KR20150063315A - 단일 헌혈자 트롬빈 혈청의 제조방법 및 장치 - Google Patents

단일 헌혈자 트롬빈 혈청의 제조방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

트롬빈 혈청의 제조방법은 혈액 유체 샘플을 얻는 단계, 상기 혈액 유체의 제1 분취액과 응혈원제를 접촉시켜 상기 응혈원제의 표면에 결합된 프로트롬비나제 효소 복합체를 형성시키는 단계를 포함하여, 저장될 수 있는 활성화된 응혈원제를 얻는다. 상기 활성화된 응혈원제는 그 다음 프로트롬빈을 함유하는 상기 혈액 유체의 제2 분취액과 접촉될 수 있어 트롬빈 혈청을 얻으며, 상기 트롬빈 혈청은 추출되고 피브리노겐과 접촉하여 피브린을 얻는다.

Description

단일 헌혈자 트롬빈 혈청의 제조방법 및 장치 {METHOD AND APPARATUS FOR PREPARING SINGLE DONOR THROMBIN SERUM}
본 출원은 2012년 9월 25일자에 출원된 미국 가 특허출원 제61/705,535호의 우선권을 청구한다. 상기 특허출원은 전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입된다.
본 발명은 혈액 유체 (blood fluid)에 존재하는 프로트롬빈을 트롬빈 (thrombin)으로의 전환에 관한 것이고, 좀더 구체적으로 혈액에서 활성화된 캐시케이드 응고 단백질 (cascade coagulation proteins)의 농도를 증가시키기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
혈장 응고 (Blood plasma coagulation)는, 강력한 세린 단백질분해효소 (protease)인, 트롬빈 (FIIa)을 생산하는 일련의 상호연관 자가-증폭적인 (self-amplifying), 효소원-효소 전환 (zymogen-enzyme conversions) (도 1)을 통해 발생하는 것으로 생각된다. 최종 단계에서 "응고 연쇄반응 (coagulation cascade)"는, 프로트롬빈이 소위 프로트롬비나제 (prothrombinase) 효소 복합체로 불리는 칼슘을 갖는 다-단백질 복합체에 의해 트롬빈으로 전환된다. 트롬빈은, 피브리노겐 (fibrinogen)을, 미세 메쉬 (fine mesh)로 중합시키고, 결국, 혈장을 겔 (gel) 또는 혈전 (clot)으로의 형성을 유발하는, 피브린 (fibrin) 유닛으로 가수분해시키는 효소이다. 트롬빈은 대략 34kDa의 분자량을 갖는 트립신 족 (trypsin family)의 세린 단백질분해효소이다. 이것은 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진다.
상기 응고 연쇄반응은 일반적으로 논의 및 응고장애 (coagulopathy) 시험의 편의를 위해 두 개의 브랜치 (branches)로 나누어진다. 상기 내인성 및 외인성 브랜치는 개별적으로 효력을 더하고, 트롬빈을 유도하는 일반 경로로 합쳐진다. 상기 외인성 경로는 지혈의 조절 (hemostatic control) 및 혈관 부상에 반응을 담당한다. 상기 내인성 경로는 혈액이 응혈원 (procoagulant) 물질과 접촉시 시작하여, 인자 XII (Factor XII) 활성을 일으킨다. 응혈원 물질에 의한 혈장 응고의 접촉 활성은 J Biomed Mater Res. 1995 Aug;29(8):1005-16 and J Biomed Mater Res. 1995 Aug;29(8):1017-28에서 철저히 연구되었고, 이의 전체적인 내용은 참조로서 여기에 혼입된다.
응혈원은 혈액 유체를 트롬빈 매개 피브린 혈전으로의 형성을 일으키는 어떤 요소 또는 활성을 의미한다. 응혈원제 (procoagulant agents)는 카올린, 면직물, 세라믹, 유리, 엘라그산 (ellagic acid) 및 이와 유사한 것을 포함하는 유기 및 무기 물질을 포함하는, 다양한 음으로 하전된 표면을 포함한다. 응혈원제는 단독으로 또는 조합하여 사용되는 것으로 알려져 있다.
이들 음으로 하전된 표면에 결합은 프리칼리크레인 (prekallikrein) (PK)을 단백질분해로 활성화시키는 인자 XII (FXII)에서 형태 변화 (conformational change)를 유도한다. PK는 FXII을 단백질분해로 활성화시켜, 시스템을 증폭시키고, 칼리크레인에 의해 고분자량 키니노겐 (kininogen) (HK)의 분열 및 FXI의 활성을 유도하는 양성 피드백 루프 (positive feedback loop)를 생산한다.
응혈원 물질에 의해 인자 XIIa 활성의 후속 산물은 세린 단백질분해효소인, 인자 Xa 및 단백질 공동인자인, 인자 Va로 이루어진 프로트롬비나제 효소 복합체의 형성이다. 상기 복합체는 칼슘 이온의 존재하에서 음으로 하전된 인지질막 상에 모인다. 상기 응고 연쇄반응의 진행을 가능하게 하는 구연산염 항-응고된 혈액 유체에 칼슘염의 첨가는 종종 구체적으로 재석회화 (recalcification)라 한다. 상기 프로트롬비나제 효소 복합체는 불활성 효소원인, 프로트롬빈 (인자 II)을 활성 세린 단백질분해효소인, 트롬빈 (인자 IIa)으로 전환을 촉진시킨다. 비록 인자 Xa가 프로트롬비나제 효소 복합체와 관련되지 않은 경우 프로트롬빈을 활성화시킬 수 있는 것으로 나타나 있을지라도, 트롬빈 형성률은 이러한 환경 하에서 심각하게 감소된다.
정상 혈액에서 순환하는 응고에 포함된 중요한 혈액 인자는 과잉의 다른 혈액 단백질보다 훨씬 더 낮은 농도로 존재한다 (60년에 걸쳐 변화하는 농도에서 이들 중 약 460). 다수의 미해결된 논쟁 가운데, 하나는 어떻게 알부민, 피브리노겐, 또는 IgG과 같은 고-농도 혈액 단백질이 상당히 더 낮은 혈액 농도의 단백질로 구성된 응혈원 표면에서의 활성-복합체 단백질의 군집과 경쟁하는 데 실패하는지에 대한 방식이다 (이하 "흡착-희석 (adsorption-dilution)" 효과라 함). 전체적인 내용이 참조로서 본 명세서에 혼입되는, Zhuo et al., Biomaterials. 2007 October; 28(30): 4355-4369에서는, 전-혈장에서 FXIIa의 축적률이 활성 표면의 연속적 존재하에서 시간에 따라 감소하여, 혈장에서 부유하는 응혈원 입자에 대한 초기 FXIIa 용액 농도에 의존한 안정-상태 (steady-state) FXIIa 수율을 유도하는 것을 발견하였다고 개시한다. 상기 결과는 FXIIa 자체가 FXII→FXIIa를 억제하는 자기억제 반응 (autoinhibition reaction)과 활성이 경쟁한다는 것을 강하게 제시하는 것이라고 저자는 설명하고 있다. 전체적인 내용이 참조로서 본 명세서에 혼입되는, Erwin A. Vogler and Christopher A. Siedlecki, Biomaterials. 2009 April ; 30(10): 1857-1869에서는, 자기활성화 (autoactivation), 자기가수분해 (autohydrolysis), 및 자기억제 반응을 포함하는 접촉 활성화 응고 화학반응에 존재하는 부가적인 불확실성을 종합적으로 검토하였다. 일반적으로, 도 1 참조.
프로트롬비나제 효소 복합체 조립은 혈장막 상에서 음으로 하전된 인지질에 인자 Xa 및 인자 Va의 결합으로 시작한다. 혈장막에 결합시, 인자 Xa 및 인자 Va는 1:1 화학양론적 비율로 빠르게 어울려 프로트롬비나제 효소 복합체를 형성한다. 상기 프로트롬비나제 효소 복합체의 조립은 칼슘 의존성이다. 완전히 조립된 프로트로비나제 효소 복합체는 효소원 프로트롬빈을 세린 단백질분해효소 트롬빈으로 전환을 촉진시킨다. 상기 프로트롬비나제 효소 복합체와 어울린 경우, 상기 인자 Xa의 촉매 효율은 300,000-배로 증가된다.
상기 응고 시스템은 화학양론 및 동력학 억제 시스템 모두에 의해 매우 엄격한 규제하에 있다. 혈장 응혈원, 화학양론적 억제제, 및 동력학 억제 공정의 구성분의 농도는 궁극적으로 생산된 트롬빈의 양을 크게 규제한다. 예를 들어, 상기 프로트롬비나제 효소 복합체의 인자 Va는, 인자 Xa에 결합하는 인자 V의 능력을 감소시키는, 활성화된 단백질 C에 의해 분열 후 불활성화된다. 상기 프로트롬비나제 효소 복합체의 인자 Xa는, 트롬빈을 억제하도록 또한 작용하는, 항트롬빈 III에 의해 억제된다. 혈장 내의 트롬빈은 혈장 단백질 항 트롬빈 III의 억제 특성을 통해 대체로 대략 10-25초의 반감기를 가져 단지 일시적으로 안정하다 (Advanced Engineering Materials Volume 11, Issue 12, pages B251-B260, December, 2009, 참조, 이의 전체적인 내용은 참조로서 여기에 혼입된다).
상기 응고 시스템의 자기활성화, 자기가수분해, 및 자기억제 반응의 정확한 화학반응은 알려져 있지 않다. 접촉 활성화에 관한 개선된 반응 체계의 해결은 효소원의 표면 활성에 포함된 생화학의 크게 개선된 이해뿐만 아니라, 단백질 흡착 및 단백질-흡착 경쟁의 성가신 문제에 대한 해법을 필요로 할 수 있다.
상기 응고 연쇄반응에서 트롬빈의 역할 및 피브린겔 (fibrin gels)의 생명공학 적용을 위한 이의 사용은, 예를 들어, Janmey et al., J. R. Soc. Interface (2009) 10, 1-10에 의해 검토되었고, 이의 전체적인 내용은 참조로서 여기에 혼입된다. 트롬빈은, 화상에 대한 및 어떤 외상 상황에서, 수술 동안 출혈 (bleeding)을 조절하기 위해 임상적으로 사용된다. 소의 트롬빈은 또한 몇몇 상업적 조직 접착제 (tissue glues)의 성분이다.
종래의 상업적 트롬빈 치료법은 사람 풀 (pooled human) 및 동물 혈액 산물로부터 정제되고, 이로써 HIV 및 간염 바이러스 (hepatitis viruse)와 같은 바이러스로의 오염의 위험이 있다. 세 개의 상업적 트롬빈 제제와 비교하여, Suzuki 및 Sakuragawa는 상기 제제가 오염 단백질을 함유하고, 상기 사람 제제는 면역글로불린 G, 간염 B 표면 항원 항체 및 사람 면역결핍 항체를 함유한다는 것을 확인하였다. 소의 트롬빈으로 이종 면역 (Xenogeneic immunization)은 사람 트롬빈 및 사람 인자 V (인자 V는 소의 트롬빈 제제에서 오염원이다) 모두에 대해 자가-반응 항체를 발생해 온 환자들에게서 보고되었다. 부가적으로, 관심사는 종래의 수단으로는 검출가능하지 않거나 또는 불활성화되는, 소의 스펀지형태의 뇌염제 (spongiform encephalitis agent)와 같은 병원균 (pathogens)으로 소의 생산물의 가능한 오염에 관하여 최근까지 제기되고 있다. 치료상의 사람 혈액 제품은 또한 간염 바이러스 및 사람 면역결핍 바이러스와 같이 바이러스성 입자에 의한 오염에 적용된다. 또한 소의 트롬빈이 임상적 사용을 위해 허용가능하다는 것을 확인하지 못하는 문화적 및 종교적 이유도 있다.
재조합 트롬빈은 FDA에 의해 최근 승인되었고, 소의 혈장-계 트롬빈에 대한 대안으로서 상업적으로 홍보되고 있으나, 이것은 소의 트롬빈에 대한 억제성 항체의 형성, 및 동물-유래 혈액 산물에 연관된 다른 안정성 염려를 잠재적으로 유발할 수 있다. 그러나, 재조합 트로빈은 또한 상기 산물을 받아들이는 몇몇 환자에게서 면역원성 (immunogenicity) 문제를 갖는 것으로 입증되었다.
