝血酶血清时，向反应室加入用于第二次培育的反应物。
a.通过无针入口孔把盛有CaCl2溶液的1毫升注射器附接至反应室，并注入0.2毫升，然后拆下注射器。
b.通过无针入口孔把盛有5毫升血浆的5毫升注射器附接至反应室，并向反应室注入全部血浆，然后拆下注射器。
c.使反应室保持在竖直位置，上下猛烈摇动反应室，直到所有珠子在反应室中自由运动(约3至10秒)，从而磨碎第一次形成的血纤蛋白胶，并混合反应室中的物质。
第4步：第二次培育
a.把注射器放在平坦表面上，使玻璃珠分布均匀，并开始第二次培育过程，这个过程可能需要大约1分钟至大约60分钟。在形成第二血纤蛋白胶后，可随时收获凝血酶血清。能够很明显地发现血纤蛋白胶，因为血浆不再是液态，并且珠子稳固地贴到反应容器壁上。此方法产生短暂地稳定的凝血酶制剂，并且血纤蛋白原的凝血酶的块凝活性随血纤蛋白胶的储存时间延长而降低。因此，为了使凝血酶血清中的凝血酶保持最高的活性，优选在形成血纤蛋白胶后就立即按如下所述收获凝血酶血清(例如，在形成第二血纤蛋白胶之后大约15分钟之内进行收获，更优选地是在形成第二血纤蛋白胶之后大约5分钟之内收获，最优选的是在形成第二血纤蛋白胶之后大约1分钟之内收获)。
第5步：使用10毫升注射器收获凝血酶血清
a.在形成第二血纤蛋白胶后，充分搅动反应室，以驱动反应室中的珠子，从而打碎存在的血纤蛋白胶。
b.把具有多孔膜的过滤器附接至与反应室相连的可切换入口，以防止颗粒物质进入10毫升收获注射器。
c.把反应室置于竖直位置，使10毫升注射器在反应室下面，回抽10毫升注射器的柱塞，以便在反应室中产生低压区或真空，直到收获所需数量的凝血酶血清(最多约5毫升)，通过这样的方式来收获凝血酶血清，如图7所示。图7中示出了从示例性反应室2收获凝血酶血清是如下完成的：回抽注射器柱塞21以产生真空，然后等待一段时间，直到所需数量的凝血酶血清被吸出反应室并进入注射器21。
d.收获的血浆可在室温下储存，并可用于在添加第二份血液后15分钟内与血纤蛋白原接触，以形成血纤蛋白，或者，也可以把其放在冰水混合物上储存(<10℃)，并在添加第二份血液后1小时内使其与血纤蛋白原接触，以形成血纤蛋白。
第6步(可选)：如果需要产生更多的凝血酶血清制剂，那么可以使用更多份新鲜血液，并重复第3、4、5步，最多可重复六次。
在下文中综述的实验中，示出了如下的发现：在装置中的血液、钙和促凝剂混合物首次接触的过程中，在促凝剂表面上形成凝血酶原酶复合物，该凝血酶原酶复合物在形成后保持持久的酶活性功能状态，在至少十小时但短于二十四小时的可临床使用时间内能够把凝血酶原快速转化为凝血酶。
在此研究中，按如上所述准备了六个反应室。为此实验采用的有代表性的血液是新鲜血浆。在称为零时的时刻，对于全部六个注射器，按如上所述向反应室添加血浆和钙(第1步)。对于六个注射器中的每一个，改变第一次培育期的持续时间(第2步)，使培育试验条件为0小时、1小时、3小时、10小时、12小时和24小时。在第一次培育时间结束时，按如上所述向反应室添加第二份钙和血浆(第3步)。第二次培育(第4步)的持续时间固定为形成第二血纤蛋白胶所需的时间，并记录该时间。按如上所述收获凝血酶血清(第5步)，在收获凝血酶血清5分钟后，测量凝血酶的活性。在此实验中，凝血酶的活性是通过使用由新泽西州Troy Hills市的DiagnosticaStago Inc.制造的STart止血分析仪记录血纤蛋白原块凝时间来测量的。下表中示出的数据表明，12小时以上的储存时间会使促凝剂活化能力损失，因为血纤蛋白原的块凝时间会随着凝血酶活性的降低而加长，但是，即使在12小时后，活化能力也未完全丧失，与储存24小时后的情况不同。有趣的是，每批制备好的凝血酶都会使促凝剂的活性再延长10小时以上。下表中的数据证明了，在室温下储存时，活化促凝剂的稳定性能至少维持10小时。