그러나, 피브린 실런트 (sealant)를 필요로 하는 수술 환자를 위한 가장 안전한 상태는 피브리노겐 단백질 성분이 수확된 동일한 헌혈자 (donor)로부터 트롬빈 성분이 수확되어, 혈액 전염병 (borne disease) 전염의 어떤 위험을 피하기 위한 완전 자가수혈 생물학적 실런트 또는 접착제를 형성하는, 두 성분의 생물학적 실런트 제제로부터 결과하는 것으로 오랫동안 이해되어 왔다.
의학적 절차에서 환자로부터 공급된 트롬빈 및/또는 피브리노겐을 활용하는 개념은 1974년에 환자에게 수행되고, 새로운 것은 아니다. Cederholm-Williams PCT 특허 (W094/00566-1994년 1월 10일)는, 중간 침전물을 원심분리 및 분리를 포함하고, 제조를 위해 혈장의 pH 및 혈액의 이온 강도를 조정하는 13 단계들을 요구하는 트롬빈 성분이 동일한 헌혈자의 혈장으로부터 공급된 피브리노겐 성분과 조합되는, 개선된 피브린 접착제를 개시한다. 그러나, 이들 다수의 제조 단계들은 너무 시간을 소비해서 처리 시간이 한 시간 미만이어야 하는 수술 전후 (perioperative) 처치자에게 사용하기에 비현실적이다.
3년 후, 1997년에, Hirsh, et al. (U. S. Patent No. 5,643,192)는 피브린 접착제의 피브리노겐 및 트롬빈 성분 모두가 동일한 수혈자의 혈장으로부터 공급된 피브린 접착제를 제조하는 또 다른 방법을 교시하여 Cederholm-Williams를 따른다. Hirsh 특허는 트롬빈을 제조하는 방법을 개시하고, 여기서 상층액을 제조하기 위해 혈장에서의 대부분의 피브리노겐은 먼저 침전되고, 제거되며, 그 다음 상기 상층액에서 잔여 피브리노겐을 응혈시키는 것이 Cederholm-Williams에 의해 교시된 방법보다 더 간단하고 다르지만, 트롬빈이 오직 4분 동안 5초 미만, 및 오직 47분 동안 10 초 미만의 응혈 속도를 제공하는 점에서 상업적으로 유용한 트롬빈을 결과하지는 못하였다.
이들 응혈 속도는 Hirsh, 등의 피브린 접착제의 한도 주변에서 이들의 전체 수술을 계획할 수 있는 외과 전문의를 필요로 하여 적절하지 않다.
외과 전문의는 지혈 및 조직 봉합 또는 접착을 위해 빠른 작용 응혈 시간 (< 5 초)을 지배적으로 요구한다. 느린 응혈 생물학적 접착제 (> 5 초)는 종종 이들이 이들의 기능을 수행할 수 있기 전에 흐르는 피와 액체의 분비에 의해 부상 부위를 벗어나게 이동될 것이다. Hirsh 피브린 접착제를 활용하는 외과 전문의는 Hirsh 피브린 접착제로의 치료를 위해 의도된 지혈 및 조직 밀봉이 4분 기회 (window) (여기서 응혈 시간은 5초 미만) 내에서 발생하도록 그의 수술을 처리하는 것이 요구될 수 있어, Hirsh 발명을, 수술 시간이 6 시간까지 확장될 수 있는, 수술 내내 빠른 지혈 및 조직 접착을 지배적으로 요구하는 대부분 수술에 대해 종합적으로 비현실적으로 만든다.
Sternberger는 Br J Exp Pathol.　1947 June;　28(3): 168-177에서는, 에탄올이 혈장에서 트롬빈 활성을 안정화시키는데 사용될 수 있는 것으로 개시하고 있으며, 이의 전체적인 내용은 참조로서 여기에 혼입된다. 전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입되는, Coelho 등의 U.S. Pat. 제7,056,722호는, 트롬빈 안정화제로서 에탄올을 사용한 수혈자의 혈액으로부터 안정한 사람 트롬빈을 제조하기 위한 간단하고, 현실적이며, 빠른 방법을 위한 발명을 개시한다. 상기 방법은 8% 내지 18%의 농도에서 에탄올의 첨가에 의해 긴 수술 (예를 들어, 6 시간) 내내 안정적인 빠른 혈전 (5초 미만)을 제공한다. Coelho 등은 에탄올로 안정화되지 않는 혈액으로부터의 트롬빈 제제를 제작하기 위한 장치가 트롬빈을 사용된 광범위의 수술 동안 전체적으로는 비현실적인 것으로 더욱 교시하고 있다. 발명자들은 트롬빈의 발생을 방지하는 응고 연쇄반응의 억제를 피하기에 충분히 낮지만, 트롬빈을 안정화하기에는 충분히 높은 에탄올 농도의 매우 좁은 범위를 확인하여야 했다.
전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입되는, Kumar et al . disclose in JECT 2005; 37:390-395 and in JECT . 2007; 39:18-23에서는 트롬빈 생산을 개시하기 위한 가장 쉬운 방법이 구연산 처리된 혈장에 칼슘 이온을 첨가하는 것으로 교시하고 있다. 여기서, 과잉의 칼슘은 응혈 (clotting) 연쇄반응의 개시를 허용하고 트롬빈을 생산한다. Kumar는 생산된 트롬빈에서 트롬빈의 활성의 안정성이 짧은 점에서 이러한 절차의 단점이 있고, 단백질 S, 단백질 C 및 항-트롬빈 III에 의한 응고 연쇄반응의 억제 때문에, 상기 활성이 통상적으로 생산의 20분 이내에 비기능적 상태로 감소되는 것을 더욱 교시하고 있다. Kumar 등에서는, 억제 효소가 에탄올을 사용하여 부분적으로 불활성화된 경우, 안정한 트롬빈 생산물이 생산될 수 있는 이들 제한을 면하기 위한 방법 및 장치를 더욱 개시한다. 트롬빈을 농축 및 활성화시키기 위하여, 염화칼슘 및 에탄올의 혼합물은 음으로 하전된 표면의 존재하에서 구연산염 항-응고된 혈장에 첨가된다. 음으로 하전된 표면은 프로트롬빈-FV-FXa 복합체의 형성을 개시하는 반면, 염화칼슘 및 에탄올의 혼합물 (트롬빈 시약)은, 생산 후 몇 시간이 사용될 수 있도록, 트롬빈을 부분적으로 안정화시키고, 트롬빈의 억제제를 불활성화시키기 위한 화학적 구성분을 제공한다. 전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입되는, Kumar and Chapman in JECT. 2007; 39:18-23에서는 또한 30분 기간 내에 출발 공급원 생물학적 유체로서 혈장 대신에 전혈 (whole blood)로부터 자가수혈 사람 트롬빈을 발생하기 위한 방법을 개시한다. 그러나, 다른 종래의 기술과 같이, 트롬빈 생산물을 안정화하기 위한 첨가제로서 에탄올을 여전히 사용하지만, 4℃에서 저장으로도 시간에 걸쳐 연속적으로 쇠퇴하는 트롬빈 활성을 갖는다.
Coelho et al . in U.S. Pat. No. 7,056,722 및 Kumar에 개시된 바와 같은, 트롬빈 혈청 (serum)/에탄올 제제는 Sempleet al . in J Oral Maxillofacial Surg 66:632-638, 2008에 개시된 바와 같이 생체적합한 해법이 아니며, 이의 전체적인 내용은 참조로서 여기에 혼입된다. 상기 제제는, 만약 4% 미만의 최종 에탄올 농도로 투여하기 전에 실질적으로 희석하지 않는다면, 세포독성 (cytotoxic)이다.
트롬빈에 대한 안정화제로서 에탄올의 사용은 또한 McGinnis 등의 U.S. Pat. Pub. 2004/0120942호에 개시되었고, 이의 전체적인 내용은 참조로서 여기에 혼입된다. McGinnis 등은 또한, 응고의 내인성 경로에 포함된 물질인 것을 의미하고, 유리, 유리 비드, 규조토 (diatomaceous earth), 세라믹, 카올린 및 이의 어떤 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는, "접촉 활성화제"의 사용을 개시한다.
전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입되는, Kanayinkal 등의 U.S. Pat Pub. 2009/0044852호에서는, 약 10 시간을 초과하는 안정-수명을 갖는 트롬빈 조성물을 제공하기 위해 안정화제와 트롬빈 조성물을 접촉시키는 단계를 개시하며, 여기서 상기 안정화제는 8% 내지 25%의 범위의 에탄올, 폴리올, PEG, 황산 암모늄, 비-극성 용매, 극성 용매, 메틸 이소부틸 케톤 알코올, 글리콜, 트리클로로아세트산, 아세테이트 염, 또는 이의 조합을 포함한다. 이러한 시스템은 확장된-수명 크롬빈 생산 조성물을 제공하는 반면, 생체적합성 (biocompatibility) 합병증 (complication)은 안정화제의 존재에 기인하여 도입될 수 있다.
전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입되는, 2000년 12월 12일자에 등록된 미국특허 제6,159,232호; 2002년 11월 12일자에 등록된 미국특허 제6,478,808호; 2002년 11월 19일자에 등록된 미국특허 제6,482,223호; 및 2006년 1월 4일자에 등록된 미국특허 제6,989,022호 및 2006년 8월10일자에 공개된 미국 공개특허 제2006/0178610호에서 Nowakowski는 상처 봉합 방법 및 장치를 개시하였고, 여기서 혈액 유체의 응혈 연쇄반응은 먼저 개시되면서, 상기 유체는 상기 몸체 밖 및 실질적으로 밀폐된 멸균 용기 내에 있다. 상기 응혈 연쇄반응 개시 장치는 응혈원제 (procoagulating agent) (혈액 유체를 혈전 형성을 유발할 수 있는 성분), (혈액응고 방지제 헤파린 (anticoagulant heparin)을 억제하기 위해 혈액 유체에 액체 황산프로타민 (protamine sulfate)을 첨가하는 것과 같은) 혈액응고 방지제를 실질적으로 중화시키기 위한 메커니즘, 또는 항혈전을 실질적으로 중화시키기 위한 메커니즘 (항혈전 억제제의 예로는 트라넥사민산 (tranexamic acid) 및 플라스미노겐 결합 물질로서 기재된다)을 포함할 수 있다. 상기 혈전-활성 혈액 유체는 그 다음 상체에 대해 증착되고, 여기서 응혈은 계속된다.
최근, 응혈 공정에서 주요 역할을 훨씬 능가하는 트롬빈의 중요성은 조사되었다. 전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입되는, Bae et al. in J Cell Physiol. 2009; 219(3): 744-751에서는, 트롬빈이, 피브리노겐을 피브린으로 절단하여 혈액 혈전의 형성에서 중심 역할을 수행하는 것에 부가하여, 감염, 알레르기, 종양 성장, 전이, 세포사멸, 및 조직 리모델링에 연관된 다양한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 검토하였다. 다양한 세포 기능을 조절하는 트롬빈의 능력은 특이 세포 표면 수용체와 상호작용을 통한 어떤 경우에 달성된다. 모든 알려진 트롬빈 수용체는 단백질분해효소-활성 수용체 (PAR) 족에 속하고, 활성화의 고유 (peculiar) 단백질분해 메커니즘을 특징으로 한다. 수용체 활성화는 트롬빈이 결합된 리간드 (tethered ligand)를 노출하는 수용체의 세포외 도메인을 절단하는 경우 발생한다. 상기 PAR 족의 수용체 중에서, 트롬빈은 PAR-1, -3, 및 -4와 특이적으로 상호작용할 수 있다. 부가적으로, 트롬빈은 몇몇 세포에 대한 강력한 미토겐제 (mitogenic agent)이다.
이러한 진전에도 불구하고, 치료의 시점에서 단일 헌혈자 트롬빈 혈청을 제작하기 위한 이상적 방법은 부족함이 남아있다. 이상적인 트롬빈 제조 장치 및 방법은 신체에 사용하기에 안전해야만 하고, 따라서 환자 자신의 혈액으로부터 유래되어야 하며, 트럼빈 안정성 문제를 극복하기 위해 에탄올과 같은 세포독성 첨가제가 요구되지 않아야 한다. 전술된 종래의 기술은 출원인이 인지한 기술의 상태를 반영하고, 관련 종래의 기술을 개시하기 위한 출원인의 인정 의무를 이행하는 것이 여기서 포함된다. 그러나, 이하 좀더 상세하게 개시되고 특히 청구된 것과 같은 본 발명의 어떤 가능한 조합에서 고려된 경우에도, 이들 문헌들 중 어떤 것도 단독으로 자명하게 교시하지 않은 것으로 규정한다.
본 발명의 목적은 트롬빈 혈청의 제조를 위한 새롭고, 개선된 방법 및 장치를 제공하는 데 있다. 다른 목적 및 장점은 본 명세서 및 이의 청구항을 읽은 후 기술분야의 당업자에 의해 명백해질 것이다. 본 발명은 치료의 시점에서 단일 헌혈자의 혈액 유체로부터 의학적 적용을 위한 안전하고 효과적인 트롬빈 혈청을 제조하기 위해 간단하고, 실현 가능하며, 빠른 수단에 대한 미충족 욕구를 더 잘 해결한다. 트롬빈 혈청의 제조를 위한 방법 및 장치는 개시되며, 여기서 트롬빈 혈청은 치료하는 의사의 요구에 따라 빠르고, 반복적인 방식으로 혈액 유체로부터 만들어질 수 있다. 본 발명은 혈액 유체로부터 트롬빈 혈청을 얻는 이-단 (two-stage) 방법을 교시한다. 제1 단계에 있어서, 응혈원제는 상기 응혈원제의 표면상에 프로트롬비나제 효소 복합체를 얻는 수단에 의해 활성화된 응혈원제로 전환된다. 상기 프로트롬비나제 효소 복합체는 혈액 유체에 존재하는 응고 단백질로부터 유래한다. 작업자의 요구에 따라 일시적으로 수행될 수 있는, 제2 단계에 있어서, 트롬빈은 프로트롬빈을 포함하는 응고 단백질을 포함하는 생물학적 유체와 상기 활성화된 응혈원제를 접촉시켜 프로트롬빈으로부터 얻어진다. 이들 응고 경로 반응이 칼슘 의존성이기 때문에, 적절한 칼슘 이온 농도는 반응 혼합물에 제공되어야만 한다. 본 발명은 반응 혼합물을 함유하기 위한 장치뿐만 아니라 유체 전달체의 첨가 및 추출 수단을 더욱 교시한다.
본 발명의 목적을 위하여, 응혈원제는 적어도 트롬빈 생성을 얻는 시점, 바람직하게는 피브린을 얻는 시점에 혈액 시스템의 응고 연쇄반응을 활성화시키는 능력을 갖는 물질이다 (도 1). 바람직한 응혈원은 직경이 5 mm 미만 또는 다공성 입자를 갖는 응혈원 입자를 사용하여 최적으로 달성되는 높은 표면적을 갖도록 혈액에 제공될 것이다. 활성화 단계는 자유 칼슘 이온의 존재하에서 제1 혈액 유체 분취액 (aliquot)과 상기 응혈원제를 접촉시켜 달성된다. 이론에 제한되는 것을 원하지는 않지만, 분자 수준에서, 상기 장치의 제1 단계 활성화는 메타-안정 형태에서 응혈원제의 표면상에 발생되는 프로트롬비나제 효소 복합체에 기인하는 것으로 믿어진다. 상기 장치의 활성화는 혈액 유체와 오직 약 5 내지 10분을 요구한다. 상기 활성화 상태는 24 시간까지의 불활성 수준으로 점진적으로 감쇄하기 전에 적어도 10시간 동안 높은 수준으로 지속한다. 지속된 활성화 상태의 이러한 기간은 혈액의 과잉 응혈을 피하기 위해 지속하는 응고 연쇄반응의 다른 요소의 반감기가 얼마나 짧은지를 고려하는, 기능적 안정성의 기간을 갖는 프로트롬비나제 효소 복합체에 원인이 있다고 본다. 10 시간의 유지된 응혈원 활성화는 대부분 수술보다 더 긴 시간으로 행운인 것이다. 활성화 시, 상기 장치는 장치에 첨가된 제2 혈액 유체 분취액으로부터 의학적으로 유용한 양의 트롬빈을 빠르게 제조하는데 (예를 들어, 약 1분) 사용될 수 있다. 트롬빈의 빠른 생산은 프로트롬빈의 트롬빈으로 전환을 촉진하는 응혈원제의 높은 표면적 상에 형성된 다량의 프로트롬비나제 효소 복합체에 원인이 있다. 트롬빈이 형성되는 속도 (rapidity)는 항-트롬빈 III과 같은 트롬빈 중성화제가 불활성 복합 반응 동역학을 형성하는 트롬빈 및 항-트롬빈 III 대 상기 프로트롬비나제 효소 복합체 반응의 동역학에 기인하여 트롬빈을 중화시킬 수 있는 속도를 훨씬 초과한다. 트롬빈 생산 및 트롬빈 중성화 사이의 동역학에서 이러한 차이는 임상학적으로 유용한 양의 활용가능한 트롬빈을 갖기 위한 능력에 대한 시간 창 (time window)을 생성한다. 달성될 수 있는 트롬빈 생산이 빠르면 빠를수록 (예를 들어, 더 많은 프로트롬비나제 효소 복합체 형성), 상기 트롬빈 혈청에 존재할 임상적으로 유용한 양의 트롬빈의 지속 시간은 더 길다. 더욱이, 상기 트롬빈 및 항-트롬빈 III의 반응 동역학은 트롬빈의 생산보다 (<10℃의 온도까지 억제된) 훨씬 더 온도 민감하여 유용한 양의 트롬빈이 냉장된 혈액 생산물을 사용하여 저장될 수 있고, 형성된 트롬빈 혈청의 유용한 유통 기간이 냉장 저장에 의해 상당히 개선될 수 있는 것으로 실험을 통해 알 수 있다. 본 발명은 따라서 수술 팀의 요구에 따라 환자 자신의 혈액으로부터 생체적합한 트롬빈 혈성의 빠른 생산을 가능하게 한다. 본 발명은 제2, 제3, 제4 등의 혈액 분취액이 트롬빈 혈청의 부가적인 독립 분취액을 발생하기 위해 동일한 방식으로 동일한 장치에 첨가될 수 있는 것을 의미하는 반복적으로 사용되는 장치를 위한 수단을 더욱 교시한다. 더욱이, 본 발명은 트롬빈 혈청을 제조하기 위해 상기 장치의 각자 사용이 단일 장치로부터 연속적으로 빠른 트롬빈 생산을 갖는 것을 계속하도록 작업자를 가능하게 하는 부가적인 10시간 동안 새로워지는 응혈원제의 활성화 상태를 유발하는 것으로 교시한다. 치료 시점에서 환자 자신의 혈액 유체를 사용하여 큰 용량의 트롬빈 생산을 가능하게 하여 유도된 비용-절감에 대한 및 경제적 가치 및 잠재성은 본 발명의 또 다른 이로운 관점이다.
혈장은 혈액의 세포로 되어있지 않은 부분 (acellular fraction)이고, 응고 연쇄반응 및 피브리노겐의 단백질을 포함하는 다수의 단백질을 포함한다. 피브리노겐이 트롬빈의 작용에 의해 피브린으로 전환된 경우, 상기 혈장은 피브리노겐 농도가 크게 감소되고, 혈장 대신 혈청으로 표기된다. 본 발명의 목적을 위하여, 트롬빈 혈청은 이의 세포내 함량과 무관하게 피브리노겐을 피브린으로 전환하는 검출가능한 트롬빈 효소 응혈 활성을 함유하는 어떤 생물학적 유체를 묘사하는 용어로서 사용된다. 본 발명의 목적을 위하여, 혈액 유체는 응고 연쇄반응의 활성화 시 프로트롬비나제 효소 복합체를 발생시키기 위한 기능적 생산 능력을 갖는 헌혈자로부터 유래하는 생물학적 유체를 묘사하기 위해 여기서 사용된 용어이고, 전혈, 구연산염 항-응고된 전혈 또는 혈장, 또는 구성분으로서 프로트로빈을 갖는 어떤 다른 적절한 혈액 분획 물질 (blood fraction matter), 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 혈장, 연막 (buffy coat) 풍부 혈장, 혈소판 부족 혈장, 전 골수 (whole bone marrow), 구연산염 항-응고된 골수, 전 제대혈 (whole cord blood), 구연산염 항-응고된 골수 및 어떤 다른 응고 연쇄반응 반응을 일으키는 혈액 유체 제제를 포함하는 목록으로부터 선택된다. 더욱이, 본 발명은 다른 혈액 유체가 동일한 장치에서 사용될 수 있는 것으로 교시한다. 비-제한 예로서, 상기 응혈원제의 활성화의 제1 단계는 상기 장치에 전혈을 첨가시켜 달성되고, 트롬빈 혈청을 발생시키는 제2 단계 동안, 상기 사용된 혈액 유체는 혈소판 풍부 혈장과 같은 다른 혈액 유체일 수 있다.
이하 좀더 상세하게 개시되고, 특히 청구된 바와 같은 본 발명은 다수의 예상치 못하고, 기대치 않은 실험적 관찰에 의해 하기 발견을 포함한다: 1) 상기 장치에서 응혈원제와 칼슘, 혈액 유체를 혼합하는 초기 몇 분 동안 바람직한 응혈원제의 고표면적 상에 형성된 프로트롬비나제 효소 복합체는 임상적으로 유용한 적어도 6 시간 내지 24 시간 미만의 기간 동안 프로트롬빈을 트롬빈으로의 빠른 전환을 촉진시킬 수 있는 지속된 효소 활성의 지속적 기능 상태를 유지하고, 이에 의해 저장 활성 장치로부터 "주문형 (on demand)" 트롬빈 제조를 가능하게 하는 발견; 2) 트롬빈이 활성화된 응혈원제와 혈액 유체 프로트롬빈 공급원의 접촉 시 몇 분 대신 몇 초 이내로, 풍부하고, 매우 빠르게 발생할 수 있고, 이에 의해 저장 활성 장치로부터 "주문형" 트롬빈 제조를 더욱 가능하게 하기 전에 (예를 들어, 1분 배양) 가능한 한 더 빠르게 달성된 트롬빈의 임상적으로 유용한 농도를 가능하게 하는 발견; 3) <10℃에서 수확된 트롬빈 혈청의 저장이 생체적합한 트롬빈 혈청을 제조하기 위한 "주문형" 접근법의 실현가능성을 더욱 뒷받침하는, 2007년 Kumar et al.에 의해 개시된 바와 같은 안정화제로서 제공된 에탄올 없이 트롬빈 안정화를 상당히 향상시키는 발견; 4) 단일 장치가 트롬빈의 다중 배치를 발생하기 위해 반복적으로 사용될 수 있고, 각자의 트롬빈 생산은 또한 단일 장치가 단일 헌혈자로부터 많은 양의 신선한 트롬빈 혈청을 생산하기 위해 사용될 수 있음에 따라 장치의 상업적 실행가능성을 더욱 뒷받침하는 적어도 부가적인 10시간 동안 활성 상태로 장치 내에 응혈원제를 유지시키는 것을 더욱 제공하는 발견; 5) 단일 헌혈자 트롬빈을 제조하기 위한 종래의 기술에 의해 교시된 바대로 혈액 유체로부터 에탄올의 제거는 상기 응혈원의 좀더 빠른 활성화를 가능하게 하여, 에탄올이 환자에게 좀더 빠른 단일 헌혈자 트롬빈 이용가능성을 가능하게 하는 종래의 기술에 교시된 바대로 혈액 유체에 첨가된 경우 요구된 30분 내지 60분 대신에 오직 10분의 시간이 임상적으로 유용한 트롬빈을 생산할 수 있는 능력을 갖는데 요구된다는 발견, 6) 상기 혈액 유체에 18% 내지 25% v/v의 농도로 에탄올의 첨가는, 만약 원한다면 응고 연쇄반응의 저하를 피하기 위하여 (과잉의 에탄올 농도), 또는 트롬빈를 안정화시키는 것의 실패를 피하기 위하여 (불충분한 에탄올 농도) 정밀한 농도로 존재해야 하는 에탄올에 기인한 느리고 신뢰할 수 없는 트롬빈의 생산에서 겪는 종래의 기술을 개선하기 위하여 상기 응혈원의 제1 활성이 달성된 후에 상기 에탄올을 첨가시켜 트롬빈을 안정화하기 위해 여전히 사용될 수 있다는 발견.