表A.储存时间对促凝剂活化能力持续性的影响
根据上述的方法进行了一个实验，以验证可从单个装置多次制备凝血酶血清的概念。在此，使用单个装置按30分钟间隔时间从解冻的新鲜冰冻血浆制备凝血酶血清制剂五次。下表中的数据证明了，可使用单个装置按需地重复产生具有高活性的凝血酶。向反应室添加0.2毫升CaCl2溶液和5毫升刚刚解冻的血浆，并进行培育，直到发生第一次胶凝，通过这种方式活化促凝剂，第一次胶凝需要大约5分钟。此时，促凝剂表面被活化，并可按需地产生凝血酶血清。为了产生凝血酶血清，向反应室再添加0.2毫升氯化钙2溶液和5毫升血浆，并进行培育，直到发生第二次胶凝，第二次胶凝需要大约30秒。在形成凝胶后，保持1分钟左右，然后搅动装置，以打碎凝胶，此时收获约5毫升凝血酶血清。通过进行块凝测试来确定收获的血清的凝血酶活性。在示例性块凝试验中，在1.5毫升埃普多夫试管中，向0.5毫升血纤蛋白原源液(例如血浆)添加0.5毫升凝血酶血清。通过倒置来混合样品，并通过观测来确定溶液变为固体或凝胶所需的时间。数据表明，可以使用单个装置产生至少4批凝血酶血清，每批的量为5毫升。
表B.对使用单个装置制备多批凝血酶血清的验证
还进行了一个实验，以测量根据本发明的揭示制备的凝血酶血清的稳定性。在此，使用单个装置从解冻的新鲜冰冻血浆制备凝血酶血清制剂。向反应室添加0.2毫升CaCl2溶液和5毫升刚刚解冻的血浆，并进行培育，直到发生第一次胶凝，通过这种方式活化促凝剂，第一次胶凝需要大约5分钟。为了产生凝血酶血清，向反应室再添加0.2毫升氯化钙2溶液和5毫升血浆，并进行培育，直到发生第二次胶凝，第二次胶凝需要大约30秒。在形成凝胶后，保持1分钟左右，然后搅动装置，以打碎凝胶，此时收获约5毫升凝血酶血清。然后，在室温下或在低于10℃的温度下储存凝血酶血清制剂，并随后按一定的时间间隔测量凝血酶的活性。通过进行块凝测试来确定收获的血清的凝血酶活性。在30分钟时段内测量了凝血酶血清的块凝时间，以检测其在室温下储存和在低于10℃的温度下储存时的稳定性。在3小时时段内，块凝时间逐渐加长。块凝速度最快的时间(即，最高凝血酶浓度)是在刚刚收获凝血酶血清之后。在制备后前15分钟内，能保持快速块凝活性，块凝时间短于90秒的状态能持续不到30分钟。当在低温下储存凝血酶血清时，在60分钟内，快速块凝活性保持得很好，并且能持续至少三个小时。
现在简单地说明采用干氯化钙(而不是液体钙)的可替代实施方式，在另一个实施例中，可在制造装置时向反应室加入干氯化钙。由于有钙的存在，因此需要与引入的每份血液接触。此实施方式的一个益处是，可以减少操作人员的操作步骤，从而降低出错的危险。
作为这种可代替的干钙实施方式的一个示例，使用单个装置进行了从解冻的新鲜冰冻血浆制备凝血酶血清制剂的实验。通过向盛有促凝剂的反应室加入0.4毫升CaCl2溶液(通过在200毫升无水乙醇中溶解15.5克氯化钙而制成的354mM水合氯化钙)来准备装置。使乙醇蒸发，从而在反应室中留下干钙盐。通过使用5毫升柠檬酸盐抗凝血浆活化促凝剂但不添加氯化钙溶液来使用盛有干钙盐的这个装置制备凝血酶血清。下一步，通过再添加5毫升柠檬酸盐抗凝血浆来使用活化促凝剂制备凝血酶血清。此时，令人惊讶地发现，存在于第一份血浆中的钙的初始浓度(是正常使用浓度的两倍)未能抑制促凝剂的成功形成。当在反应室中干燥的钙量增加至0.8毫升CaCl2溶液(354mM氯化钙)时，观察到活化促凝剂的形成被抑制。