본 발명은 하나 이상의 부가적인 혈액 유체 분취액과 접촉시켜 10 시간에 걸친 주문에 따라 만들어진 하나 이상의 트롬빈 제제에 함유된 트롬빈의 양 및 이용가능성을 크게 가속시키기 위한 칼슘 이온의 존재하에서 제1 혈액 유체 분취액 접촉에 의해 활성화된 단일 장치를 반복적으로 사용 및 저장하는 수단을 개시한다. 본 발명에 의해 생산된 일시적으로 안정한 트롬빈은 트롬빈 안정화 첨가제의 사용 없이 수행된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현 예는 혈액, 단일 헌혈자 전혈, 혈장, 혈장 풀, 혈소판 풍부 혈장, 혈소판 부족 혈장 또는 응고 연쇄반응 완전성을 갖는 혈장을 포함하는 전혈 분획을 포함하는 목록 (여기서 혈액 유체라 표시한다)으로부터 선택된 혈액 유체로부터 주문시 임상적으로 유용한 트롬빈 제제를 생산하기 위한 실현가능한 방법을 개시하여 종래의 기술의 하나 이상의 중요한 단점을 극복하고, 개선한다. 트롬빈을 제조하기 위한 본 발명을 실행시켜 조절, 효율, 신뢰도, 안정성, 및 비용 성능에 관한 극적인 개선을 실현할 수 있다. 구체적으로, 개시된 방법 및 장치는 긴 수술시간을 통해 당업자가 수행하기 쉬운 방식으로, 지혈을 달성하고, 상처 치유를 증진하며, 또는 세포 조성물을 운반하기 위하여 용이하게 이용가능한 생물학적 유체로부터 풍부한 임상적으로 유용한 트롬빈 제제의 빠르고, 재생가능하며, 반복적이고 계획적인 생산을 단일 장치의 사용을 통해 가능하다. 본 발명은 방법을 수행하기 위한 장치를 제공하여 상기 방법을 편리하게 실행하기 위해 트롬빈 혈청 제제를 사용하는 방법을 더욱 제공한다.
상기 응혈원제는 바람직하게는 유리, 유리 비드, 유리 섬유, 세라믹, 엘라그산, 및 규조토 (diatomaceous earth) 또는 기능성 프로트롬비나제 효소 복합체와 연관되고 활성 응혈원으로 한정된 것을 포함하는 목록으로부터 선택되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 응혈원제는 50 마이크론 및 2 mm 사이의 직경을 갖는 보로실리케이트 유리 비드이고, 그래서 이들은 반응 챔버 내에 용이하게 보유되지만 필터 스크린, 심층 필터 (depth filter) 등과 같은 기술분야에서 잘 알려진 수단에 의해 혈액 세포의 통과 (대략 6 -10 마이크론 직경)를 허용한다. 상기 응혈원제가 상기 반응 챔버의 버텀에 놓이도록 큰 표면적을 제공하는 것이 유리하다. 상기 장치를 수동으로 흔드는 것과 같이 물리적 교반에 의한 형성 피브리겔을 가루로 빻는데 사용되는 더 큰 직경 및 더 많은 질량을 갖는 다른 분리된 물체를 상기 반응 챔버에 포함하는 것이 특히 유리하다. 대표적인 적절한 분리된 물체는, 비록 형성된 피브린겔을 가루로 빻기 위한 다른 수단을 활용할 수 있는 것으로 쉽게 이해될 수 있을지라도, 유리, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 및 폴리에틸렌과 같은 혈액 접촉을 위해 의학적으로 허용가능한 물질로부터 제조된 6 내지 8 mm의 비드이다. 바람직하게는, 상기 장치의 모든 부분은 사람 사용에 생체적합성이 있고, 감마선, e-빔 또는 바람직하게는 산화에틸렌 가스를 포함하는 하나 이상의 공지의 멸균 방법에 의한 멸균을 견딜 수 있다.
프로트롬비나제 효소 복합체 억제제 (항-트롬빈 III 및 활성 단백질 C 및 단백질 S)의 존재 및 반응 혼합물에서 알부민 및 면역글로불린과 같은 풍부한 양의 다른 흡수 단백질에도 불구하고, 상기 프로트롬비나제 효소 복합체의 충분한 안정성이 연장된 기간에 걸쳐 유지되는 것은 예상외이고 놀라운 것이다. 그러나, 이러한 트롬빈 생산 화학반응은 실온에서 24 시간 저장 내에 영구적이지 않고 종료된다. 연장된 안정성을 대한 이유는 알지 못하는 것에 주목하고, 얼마나 빠르게 가장 활성화된 응고 단백질이 응고 시스템의 확인 및 균형에 기인하여 종료하지를 고려해 볼 때 놀라우며, 이러한 가능하게 하는 안정성 기간이 발견될 수 있는 실험 없이 기술분야의 당업자가 예측을 가능하게 하는 과학적 증거는 존재하지 않는다. 기술분야의 당업자는 발생하여 적어도 10 시간이지만 24 시간 미만의 안정성을 예견할 수 없을 것이다.
본 발명은 단일 헌혈자 또는 바람직하게는 혈액 유체의 자가수혈 공급원으로 바람직하게는 치료의 시점에서 사용하기 위한, 사용하기 간단하고, 휴대용이며, 저렴하고, 신뢰성 있는 장치를 제공한다 (도 4-6 참조).
본 발명은 현존하는 트롬빈 제품과 비교하여 트롬빈 제제의 수혈자 (recipient)에 대해 더 안전한 트롬빈 제제를 의료진에게 제공한다. 개선된 안정성의 제1 수단은 본 발명이 안정화제로서 에탄올의 세포독성 농축물과 같은 화학적 불순물 (adulterant)의 첨가를 피하여 현존하는 트롬빈 제제와 연관된 위험을 감소시키는 점에 있다. 이러한 화학적 첨가제의 부재는 상기 트롬빈 제제가 수혈자에게 적용된 경우 화학적 독성 반응의 위험이 제거됨에 따라 특히 가치있다. 개선된 안전성의 제2 수단으로서, 본 발명에 기재된 트롬빈 제제는 소의 트롬빈 또는 유전적으로 변형된 햄스터 세포주에 대한 경우에서와 같이, 다른 종들로부터 유래하지 않아, 이에 의해 병원균 전염 및 면역유전 반응의 위험을 피한다. 개선된 안전성의 제3 수단으로서, 본 발명은 현재까지 실행된, 잠재적인 수백 또는 수천의 헌혈자로부터 혈장의 풀 (pools) 이외에 단일 헌혈자로부터 유래된 트롬빈 제제를 가능하게 하고, 이에 의해 상기 풀 생산물에서 남아있는 감염성 질병을 전염시키는 위험을 완화시킨다. 개선된 안전성의 제4 수단으로서, 상기 트롬빈 제제는 사용 시점에서 제조될 수 있게 간단하고 충분히 빠르며, 이에 의해 상기 트롬빈을 제조하는데 사용되는 것으로 환자 자신의 혈액 유체를 가능하게 한다. 자가수혈 혈액 생산물은 가장 안정한 생물학적 제제로서 일반적으로 인식된다. 개선된 안정성의 제5 수단으로서, 본 발명의 방법 및 장치는 이들이 수술실의 무균 영역 내에 활용될 수 있게 충분히 단순하며, 이에 의해 물질을 무균 영역 밖 및 그 다음 안으로 전달할 필요를 피하고, 이에 의해 무균 영역의 생물학적 오염의 증가된 위험 및 궁극적으로 환자가 병원성 감염 (nosocomial infection)을 얻은 증가된 위험을 피한다.
본 발명의 방법에 따라 생산된 트롬빈은 알려지고, 이의 전체적인 내용이 참조로서 여기에 혼입된, Ham et al., Journal of Blood Medicine 2010:1 135-142에서 최근에 검토된 바대로 트롬빈의 동일한 종래의 치료적 적용에 대해 유용하다. 본 발명은 피브리노겐으로부터 피브린을 생산하는 의도된 목적을 위하여 효율적인 사용 시간에서 트롬빈의 충분한 농도를 갖는 트롬빈 제제를 생산하기 위한 수단을 제공한다. 본 발명은 혈소판 및 줄기 세포와 같은 세포의 전달을 위한 피브린겔의 발생을 위해 특히 적합하다. 혈소판 풍부 겔을 형성하기 위해 혈소판 풍부 혈장에 트롬빈 제제의 첨가는 Akingboye et al., AA, J Extra Corpor Technol. 2010 Mar; 42(1):20-9에서 최근에 검토된 바와 같이 병원 운영에서 널리 사용되고, 이의 전제적인 내용은 참조로서 여기에 혼입된다.
개시된 트롬빈 제제를 생산하기 위해 기재된 방법 및 물질은 이들이 내부-수술실로부터, 치료의 시점 또는 실험실 설정에서 또는 변화하는 능력의 노-하우를 갖고 수행하는 작업 간호사의 기량 내에 있는 사용자에 의한, 다양한 다른 상황 범위에서 사용될 수 있도록, 사용하기에 빠르고, 신뢰 있으며 용이하기 때문에 실행가능하다. 더구나, 본 장치 및 방법은 출발로부터, 현재 사용중인 다른 방법보다 더 짧은 시간인, 약 10분의 종료까지의 총 시간 및 체험 시간의 양을 최소화시킨다. 본 발명은 트롬빈 혈청을 제조하는데 사용되는 원심분리 또는 히터와 같은 전기기계적 장치를 요구하지 않는다.
Nowakowski, Coelho, Kumar 및 잔여 종래 기술들은 하기를 단독으로, 또는 조합으로, 교시하거나, 제안하거나, 또는 동기를 부여하지 않는다: 1) 트로빈 혈청을 만들기 위한 개시된 두 단계 공정; 2) 활성화된 응혈원제를 저장시켜 트롬빈 혈청 불안정성을 극복하기 위한 실행가능한 수단; 3) 단일 장치로부터 다중 배치의 트롬빈 혈청을 제조하기 위한 활성화된 응혈원제의 반복적인 사용을 위한 수단, 또는 4) 분리된 물체를 사용하여 피브린겔로부터 트롬빈 혈청을 방출하기 위한 반응 챔버 내에 형성된 피브린겔을 가루로 빻기 위한 수단을 포함.
종래의 기술의 단점을 고려하여, 본 발명의 주요 목적은 치료의 시점에서 수술 간호사와 같은 의료진에 의해 수행될 수 있는 충분히 간단한 공정에서 세포독성 트롬빈 안정화 화학제의 요구된 사용 없는 주문시 단일 헌혈자의 혈액 유체로부터 생체적합한 트롬빈 혈청을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 약 10분의 최소 공정 시간을 갖는 트롬빈 혈청을 제조하기 위한 실현 가능한 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 10초 미만으로 응혈을 제공하는, 생체적합한 트롬빈 혈청을 제공하는 데 있다.
본 발명의 여전한 또 다른 목적은 단독 또는 피브리노겐 공급원과 조합하여 박형 튜브를 통하여 짜내거나 또는 작은 오리피스 (orifices)를 통하여 분무될 수 있는 트롬빈을 제공하는 데 있다.
본 발명의 여전한 또 다른 목적은 생체적합한 트롬빈을 제조하기 위한 방법을 제공하는 데 있고, 상기 방법은 혈액 유체의 제1 분취액을 얻는 단계; 혈액 유체를 재석회화 (recalcify)하기 위해 혈액 유체의 상기 제1 분취액에 충분한 CaCl2를 첨가하는 단계, 응혈원제를 첨가하는 단계, 이로부터 상기 제1 혼합물을 형성하는 단계를 포함하고, 상기 형성 단계는: 상기 제1 조성물을 혼합하기 위해 일시적으로 교반시키는 단계; 적어도 약 10분 및 6 시간 미만 동안 상기 제1 조성물을 저장하는 단계; 트롬빈 혈청이 이용가능하도록 요구된 때까지의 시간 동안 상기 제1 혼합물을 저장하는 단계; 혈액 유체의 제2 분취액을 얻는 단계; 상기 혈액 유체를 재석회화하기 위해 혈액 유체의 제2 분취액에 충분한 CaCl2를 첨가하는 단계, 제2 혼합물 조성물을 생성하기 위해 상기 저장된 제1 혼합물에 CaCl2를 함유하는 상기 제2 분취액을 첨가하는 단계; 상기 제2 혼합물 조성물을 혼합하기 위해 일시적으로 교반시키는 단계; 피브린겔이 형성될 때까지 상기 제2 조성물을 배양하는 단계, 트롬빈 혈청을 방출하기 위해 피브린겔을 분쇄하는 단계; 및 미립자를 제거하기 위해 상기 트롬빈 혈청을 여과하는 단계, 이에 의해 응혈원제의 통과 (예를 들어, 20 micron 기공 크기)를 방지하기에 충분히 크지만 유체가 트롬빈 혈청 흐름을 가능하게 하는 기공 크기를 갖는 필터 막을 통해 트롬빈을 통과시키는 단계; 실온에서 및 더욱 바람직하게는 습식 얼음 (<10℃)에서 수확된 트롬빈 혈청을 저장하는 단계 및 최종적으로 피브린을 생성하기 위해 피브리노겐 공급원과 트롬빈 혈청을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 조직 이식을 준비하기 위한 목적을 위해, 세포 배양을 실행하기 위해, 진단 시험을 수행하기 위해, 또는 피브린 실런트로 세포 및 조직을 조합하는 기술에서 알려진 다른 목적을 위해 피브린겔로 혼입된 생존가능한 세포 현탁액을 제조하기에 적절한 트롬빈 혈청의 생산을 위한 방법을 제공하는 데 있다. 생체적합한 트롬빈을 사용에서 중요성은 상기 피브린 이식에서 함유된 세포의 생존력을 유지하기 위하여, 살아있는 세포 복합 이식을 준비하는데 특히 중요하다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성화에 대한 필요 없이 트롬빈 혈청을 여러 번 추출하기 위해 반복적으로 사용될 수 있는 장치를 제공하는 데 있다. 상기 장치에 혈액 유체의 3, 4, 또는 5회 이상의 분취액을 첨가하는 것은 상기 장치에 이전의 혈액 유체 첨가의 마지막 첨가의 10 시간 내에 이것을 빠르게 달성할 수 있다. 만약 구연산염 나트륨과 같은 칼슘-킬레이트화제 (chelating agent)가 항응혈제 (anticoagulant)로서 사용된다면 각각의 혈액 유체 분취액은 상기 혈액 유체를 재석회화하기 위해 CaCl2 용액으로 처리될 수 있다. 본 발명은, 만약 혈액 유체로부터 헤파린을 제거하기 위해 Nowakowski에 의해 개시된 바대로의 단계가 사용되지 않는다면, 헤파린으로 항-응고된 혈액 유체와 함께 사용하기에 적절하지 않다.
본 발명은 관련 분야에서 다른 작업의 노력에 의해 예시된 제한을 극복하여 의학적 사용을 위해 트롬빈을 제공하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 본 발명은 수술 시간 (예를 들어, 10 시간) 내내 요구된 대로 피브리노겐 공급원 (<5 내지 10 초)과 조합된 경우 빠른 혈전을 제공할 농도로 트롬빈을 제공한다. 상기 분야에서 이전의 작업 (Hirsch, et al.)은 피브리노겐의 트롬빈 달성 빠른 응혈 (즉, 5초 미만)이 매우 한정된 4 내지 5 분의 기간에 오직 존재하거나, 또는 넓은 범위의 수술 동안 완전히 비현실적인, 수술 전후 준비 동안 적절하지 않은 너무나 많은 단계 및 경과시간이 요구되는 점에서 트롬빈이 최소 안정성을 갖는 문제의 전형적인 예이다. 분야에서 이전의 노력 (예를 들어, Coelho et al.)은 트롬빈에 대한 화학적 안정화제로서 에탄올을 첨가하여 트롬빈 혈청의 짧은 안정성의 제한을 극복하는 것을 시도하였지만 이렇게 하는 것이 개선된 트롬빈 안정성을 달성하기 위해 요구된 에탄올의 세포독성 농도를 기인하여 새로운 생체적합성 문제를 나타낸다.
따라서, 트롬빈 불안정성의 문제는 본 발명에서 더욱 완벽하게 해결된다. 두-단계 공정의 생성에 의해, 활성화된 응혈원제는 트롬빈 혈청이 요구된 근접한 시간까지 만들어지고 저장될 수 있고, 이에 의해 트롬빈 혈청의 준비를 지연시켜 트롬빈의 잘 알려진 일시적인 안정성 문제를 극복한다. 활성화된 장치로부터 수확된 트롬빈 제제는 화학적 첨가제에 대한 필요 없이 <10℃에서 저장된 경우 적어도 한 시간 동안 및 실온에서 저장된 경우 적어도 15분 동안 이의 빠른 응혈 능력을 보유한다. Coelho 및 Kumar 및 다른 종래의 기술에 의해 교시된 바대로 에탄올로 안정화된 트롬빈 혈청을 저장하는 대신 활성화된 장치를 저장하여, 본 발명은 치료의 시점에서 단일 헌혈자로부터 생체적합한 빠른 혈전 시간 (예를 들어, 10초 미만)으로 임상적으로 유용한 트롬빈 혈청 제제를 좀더 빠르게 제공하는 수단을 제공한다.
본 발명의 전술된 관점 및 다수의 수반되는 장점은, 첨부된 도표 및 도면을 참조하여 다음의 상세한 설명을 이해하는 경우 좀더 용이하게 알 수 있을 것이다.
도 1은 종래의 기술에서 알려진 바와 같은, 응고 연쇄반응의 요약이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 구현 예에 따른 방법을 상세하게 설명하는 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 바람직한 구현 예에 따른 방법을 상세하게 설명하는 흐름도이다.
도 4a는 본 발명의 구현 예에 따른 반응 챔버 커버의 하나의 구현 예이다.
도 4b는 본 발명의 구현 예에 따른 반응 챔버 커버 및 반응 챔버의 평면도이다.
도 4c는 본 발명의 구현 예에 따른 반응 챔버 커버 및 반응 챔버의 측면도이다.
도 4d는 본 발명의 구현 예에 따른 반응 챔버 커버 및 반응 챔버의 분해 조립 사시도이다.
도 5는 트롬빈 혈청을 수확하기 위한 배열과 함께 대표적인 조립된 반응 챔버의 도면이다.
도 6은 트롬빈 혈청을 수확하기 위한 대표적인 반응 챔버와 연관하여 사용하기 위한 주사기와 함께 대표적인 반응 챔버의 도면이다.
도 6a는 필요의 시점에서 피브린을 형성하기 위해 수확된 트롬빈을 전달하기위해 사용된 분무 팁 어플리케이터 (spray tip applicator)의 종래의 기술 도면이다.
도 7은 본 발명의 구현 예에 따른 대표적인 반응 챔버로부터 트롬빈 혈청을 수확하는 단계를 예시하는 도면이다.
도 8은 자신의 중량을 지지하기에 충분해 강한 형성 피브린겔을 나타낸다.
하기 상세한 설명은 기술분야의 당업자가 본 발명의 다양한 관점 및 실시 예를 만들고 사용하는 것이 가능하도록 제공된다. 특정 물질, 기술 및 적용의 설명은 오직 실시 예로서 제공된다. 여기에 기재된 실시 예에 대한 다양한 변형은 기술분야의 당업자에 의해 용이하게 명확해질 수 있고, 여기서 정의된 일반적 원리는 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 다른 실시 예 및 적용들에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 기재되고 나타낸 실시 예에 대해 제한되는 것이 아니라, 첨부된 청구항과 일치하는 범주에 따르는 것으로 의도된다.
먼저, 도 2를 참조하면, 바람직한 구현 예에서 본 발명의 절차는 하기 네 단계를 포함하고, 이것은 바람직하게는 연속적으로 발생한다: 1) 활성화된 응혈원제 표면은 자유 칼슘 이온의 존재하에 적격인 응고 연쇄반응 상태 (competent)인 제1 생물학적 유체 분취액을 조합하고, 그 다음 약 10분 동안 배양을 통해 준비된다; 2) 활성화된 응혈원제는 그 다음 약 10 시간까지의 기간 동안 저장될 수 있다; 3) 상기 제1 혈액 유체의 첨가로부터 1 분 내지 10 시간 사이 및 예상된 트롬빈이 요구된 (계획된 트롬빈 사용) 경우의 시간에서, 생물학 유체 및 자유 Ca++이온의 부가적인 분취액은 활성화된 응혈원제에 첨가된다; 및 4) 나중에 형성되는 피르린겔은 그 다음 수확될 수 있는 트롬빈 혈청을 방출하기 위해 분쇄된다. 상기 트롬빈은 피브린을 발생시키기 위해 피브리노겐 공급원에 적용될 수 있다. 상기 트롬빈은 단독 액체로 통상적으로 적용될 수 있거나, 미스트 (mist)로 분무되거나 또는 젤라틴 스폰지, 산화된 재생 셀룰로오즈 및 미세섬유성 (microfibrillar) 콜라겐 또는 "글루" 또는 "겔"을 생성하기 위해 피브리노겐과 조합된 것을 포함하는 흡착가능한 지혈제 (hemostatic agents)와 같은, 또 다른 캐리어와 함께 사용될 수 있다.
이러한 적용의 목적을 위하여, "활성화된" 응혈원제 및 응혈원제는 같은 것이 아닌 것에 주목해야 한다. 활성화된 응혈원제는 활성화되지 않는 응혈원제보다 훨씬 더 빠른 속도에서 혈장 겔화를 유발할 것이다. 식별 계획에 있어서, 활성화된 응혈원제는 상기 항응혈제로서 구연산염을 함유하는 신선한 냉동 혈장에서 겔화를 유발하는데 각각 응혈원제 샘플이 걸리는 시간을 두 개의 샘플과 비교하여 식별될 수 있고, 여기서 상기 혈장은 이의 의도된 사용인 두 시간 내에 해동된다. 구체적으로, 제1 12mm x 75 mm 폴리스티렌 시험관에, 혈액 유체와 이미 접촉한 0.5 그램의 응혈원제는 첨가된다. 제2 유사 시험관에 있어서, 혈액 유체와 전에 접촉하지 않은 동일한 응혈원제는 대조구로서 첨가된다. 각각의 시험관에 상기 항응혈제로서 구연산염을 함유하는 2 ml의 해동된 신선한 냉동 혈장은 첨가되고, 여기서 상기 혈장은 이의 의도된 사용의 2 시간 내에 해동되고, 영점 시간으로 첨가의 시간을 기록한다. 각 시험관에 액체 혈장이 겔로 전환되기 위해 걸리는 시간의 길이는 기록되고, 만약 혈장 겔화를 유발시키는 시험 응혈원을 위한 대기 시간이 혈장 겔화를 유발시키는 대조구 응혈원을 위한 시간보다 두 배 이상 빠르다면, 상기 시험 응혈원은 활성화된 응혈원제로 결정된다. 만약 혈장 겔화를 유발시키는 시험 응혈원을 위한 대기 시간이 혈장 겔화를 유발시키는 대조구 응혈원에 대한 시간보다 두 배 미만으로 빠르다면, 상기 시험 응혈원은 활성화된 응혈원제가 아니라고 결정된다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 수확된 트롬빈은 일시적으로 안정하고, 실온에서 저장 30분 이내에 피브린을 형성하기 위해 피브리노겐 공급원에 첨가될 수 있다는 것에 또한 주목된다. 만약 피브린의 빠른 형성이 요구된다면 (빠른 혈전 시간), 상기 트롬빈을 수확한 후, 15분 이내 및 좀더 바람직하게는 즉시 (5분 이내) 수확된 트롬빈과 피브리노겐을 접촉시키는 것이 바람직하다. 만약 계획된 트롬빈 사용이 지연된다면, 상기 트롬빈은 얼음 (<10℃)에 저장될 수 있고, 이것은 3 시간 이내 및 좀더 바람직하게는 60분 이내에서 사용될 수 있도록 상기 트롬빈의 안정성을 상당히 향상시킬 것이다.
다공성 막 (예를 들어, 20 내지 80 마이크론 기공 크기)을 함유하는 필터를 통해 트롬빈 용액을 짜내는 것은 응혈원제를 보유할 것이고, 피브린 미립자 물질을 제거할 것이며, 그렇지 않으면 더 작은 오리피스 (orifice)를 통해 분무하거나 또는 도 6a에서 나타낸 바와 같은 장치를 사용하여 상처 부위 상에 박형 튜브를 통해 트롬빈을 짜내어 트롬빈을 방지할 수 있다. 도 6a는 분무 팁 어플레케이터의 종래의 도면이고, 여기서 하나의 주사기는 피브리노겐 공급원으로 채워지고, 상기 제2 주사기는 트롬빈 혈청을 채워지며, 여기서 상기 두 개 주사기의 내용물은 이들이 피브린 형성에 기인하여 고체가 빠르게 되고, 실런트로서 작용하는 액체로서 혼합물을 운반하는 에어로졸 분무를 생성하기 위한 분사기 요소 (atomizer element)를 통해 분출됨에 따라 혼합된다.