可以把现有技术的使用乙醇来稳定凝血酶的方法与本发明的两阶段凝血酶血清产生方法结合，虽然对于很多应用来说通常不希望这样做。图3示出了本发明在这种实施方式中的过程，其中，这个两阶段过程包括四个步骤，这些步骤优选按顺序发生：1)通过结合在有游离钙离子存在的条件下具有凝血级联能力的第一份生物液并对混合物培育至少10分钟左右来制备活化促凝剂；2)然后，可把该活化促凝剂储存最长约10小时；3)在准备使用凝血酶时，向该活化促凝剂添加另外一份补充有15％至25％乙醇(体积百分比)的生物液和游离Ca++离子；以及4)磨碎随后形成的血纤蛋白胶。然后，可以收获补充有乙醇的凝血酶血清。当在低于10℃的温度下储存时，收获的补充有乙醇的凝血酶具有显著提高的稳定性，并且可用于在添加第二份血液后的10小时内与血纤蛋白原接触，以形成血纤蛋白。不太优选的是，在添加第二份血液后6小时内发生这种接触。下面说明本发明的这种实施方式中用于产生凝血酶血清的过程：
第1步：向按如上所述准备的反应室加入用于第一次培育的反应物：
a.通过无针入口孔把盛有CaCl2溶液的1毫升注射器附接至反应室，并注入0.2毫升，然后拆下注射器。
b.通过无针入口孔把盛有5毫升血浆的5毫升注射器附接至反应室，并向反应室注入全部血浆，然后拆下注射器。
c.使反应室保持在水平位置，充分摇动反应室，使促凝剂和分散的大塑料珠运动，从而使反应室中的物质混合，使促凝剂完全浸湿。
第2步：第一次培育
a.把注射器放在平坦表面上，使促凝剂分布均匀，并开始第一次培育过程，这个过程可能需要大约10分钟至大约10小时。
b.在经过约10分钟后，产生了足够的凝血酶，从而把生物液中的可溶血纤蛋白原转化为不溶性血纤蛋白，因而导致形成第一血纤蛋白胶。通过用肉眼观察混合物丧失流动性，并观察即使当反应室处于竖直位置时促凝剂和塑料珠也在反应壁上结块，能够很明显地发现血纤蛋白胶。
第3步：在需要使用凝血酶血清时，向反应室加入用于第二次培育的反应物。
a.通过无针入口孔把盛有CaCl2溶液的1毫升注射器附接至反应室，并注入0.2毫升，然后拆下注射器。
b.通过无针入口孔把盛有4毫升72％含水乙醇(体积百分比)的5毫升注射器附接至反应室，并把注射器中的物质注入反应室。
c.通过无针入口孔把盛有5毫升血浆的5毫升注射器附接至反应室，并向反应室注入注射器中的全部物质，然后拆下注射器。
d.使反应室保持在竖直位置，上下猛烈摇动反应室，直到所有珠子在反应室中自由运动(约3至10秒)，从而磨碎第一次形成的血纤蛋白胶，并混合反应室中的物质，以便在反应室的流体含量中达到20％左右(体积百分比)的最终乙醇浓度。
第4步：第二次培育
a.把注射器放在平坦表面上，使玻璃珠分布均匀，并开始第二次培育过程，这个过程可能需要大约1分钟至大约6小时。在形成第二血纤蛋白胶后，可随时收获凝血酶血清。能够很明显地发现血纤蛋白胶，因为血浆不再是液态，并且珠子稳固地贴到反应容器壁上。此方法产生短暂地稳定的凝血酶制剂，并且血纤蛋白原的凝血酶的块凝活性随血纤蛋白胶的储存时间延长而降低。因此，为了使凝血酶血清中的凝血酶保持最高的活性，优选在形成血纤蛋白胶后就立即按如下所述收获凝血酶血清(例如，在形成第二血纤蛋白胶之后大约15分钟之内进行收获，更优选地是在形成第二血纤蛋白胶之后大约5分钟之内收获，最优选的是在形成第二血纤蛋白胶之后大约1分钟之内收获)。