도 4a-도 4d를 참조하면, 본 발명의 하나의 관점은 나타낸다. 도 4a - 도 4c는 방법을 실행하기 위해 사용된 장치의 다양한 관점을 나타낸다. 상기 장치는 반응 챔버 (2)를 감싸는 케이싱 (1)을 포함한다. 상기 반응 챔버 (2)는 바람직하게는 넓은 말단 (2a) 및 좁은 말단 (2b)를 갖는 원추형 챔버이다. 넓은 말단 (2a)은 상기 넓은 말단 (2a)에서 개구에 압입 끼워맞추도록 구성된 캡 구조물 (3)을 갖는다. 좁은 말단 (2b)은 어댑터 (adapter) (4)를 수용하도록 구성된다. 도 4d를 참조하면, 상기 도면은 본 발명의 구현 예에 따른, 캡 구조물 (3) 및 어탭터 (4)의 분해조립도 (exploded view)를 나타낸다. 상기 좁은 말단 (2b)은 노즐-유사 구조 (2c)를 형성하도록 구성되고, 상기 노즐 유사 구조 (2c)는 어댑터 (4)에 연결된다 (도 4a 내지 도 4c 참조). 상기 어댑터 (4)는 이중 루어 암형 (luer female) 어댑터 (5)를 포함한다. 상기 이중 루어 암형 어댑터 (5)는 제1 말단 (5a) 및 제2 말단 (5b)를 갖는다. 5a는 노즐-유사 구조 (2c)에 적합하게 채택된다. 5b는 무-바늘 진입 포트 (6)의 제1 말단 (6a)을 수용하도록 채택된다. 상기 무-바늘 진입 포트 (6)의 제2 말단 (6b)은 나사 구조 (threaded structure) (6b)를 형성하도록 구성된다. 상기 무-바늘 진입 포트 (6)의 나사 구조 (6b)는 캡 (7)에 연결된다. 상기 캡 (7)은 무-바늘 진입 포트 (6)의 오염을 방지한다. 상기 캡 구조물 (3)은 실 (seal) (8)을 포함한다. 상기 실 (8)은 환형 구조이고, 내부 고리 (8a)은 캡 (9)에 의해 수용되기 위한 구성이고, 상기 외부 고리 (8b)는 용기 (2)의 넓은 말단으로 꼭끼워 맞추도록 구성된다. 상기 캡 (9)은 여과 막 (10)을 수용하고 보유하도록 구성된 오목부 (9a)를 갖는다. 상기 여과 막 (10)은 리테이너 (retainer) (11)를 통하여 캡 (9)의 오목부 (9a)에 보유된다.
여기에 기재된 장치는 누수 없이, 바람직하게는 미생물적 오염의 위험을 감소시키기 위해 개방된 실내 공기와 직접 접촉한 유체 없이, 유체를 도입, 함유 및 제거하기 위한 수단을 갖는, 멸균, 비-발열성 유체 경로 용기를 포함하고, 상기 용기는 또한 상기 응고 연쇄반응의 활성화를 위한 반응 챔버로서 작용하며, 상기 반응 챔버는 사용되는 의도된 생물학적 유체의 부피에서 상기 응고 연쇄반응을 효과적으로 활성화하기 위한 충분한 양 및 표면적으로 응혈원제를 함유하고, 상기 반응 챔버는 각자의 배양 단계 동안 생물학적 유체와 응혈원제의 친밀한 접촉을 가능하게 하는 모양을 더욱 가지며, 상기 응혈원제보다 더 큰 질량을 갖는 상대적으로 더 큰 분리된 물체를 함유시켜 바람직하게 이로부터 형성된 피브린겔을 분쇄하기 위한 수단을 더욱 함유하며, 상기 반응 용기는 작업자에 의해 반응 챔버의 기계적 교반 (예를 들어, 쉐이킹)이 더 큰 분리된 물체로 더 작은 응혈원제를 둘러싸고 있는 피브린겔의 파쇄 및 이동을 유발하도록 상기 챔버 내에 충분한 내부 표면적을 갖도록 설계된다. 상기 생물학적 유체, 응혈원제 및 분리된 큰 물체의 조합된 부피의 적어도 두 배의 부피 비는 바람직하다. 상기 겔의 분쇄시, 상기 반응 챔버 내에 분리된 큰 물체의 움직임은 분쇄가 달성되는 것을 작업자에게 알리는 들을 수 있는 소리를 만든다. 상기 분리된 더 큰 물체는 의료용 플라스틱 구 또는 유리구 (glass spheres)로 만들어진다. 이러한 분리된 큰 물체의 바람직한 모양 및 직경은 의료용 플라스틱 또는 유리로 구성된 5 내지 15 mm 직경을 갖는 구이다. 상기 반응 챔버는 바람직하게는 의도된 혈액 유체 분취액의 부피의 10% 미만인 용액의 양으로 용액 내에 칼슘 이온의 도입을 위한 수단을 제공하고, 더욱이 여기서 상기 칼슘 이온은 염화칼슘으로부터 유래된다. 첨가되기 위해 요구된 칼슘 이온의 양은 기술분야의 당업자에게 실험에 의해 쉽게 결정될 수 있지만 일반적으로 발생하는 혈액 분취액을 재석회화하기에 충분해야 하고, 여기서 첨가된 염화칼슘의 최종 농도는 5 내지 30 mM 및 좀더 바람직하게는 10 내지 20 mM이다. 칼슘은 시스템에 주입된 혈장이 상기 반응 챔버로 이를 운반할 것이기 때문에 스왑 밸브 (swabbable valve) 이후에 유체 경로 어느 곳에서나 첨가될 수 있다. 이하 좀더 상세하게 기재된 유용하지만 덜 바람직한 실시 예는 건조 칼슘이 스톱콕 (stopcock) 및 일-원 덕빌 (one-way duck bill) 밸브 사이에 놓일 수 있는 것을 제공한다.
다음은 본 발명의 바람직한 구현 예에 따라 사람 혈장으로부터 트롬빈 혈청을 제조하기 위한 대표적인 방법의 상세한 설명이다.
상기 방법을 실행하기 위해 사용된 대표적인 장치의 도면은 도 5에 나타낸다. 이러한 대표적인 구현 예에 있어서, 상기 장치는 응혈원제 (12)를 갖는 반응 챔버 (2)를 포함한다. 상기 반응 챔버 (2)는 또한 상기 피브린겔을 분쇄하기 위한 분리된 구 (13)을 갖는다. 흐름 조절 핸들 (14a)을 포함하는 4-원 스톱콕 (14)은 상기 반응 챔버 (2)로부터 및 반응 챔버 (2)로 유체의 흐름을 조절하기 위해 제공된다. 일-원 덕빌 밸브 (15)는 상기 반응 챔버 (2)와 연결되고, 상기 반응 챔버 (2)의 밖으로 빠져나가는 유체를 방지한다. 약 20 마이크론의 기공 크기를 갖는 막을 함유하는 필터 하우징 (16)은 응혈원제 및 피브린 입자를 포함하는 미립자 물질을 보유하기 위해 4-원 스톱콕 (14)의 말단 중 하나에 연결된다. 상기 장치는 상기 반응 챔버 (2)의 안 및 밖으로 유체를 전달하는 동안 개방 공기와 접촉하는 것을 피하여 상기 장치의 생물학적 안전성을 개선하기 위해 스왑 일-원 무-바늘 진입 포트 (swabbable one-way needle-less access port) (17)을 더욱 포함한다.
반응 챔버의 제조. 비록 다양한 적절한 용기가 사용될 수 있지만, 이러한 대표적인 구현 예에 있어서, 60 ml 주사기는 편리한 원형 (convenient prototype) 반응 챔버 (2)를 제공한다. 상기 반응 챔버 (2)는 상기 주사기 플런저를 제거하고, 응혈원 (12)으로서 유리구를 첨가하여 제조될 수 있다. 이러한 대표적인 방법, 및 하나의 실시 예에 있어서, 0.5 및 5 mm 사이의 직경을 갖는 20 그램의 유리 비드는 응혈원제 (12)로서 사용될 수 있다. 부가적으로, 7 그램의 큰 폴리스티렌 비드 (10 mm 직경) 또는 다른 적절한 물질은 형성된 피브린겔을 분쇄하기 위해 고체 분리된 물체 (13)로서 반응 챔버에 첨가될 수 있다. 상기 플런저는 그 다음 형성된 피브린겔을 파쇄 (분쇄)하기 위하여 흔드는 동안 이동하는 분리된 큰 비드 (13)를 위한 충분한 공간을 생성하기 위해 상기 주사기 상에 50 mL 표시된 위치로 다시 돌릴 수 있다. 상기 플런저는 이동이 요구되지 않고, 트롬빈 혈청 생산의 지속 기간 동안 고정된 위치에서 남아있을 수 있다. 본 발명의 상업적인 구현 예는 반응 용기로서 주사기 대신에 주입-주형 용기 (injection-molded vessel)를 선택적으로 사용할 수 있다. 핸드 레버 (hand lever) (14a)를 갖는 4-원 스톱콕 (14)은 상기 반응 챔버 안 및 밖으로 유체 이동의 방향을 조절하는 수단을 제공하기 위하여 바람직한 구현 예에 포함된다. 상기 스톱콕 (14)은 제1 위치 A로 돌리고, 여기서 상기 유체 통로는 상기 제1 무-바늘 진입 포트 (17)로부터, 일원 덕빌 밸브 (15)를 통해, 및 그 다음 반응 챔버 (2)로 (본 실시 예에서 주사기 배럴) 이동한다. 도 6은 트롬빈 혈청을 수확하기 위한 대표적인 반응 챔버와 접합하여 사용하기 위한 주사기와 함께 대표적인 반응 챔버의 도면이다. 여기서 기재된 바와 같은 대표적인 반응 챔버는 생물학적 유체 및 칼슘 이온 함유 유체와 같은 유체를 전달하기 위해 다른 주사기 (19, 20 및 21)와 접합하여 사용된다. 상기 유체는 상기 스톱콕이 위치 A에 있는 경우 상기 장치에 주입될 수 있다. 상기 스톱콕 핸들 (14a)은 제2 위치 B로 돌릴 수 있고, 여기서 상기 유체 경로는 제2 무-바늘 진입 포트 (18)로부터, 필터 (16)를 통해, 그 다음 상기 반응 챔버 (2)로 (본 실시 예에서 주사기 배럴) 이동한다. 이러한 스톱콕 핸들 위치 B에 있어서, 주사기는 제2 스왑 진입 포트에 부착될 수 있고, 상기 주사기 플런저는 상기 주사기로 및 필터 (16)를 통해 반응 챔버 (2)의 밖으로 인출될 트롬빈 혈청을 결과하는 저압 부피 또는 진공을 생성하기 위해 뒤로 당겨 빼낼 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 있어서, 응혈원제 (너무 작아서 도면에 도시되지 않음) 및 피브린 미립자를 보유하지만 발생하는 트롬빈 혈청의 흐름을 가능하게 하는 충분하게 작은 기공 메쉬 크기를 갖는, 다공성 막을 갖는 필터는, 포함된다. 상기 장치의 미생물적 안정성은 상기 장치에 진입하는 주사기에 대한 누수-없는 무균성 스왑 진입 포트를 포함하여 달성된 폐쇄계 (closed system)를 제공하여 향상시킬 수 있다.
CaCl2 용액의 제조. 354 mM 염화칼슘 헥사하이드레이트 (Sigma, St. Louis, Mo, Product No. 21110-1KG-F, Lot #BCBC3343, MW 219.08) 용액은 200 ml의 물에 15.5 그램을 용해시켜 준비될 수 있다. 각 5 ml의 구연산염 항-응고된 혈액 유체에 대하여, 0.2 ml의 CaCl2 용액은 약 14 mM의 최종 농도로 혈액 유체 용액을 재석회화하기 위해 첨가될 수 있다. 1 mL 주사기는 상기 스왑 포트를 통해 반응 챔버로 CaCl2을 전달하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 건조 칼슘은 절차 시작 전에 상기 챔버에 존재할 수 있고, 건조 칼슘의 존재는 방법에서 나중 단계에 사용되기 위한 액체 칼슘에 대한 필요를 제거한다.
혈액 유체. 비-제한 예에 의해, 구연산염 항-응고된 전혈 또는 구연산 처리된 항-응고된 사람의 신선한 혈장은 실험적 목적을 위해 간편한 혈액 유체로서 사용될 수 있다.
트롬빈 혈청의 분무 적용. 상기 트롬빈 혈청을 수확시, Micromedics Corp., St. Paul, Minnesota에서 제작된 것과 같은 분무 팁 어플리케이터 (도 6a에서 종래 기술로 나타낸 바와 같은 분무 팁 SA-3674을 갖는 Fibrijet Blending 커넥터를 참조)는 피브리노겐의 공급원으로서 해동된 혈장의 또 다른 분취액과 조합하여 트롬빈 혈청을 적용하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 트롬빈 혈청의 생산을 위한 바람직한 절차의 하나의 구현 예는 이하 상세하게 기재된다:
단계 1: 전술된 바와 같이 제조된 반응 챔버는 제1 배양 반응물로 적재된다:
a. CaCl2 용액을 함유 1 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 반응 챔버에 부착되고, 0.2 mL는 주입되고, 그 다음 주사기는 분리된다.
b. 5 ml의 혈장을 함유하는 5 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 상기 반응 챔버에 부착되고, 모든 혈장은 상기 반응 챔버에 주입되며, 그 다음 상기 주사기는 분리된다.
c. 수평 위치로 유지된 반응 챔버로, 상기 내용물은 응혈원제 및 분리된 큰 플라스틱 비드의 이동을 유발하기에 충분하게 반응 챔버를 흔들어 상기 응혈원제를 완전하게 젖도록 혼합된다.
단계 2. 제1 배양
a. 주사기는 균일하게 분포된 응혈원제와 함께 평평한 수평면상에 놓이고, 상기 제1 배양 주기는 시작되며, 이것은 약 10분 내지 약 10 시간일 수 있다.
b. 약 10분 후, 충분한 트롬빈은 불용성 피브린이 되도록 생물학적 유체에서 가용성 피브리노겐을 전환하여 발생되어, 제1 피브린겔의 형성을 유도한다. 상기 피브린겔은 혼합물의 유동성의 손실에 기인한 외관 검사 및 상기 반응 챔버가 수직 위치에서 유지된 경우일지라도 반응 벽에 케이크가 되는 응혈원 및 플라스틱 비드의 관측에 의해 쉽게 알 수 있다.
단계 3. 트롬빈 혈청이 사용을 위해 요구된 경우, 상기 반응 챔버는 제2 배양 반응물로 적재된다.
a. CaCl2 용액을 함유하는 1 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 반응 챔버에 부착되고, 상기 주사기가 분리되기 전에 0.2 mL는 주입된다.
b. 5 ml의 혈장을 함유하는 5 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 상기 반응 챔버에 주입된다.
c. 수직 위치로 유지되는 반응 챔버로, 제1 형성된 피브린겔은 분쇄되고, 상기 챔버 내용물은 모든 비드가 반응 챔버 내에서 자유롭게 이동할 때까지 (대략 3 내지 10초) 반응 챔버를 상하로 흔들어 혼합된다.
단계 4. 제2 배양
a. 주사기는 균일하게 분포된 유리 비드와 함께 평평한 수평면상에 놓이고, 상기 제2 배양 사이클은 시작되며, 이것은 약 1 분 내지 약 60분일 수 있다. 상기 트롬빈 혈청은 제2 피브린겔이 형성되자마자 수확되도록 준비된다. 상기 피브린겔은 혈장이 액체 상태로 더 이상 존재하지 않기 때문에 눈에 띄고, 상기 비드 내용물은 반응 용기 벽에 안정하게 회반죽화된다. 이러한 방법은 일시적으로 안정한 트롬빈 제제를 생산하고, 피브리노겐의 트롬빈 응혈 활성은 피브린겔에서 저장 시간에 따라 감소한다. 따라서, 트롬빈 혈청에 존재하는 가장 큰 크롬빈 반응성을 위하여, 피브린겔을 분쇄하고, 상기 피브린겔이 형성되자마자 하기에 기재된 바와 같이 트롬빈 혈청을 수확하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 제2 피브린겔의 형성된 후 약 15분 이하, 좀더 바람직하게는 제2 피브린겔이 형성된 후 약 5분 이하, 및 가장 바람직하게는 제2 피브린겔이 형성된 후 약 1분 이하).
단계 5. 10 ml 주사기를 사용하여 트롬빈 혈청 수확
a. 제2 피브린겔이 형성된 후, 상기 반응 챔버는 피브린겔을 파쇄하기 위해 상기 챔버에 비드를 제자리를 벗어나기에 충분한 힘으로 교반된다.
b. 다공성 막을 갖는 필터는 10 ml 수확 주사기로 미립자 물질의 통과를 방지하기 위해 반응 챔버에 부착된 스왑 포트에 부착된다.
c. 상기 반응 챔버는 10 ml 주사기가 상기 반응 챔버 아래에 있도록 수직위치에 배치되고, 상기 트롬빈 혈청은 상기 반응 챔버가 원하는 양의 트롬빈 혈청 (약 5 ml 까지)이 도 7에서 나타낸 바와 같이 수확될 때까지 반응 챔버 내를 저압 영역 또는 진공으로 생성하기 위해 10 ml 주사기의 플런저에 뒤로 당겨 수확되며, 도 7은 진공을 생성하기 위해 주사기 프런저 (21)를 뒤로 당겨 달성된 대표적인 반응 챔버 (2)로부터 트롬빈 혈청의 수확하고, 원하는 양의 트롬빈 혈청이 상기 주사기 (21)에 유입하도록 반응 챔버를 비울 때까지 기다리는 것을 나타내는 예시이다.
d. 상기 수확된 혈장은 실온에서 저장될 수 있고, 제2 혈액 유체 분취액의 첨가의 15분 이내에 피브린을 형성하기 위해 피브리노겐과 접촉하는데 사용될 수 있거나, 또는 습식 얼음 (<10℃)에 저장될 수 있고 제2 혈액 유체 분취액의 첨가의 1 시간 내에 피브린을 형성하기 위해 피브리노겐과 접촉하는데 사용될 수 있다.
단계 6. (선택적) 만약 부가적인 트롬빈 혈청 제제를 만들기를 원한다면, 단계 3, 4, 및 5는 적어도 6회까지 혈액 유체의 신선한 분취액을 사용하여 반복될 수 있다.
상기 장치에서 혈액 유체, 칼슘 및 응혈원제를 혼합하는 초기 접촉 동안 상기 응혈원제 표면상에 형성 당시의 프로트롬비나제 효소 복합체가 임상적으로 유용한 적어도 10 시간 내지 24 시간 미만 동안 프로트롬빈을 트롬빈으로 쉽게 전환할 수 있는 지속된 효소 활성의 계속적인 기능적 상태로 남는다는 발견은 아래에서 정리된 실험에서 예시된다.
본 연구에 있어서, 6 개의 반응 챔버는 전술된 바와 같이 제조된다. 이러한 실험 동안 사용된 대표적인 혈액 유체는 신선한 혈장이다. 상기 반응 챔버에 혈장 및 칼슘의 첨가 (단계 1)는 영점 시간으로 지명된 시간에서 모든 6 개 주사기에 대해 전술된 바와 같이 수행된다. 제1 배양 주기의 기간 (단계 2)은 0시간, 1시간, 3 시간, 10 시간, 12 시간, 및 24 시간의 배양 시험 조건을 갖도록 각각의 6개 주사기에 대하여 변화된다. 상기 반응 챔버에 제2 칼슘 및 혈장 분취액의 첨가 (단계 3)는 전술된 바와 같은 제1 배양 시간의 끝에서 수행된다. 상기 제2 배양 (단계 4)은 제2 겔을 형성하는데 요구된 시간으로 고정되고, 이것은 기록된다. 상기 트롬빈 혈청의 수확은 전술된 바와 같이 수행되고 (단계 5), 상기 트롬빈 활성은 트롬빈 혈청 수확 후 5분 후에 측정한다. 이러한 실험에서 트롬빈 활성은 DiagnosticaStago Inc., Troy Hills, New Jersey에서 제조된 STart 지혈 분석기를 사용하여 피브리노겐 혈전 시간을 기록하여 측정된다. 12시간 이상의 저장 시간은, 더 낮은 트롬빈 활성에 기인하여 상기 피브리노겐 응혈에 대한 시간이 증가하기 시작함에 따라, 응혈원 활성화의 손실을 결과하는 것으로 하기 표 1에 나타낸 데이터는 입증하지만, 12 시간에서조차도 24 시간 저장 후의 경우에서와 같이, 완전하게 상실하였다. 흥미롭게도, 각 배치의 제조된 트롬빈은 부가적인 10 시간 이상동안 응혈원 활성을 연장시킨다. 하기 표 1에서 데이터는 실온에서 적어도 10 시간의 저장시간 동안 활성화된 응혈원제의 안정성을 입증한다.
응혈원제의 활성화의 지속성에 대한 저장 시간의 영향
반응 챔버 장치 # 제1 및 제2 배양 시간 (시) 사이의 경과 시간 (단계 2 및 3) 혈장의 제2 분취액 및 칼슘의 첨가 후에 형성을 위한 제2 겔에 대해 요구된 시간 (단계 4) 수확된 트롬빈 혈청 활성 (초로 측정된 응고 시간) 응혈원제의 상태
1 0 < 1 분 < 10 초 활성화
2 1 < 1 분 < 10 초 활성화
3 3 < 1 분 < 10 초 활성화
4 10 <2 분 < 10 초 활성화
5 12 < 3 분 < 20 초 활성화
6 24 > 5 분 > 120 초 비-활성화
트롬빈 혈청의 다중 제제가 단일 장치로부터 유도될 수 있다는 개념의 증거를 입증하기 위한 실험은 전술된 방법에 따라 수행된다. 여기서, 트롬빈 혈청 제제는 단일 장치를 사용하여 30분 간격으로 다섯 번 해동된 신선한 냉동 혈장으로부터 제조된다. 하기 표 2에서 데이터는 단일 장치가 주문시 고 반응도를 갖는 트롬빈을 생산하기 위해 반복적으로 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 상기 응혈원제는 0.2 mL의 CaCl2 용액 및 5 ml의 신선한 해동된 혈장을 상기 반응 챔버에 첨가시켜 활성화되고, 제1 겔화가 발생할 때까지 배양되며, 이것은 대략 5분 정도 요구된다. 이 시점에서, 상기 응혈원 표면은 활성화되고, 주문시 트롬빈 혈청을 생산할 수 있다. 트롬빈 혈청을 생산하기 위하여, 부가적인 0.2 mL의 CaCl2 용액 및 5 ml의 혈장은 상기 반응 챔버에 첨가되고, 제2 겔화가 발생할 때까지 배양되며, 이것은 대략 30초가 요구된다. 상기 겔이 형성된 후 약 1분 동안 유지한 후, 상기 장치는 상기 겔을 파쇄하기 위해 교반되고, 약 5 ml의 트롬빈 혈청을 수확한다. 격리된 혈청에서 트롬빈 반응성은 혈전 시험을 수행하여 결정된다. 대표적인 혈전 시험에 있어서, 0.5 ml의 트롬빈 혈청은 1.5 mL 엔펜도르프 튜브 (Eppendorf tube)에서 혈장과 같은 0.5 ml의 피브리노겐 공급원에 첨가된다. 상기 샘플은 반전 (inversion)에 의해 혼합되고, 고체 또는 겔이 되는 액체 용액에 대해 요구된 시간은 관찰에 의해 결정된다. 데이터는 단일 장치가 적어도 4 배치의 5 ml 트롬빈 혈청/배치를 생산할 수 있는 것을 입증한다.