第5步：收获凝血酶血清
a.在形成第二血纤蛋白胶后，充分搅动反应室，以逐出反应室中的珠子，并打碎存在的血纤蛋白胶。
b.把具有多孔膜的过滤器附接至与反应室相连的可切换入口，以防止颗粒物质进入10毫升收获注射器。
c.把反应室置于竖直位置，使10毫升注射器在反应室下面，回抽10毫升注射器的柱塞，以便在反应室中产生低压区或真空，直到收获所需数量的凝血酶血清(最多约5毫升)，通过这样的方式来收获凝血酶血清，如图7所示。图7中示出了从示例性反应室2收获凝血酶血清是如下完成的：回抽注射器柱塞21以产生真空，然后等待一段时间，直到所需数量的凝血酶血清被吸出反应室并进入注射器21。
d.收获的血浆可在室温下储存，并可用于在添加第二份血液后4小时内与血纤蛋白原接触，以形成血纤蛋白，或者，也可以把其放在冰水混合物上储存(<10℃)，并在添加第二份血液后6小时内使其与血纤蛋白原接触，以形成血纤蛋白。
第6步(可选)：如果需要产生更多的凝血酶血清制剂，可以使用更多份新鲜血液，并重复第3、4、5步，最多可重复六次。
虽然本发明是通过一些实施例示出和说明的，但是对所述领域的技术人员显而易见的是，通过阅读和理解本说明书，能够做出等效的变更和修改。尤其是，对于由上述部件执行的各种功能，除另有所示外，用于描述这种部件的术语(包括对“构件”的任何引用)意在与执行所述部件的规定功能的任何部件(例如在功能上等效的部件)对应，即使其在结构上与本发明的示例性实施例中所揭示的执行该功能的部件不等效。另外，虽然本发明的具体特征可能是仅参照一种实施方式揭示的，但该特征能够根据需要与其它实施方式的一个或多个其它特征结合，并有利于任何特定或具体应用。

Claims (31)

1.一种制备凝血酶血清的方法，该方法包括以下步骤：
获得活化促凝剂；以及
使所述活化促凝剂与一份血液接触，以形成包含凝血酶血清的混合物；以及
从所述混合物提取所述凝血酶血清。
2.一种制备凝血酶血清的方法，该方法包括以下步骤：
使第一份血液与促凝剂接触，以形成活化促凝剂；
储存所述活化促凝剂；
使第二份血液与储存的所述活化促凝剂接触，以形成包含凝血酶血清的混合物；以及
从所述混合物提取所述凝血酶血清。
3.一种制备凝血酶血清的方法，该方法包括以下步骤：
使第一份血液与促凝剂接触，以形成活化促凝剂，该活化促凝剂包含结合到促凝剂的表面上的凝血酶原酶复合物；
储存所述活化促凝剂；
使储存的所述活化促凝剂与第二份血液接触，以形成包含血纤蛋白胶的混合物；
磨碎所述血纤蛋白胶；
在所述磨碎步骤后，从所述混合物提取凝血酶血清；以及
使提取的所述凝血酶血清与血纤蛋白原接触，以获得血纤蛋白。
4.一种制备乙醇稳定凝血酶血清的方法，该方法包括以下步骤：
使第一份血液与促凝剂接触，以形成活化促凝剂，该活化促凝剂包含处于促凝剂的表面上的凝血酶原酶复合物；
储存所述活化促凝剂；
在所述储存步骤后，使活化促凝剂与含有浓度为大约15％至25％(体积百分比)的乙醇的第二份血液接触，以获得补充有乙醇的凝血酶血清，并形成包含血纤蛋白胶的混合物；
磨碎所述血纤蛋白胶；
在所述磨碎步骤后，从所述混合物提取补充有乙醇的凝血酶血清；以及
使提取的补充有乙醇的凝血酶血清与血纤蛋白原接触，以获得血纤蛋白。
5.如权利要求1、2、3和4中任一项所述的方法，还包括从单个供体获得血液的步骤，其中，前述各份血液是从所述血液提取的。
6.如权利要求5所述的方法，其中，获得的血液是自体同源的血液。
7.如权利要求5所述的方法，其中，所述血液选自由以下物质所构成的组：全血；柠檬酸盐抗凝全血或血浆；包括富血小板血浆、富血沉棕黄层血浆、贫血小板血浆的血浆；全骨髓；柠檬酸盐抗凝骨髓；全脐带血；柠檬酸盐抗凝骨髓；包含凝血酶原的血液组分；以及它们的组合。
8.如权利要求1、2、3和4中任一项所述的方法，其中，前述各份血液经过复钙处理，以包含游离钙离子。
9.如权利要求1、2、3和4中任一项所述的方法，其中，所述促凝剂选自由玻璃、玻璃珠、玻璃棉、高岭土、陶瓷、棉、鞣花酸、以及它们的组合所构成的组。
10.如权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中，凝血酶血清的提取是通过回抽注射器的柱塞来进行的。
11.如权利要求3所述的方法，其中，补充有乙醇的凝血酶血清的提取是通过回抽注射器的柱塞来进行的。
12.如权利要求2、3和4中任一项所述的方法，其中，所述活化促凝剂的储存时间在约1分钟至10小时之间。
13.如权利要求2、3和4中任一项所述的方法，其中，所述活化促凝剂重复地与更多份血液结合使用，以按需地产生凝血酶血清。
14.如权利要求3或4所述的方法，其中，所述血纤蛋白胶的研磨进行一次或多次。
15.如权利要求3或4所述的方法，其中，所述血纤蛋白胶的研磨是通过机械搅动进行的。
16.一种处理血液的装置，该装置包括：
反应室，包括配置为容纳促凝剂和血液并且基本不会发生泄漏的一个或多个隔室，其中，容纳的所述促凝剂配置为与所述血液反应，以形成血纤蛋白胶；
用于向反应室中引入和从反应室中排出流体的构件；
用于留存反应室中的颗粒物质的构件；
用于从血纤蛋白胶分离凝血酶血清的构件；以及
其中，在反应室中有一个或多个固态的分散物体，所述固态的分散物体的大小适合于磨碎血纤蛋白胶。
17.如权利要求16所述的装置，其中，所述固态的分散物体具有至少4毫米的横截面尺寸。
18.如权利要求16所述的装置，其中，反应室是圆筒形瓶，包括由护帽密封的窄端，该护帽包括至少一个卢尔锁构件。
19.如权利要求16所述的装置，其中，用于引入流体的所述构件是接头，一个四通旋塞阀连接置所述接头，并且该四通旋塞阀包括至少两个单向阀。
20.如权利要求16所述的装置，还包括用于留存颗粒物质的过滤器，该过滤器的孔径尺寸比促凝剂的尺寸小。
21.如权利要求20所述的装置，其中，所述过滤器的孔径使其能够留存粒径大于约30微米的颗粒物质。
22.如权利要求16所述的装置，其中，用于引入流体的所述构件具有至少一个用于引入和排出液体的可切换口。
23.如权利要求16所述的装置，还包括配置为避免反应室持续承压的通气孔。
24.如权利要求16所述的装置，其中，反应室是由塑料制成的。
25.如权利要求16所述的装置，其中，反应室是由玻璃制成的。
26.如权利要求16所述的装置，其中，固态的分散物体选自由玻璃物体、金属物体、塑料物体、以及它们的组合构成的组。
27.如权利要求16所述的装置，其中，固态的分散物体不是促凝剂。
28.如权利要求16所述的装置，其中，所述血液选自由以下物质所构成的组：全血；柠檬酸盐抗凝全血或血浆；包括富血小板血浆、富血沉棕黄层血浆、贫血小板血浆的血浆；全骨髓；柠檬酸盐抗凝骨髓；全脐带血；柠檬酸盐抗凝骨髓；包含凝血酶原的血液组分；以及它们的组合。
29.如权利要求16所述的装置，其中，所述反应室补充有干钙盐。
30.如权利要求16所述的装置，其中，所述反应室补充有钙盐溶液。
31.如权利要求29或30所述的装置，其中，所述钙盐是氯化钙。
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