트롬빈 혈청의 다중 배치의 단일 장치 제조의 입증
응혈원제를 접촉하는 혈액 분취액 응혈원제에 제1 혈액 분취액 첨가 후 그 다음 첨가된 혈액 분취액의 경과 시간 반응 챔버에서 피브린겔을 형성하기 위해 요구된 응혈원제의 관찰된 배양시간 혈액 분취액의 첨가 및 응고 시험 사이의 경과 시간 관찰된 응고 시간
1차 해당 없음 (NA) 5 분 트롬빈 혈청의 수확 없음 NA
2차 30 분 ~30 초 1 분 <15 초
3차 60 분 ~30 초 1 분 <15 초
4차 90 분 ~30 초 1 분 <15 초
5차 120 분 ~30 초 1 분 <15 초
실험은 또한 본 발명의 교시에 따라 제조된 트롬빈 혈청의 안정성을 측정하기 위해 수행된다. 여기서, 트롬빈 혈청 제제는 단일 장치를 사용하여 해동된 신선한 냉동 혈장으로부터 제조된다. 상기 응혈원제는 0.2 mL의 CaCl2 용액 및 5 ml의 신선한 해동된 혈장을 상기 반응 챔버에 첨가시켜 활성화되고, 제1 겔화가 발생할 때까지 배양되며, 이것은 대략 5분이 요구된다. 트롬빈 혈청을 발생하기 위하여, 부가적인 0.2 mL의 CaCl2 용액 및 5 ml의 혈장은 상기 반응 챔버에 첨가되고, 제2 겔화가 발생할 때까지 배양되며, 이것은 대략 30초가 요구된다. 상기 겔이 형성된 후 약 1분 동안 유지한 후, 상기 장치는 상기 겔을 파쇄하기 위해 교반되고, 약 5 ml의 트롬빈 혈청은 수확된다. 상기 트롬빈 혈청 제제는 그 다음 실온 또는 <10℃에서 저장되고, 상기 트롬빈 반응성은 이후 주기적으로 측정된다. 격리된 혈청에서 트롬빈 반응성은 혈전 시험을 수행하여 결정된다. 상기 트롬빈 혈청에 대한 혈전 시간은 실온 및 <10℃에서 저장된 경우 모두에 대한 안정성을 확인하기 위해 30분에 걸쳐 측정된다. 상기 혈전 시간은 3 시간 주기에 걸쳐 점진적으로 증가한다. 가장 빠른 응고 시간 (예를 들어, 가장 큰 트롬빈 농도)는 트롬빈 혈청을 수확한 직후 달성된다. 빠른 응혈 활성은 제조 후 최초 15분 동안 남아있고, 90초 미만인 혈전 시간으로 30분 이상 동안 지속한다. 상기 트롬빈 혈청이 냉장에서 저장된 경우, 빠른 응혈 활성은 60분에 걸쳐 잘 유지되었고, 적어도 3 시간까지 지속한다.
(액체 칼슘과 대립하는) 건조 염화 칼슘이 사용된, 선택적 구현 예를 참조하면, 또 다른 구현 예에 있어서, 이러한 건조 염화칼슘은 장치의 제작 시간에서 반응 챔버에 도입될 수 있다. 칼슘이 존재함으로, 도입된 각각 혈액 유체 분취액을 접촉하는 것은 필수적이다. 이러한 구현 예는 작업자에 의해 요구된 단계의 수가 감소되고, 결론적으로 오류의 위험을 감소시키는 장점을 제공한다.
이러한 건조 칼슘의 선택적 구현 예 중 하나의 대표적인 경우에 있어서, 하나의 실험은 단일 장치를 사용하여 해동된 신선한 냉동 혈장으로부터 제조된 트롬빈 혈청 제제를 활용한다. 상기 장치는 응혈원제를 함유하는 반응 챔버에 0.4 ml의 CaCl2 용액 (200 ml의 순 에탄올에 15.5 그람을 용해시켜 제조된 354 mM 염화칼슘 헥사하이드레이트)을 첨가시켜 제조된다. 상기 에탄올은 상기 반응 챔버에 건조 칼슘염을 떠나 증발된다. 트롬빈 혈청은 액체 염화칼슘 용액의 첨가 없이 5 ml의 구연산염 항-응고된 혈장으로 응혈원 시약을 활성화시켜 건조 칼슘염을 함유하는 이러한 장치로 제조된다. 상기 활성화된 응혈원은 그 다음 부가적인 5 ml의 구연산염 항-응고된 혈장을 첨가하여 트롬빈 혈청을 제조하는데 사용된다. 명목상 두 배 사용된 혈장의 제1 분취액에 존재하는 칼슘의 초기 농도가 상기 응혈원제의 성공적 형성을 억제하지 않는 것은 놀라운 것이다. 활성화된 응혈원제의 형성에서 이러한 억제는 상기 반응 챔버에서 건조된 칼슘의 양이 0.8 ml의 CaCl2 용액 (354 mM 염화칼슘)까지 증가된 경우 관찰된다.
비록 일반적으로 많은 적용에 대해 덜 바람직할지라도, 이-단 (two-stage) 트롬빈 혈청 생산의 현재의 발명과 트롬빈을 안정화하기 위해 에탄올을 사용하는 종래의 기술의 교시를 조합하는 것을 가능하다. 도 3은 이러한 구현 예에 있어서 현재 발명의 절차를 나타내고, 여기서 상기 이-단 절차는 하기 4 단계를 포함하고, 이것은 바람직하게는 연속적으로 발생한다: 1) 활성화된 응혈원제 (물질의 표면상에 프로트롬비나제 효소 복합체)는 자유 칼슘 이온의 존재하에서 응고 연쇄반응 상태 (competent)인 제1 생물학적 유체 분취액을 조합하고, 그 다음 적어도 약 10분 동안 상기 혼합물을 배양하여 제조되고; 2) 활성화된 응혈원제는 그 다음 약 10 시간까지 저장될 수 있으며; 3) 트롬빈을 사용하기 위해 계획된 시간에서, 15 내지 25% 에탄올 (v/v) 및 자유 Ca++로 보충된 생물학적 유체의 부가적인 분취액은 활성화된 응혈원제로 첨가될 수 있고; 및 4) 나중에 형성되는 피브린겔을 분쇄된다. 에탄올로 보충된 상기 트롬빈 혈청은 그 다음 수확될 수 있다. 에탄올로 보충된 수확된 트롬빈은 <10℃에서 저장된 경우 특히 안정성이 향상되었고, 제2 혈액 유체 분취액의 첨가의 10 시간 내에 피브린을 형성하기 위해 피브리노겐과 접촉하는데 사용될 수 있다. 덜 바람직하게는, 이것은 제2 혈액 유체 분취액의 첨가의 6 시간 내에 발생한다. 본 발명의 구현 예에 따른 트롬빈 혈청의 생산을 위한 절차는 이하 상세하게 기재된다:
단계 1: 전술된 바와 같이 제조된 반응 챔버는 제1 배양 반응물로 적재된다:
a. CaCl2 용액을 함유하는 1 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 반응 챔버에 부착되고, 0.2 mL는 주입되고, 그 다음 상기 주사기는 분리된다.
b. 5 ml의 혈장을 함유하는 5 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 상기 반응 챔버에 부착되고, 모든 혈장은 상기 반응 챔버에 주입되며, 그 다음 상기 주사기는 분리된다.
c. 수평 위치로 유지된 반응챔버로, 상기 내용물은 응혈원제 및 분리된 큰 플라스틱 비드의 이동을 유발하기에 충분하게 반응 챔버를 크게 흔들어 상기 응혈원제를 완전하게 젖도록 혼합시킨다.
단계 2. 제1 배양
a. 주사기는 균일하게 분포된 응혈원제와 함께 평평한 수평면상에 놓이고, 상기 제1 배양 주기는 시작되며, 이것은 약 10 분 내지 약 10 시간일 수 있다.
b. 약 10분 후, 충분한 트롬빈은 불용성 피브린이 되도록 생물학적 유체에서 가용성 피브리노겐을 전환하여 발생되어, 제1 피브린겔의 형성을 유도한다. 상기 피브린겔은 혼합물의 유동성의 손실에 기인한 외관 검사 및 상기 반응 챔버가 수직 위치에서 유지된 경우일지라도 반응 벽에 케이크가 되는 응혈원 및 플라스틱 비드의 관측에 의해 쉽게 알 수 있다.
단계 3. 트롬빈 혈청이 사용하기 위해 요구된 경우, 상기 반응 챔버는 제2 배양 반응물로 적재된다.
a. CaCl2 용액을 함유하는 1 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 반응 챔버에 부착되고, 상기 주사기가 탈착되기 전 0.2 mL는 주입된다.
b. 물에 72% 에탄올 (v/v) 4 ml를 함유하는 5 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 상기 반응 챔버에 부착되고, 상기 주사기 내용물은 상기 반응 챔버에 주입된다.
c. 5 ml의 혈장을 함유하는 5 ml 주사기는 무-바늘 진입 포트를 통해 반응 챔버에 부착되고, 상기 주사기의 전체 내용물은 상기 주사기가 탈착되기 전에 주입된다.
d. 수직 위치로 유지된 반응 챔버로, 1차 형성된 피브린겔은 분쇄되고, 챔버 내용물은, 반응 챔버의 유체 내용물에서 약 20% 에탄올 (v/v)의 최종 농도를 달성하기 위하여, 모든 비드가 상기 반응 챔버 내에서 자유롭게 이동할 때까지 (대략 3 내지 10초) 상기 반응 챔버를 상하로 확고히 흔들어 혼합된다.
단계 4. 제2 배양
a. 주사기는 균일하게 분포된 유리 비드와 함께 평평한 수평면상에 놓이고, 제2 배양 주기는 시작되며, 이것은 약 1 분 내지 약 6 시간일 수 있다. 상기 트롬빈 혈청은 제2 피브린겔이 형성되자마자 수확되도록 준비된다. 상기 피브린겔은 상기 혈장이 액체 상태로 더 이상 존재하지 않기 때문에 눈에 띄고, 상기 비드 내용물은 반응 용기 벽에 안정하게 회반죽화된다. 이러한 방법은 일시적으로 안정한 트롬빈 제제를 생산하고, 피브리노겐의 트롬빈 응혈 활성은 피브린겔에서 저장 시간에 따라 감소한다. 따라서, 트롬빈 혈청에 존재하는 가장 큰 트롬빈 반응성을 위하여, 피브린겔을 분쇄하고, 상기 피브린겔이 형성되자마자 (예를 들어, 제2 피브린겔의 형성된 후 약 15분 이하, 좀더 바람직하게는 제2 피브린겔이 형성된 후 약 5분 이하, 및 가장 바람직하게는 제2 피브린겔이 형성된 후 약 1분 이하) 하기에 기재된 바와 같이 트롬빈 혈청을 수확하는 것이 바람직하다.
단계 5. 트롬빈 혈청 수확
a. 제2 피브린겔이 형성된 후에, 상기 반응 챔버는 상기 챔버에 비드를 제거하기에 충분한 힘으로 교반되어, 존재하는 피브린겔을 파쇄시킨다.
b. 다공성 막을 갖는 필터는 10 ml 수확 주사기로 미립자 물질의 통과를 방지하기 위해 반응 챔버에 부착된 스왑 포트에 부착된다.
c. 상기 반응 챔버는 10 ml 주사기가 상기 반응 챔버 아래에 있도록 수직 위치에 놓이고, 상기 트롬빈 혈청은, 원하는 양의 트롬빈 혈청 (약 5 ml까지)이 도 7에서 나타낸 바와 같이 수확될 때까지, 반응 챔버 내를 저압 영역 또는 진공으로 생성하도록 10 ml 주사기의 플런저를 뒤로 당겨 수확된다. 도 7은 진공을 생성하기 위해 주사기 프런저 (21)를 뒤로 당겨 달성된 대표적인 반응 챔버 (2)로부터 트롬빈 혈청의 수확하는 단계 및 그 다음 원하는 양의 트롬빈 혈청이 상기 주사기 (21)에 유입하도록 반응 챔버를 비울 때까지 기다리는 단계를 예시한다.
d. 상기 수확된 혈장은 실온에서 저장될 수 있고, 제2 혈액 유체 분취액의 첨가 4시간 이내에 피브린을 형성하기 위해 피브리노겐과 접촉하는데 사용될 수 있거나, 또는 습식 얼음 (<10℃)에 저장될 수 있고, 제2 혈액 유체 분취액의 첨가 6 시간 내에 피브린을 형성하기 위해 피브리노겐과 접촉하는데 사용될 수 있다.
단계 6. (선택) 만약 부가적인 트롬빈 혈청 조제가 요구된다면, 단계 3, 4, 및 5는 적어도 6회까지 혈액 유체의 신선한 분취액을 사용하여 반복될 수 있다.
비록 본 발명이 어떤 구현 예에 대하여 나타내고 기재되었을지라도, 균등한 변경 및 변형이 본 명세서를 읽고 이해하는 당업자에게 일어날 수 있음은 자명하다. 특히, 전술된 구성요소에 의해 수행된 다양한 기능과 관련하여, 이러한 구성요소에 사용된 ("수단"을 포함하는) 용어는, 비록 본 발명의 대표적인 구현 예들에서 기능을 수행하는 기재된 구성요소와 구조적으로 균등하지 않을지라도, 별도의 언급이 없는 한, 기재된 구성요소의 명시된 기능 (예를 들어, 기능적으로 균등물)을 수행하는 어떤 구성요소에 상응하는 것으로 의도된다. 부가적으로, 본 발명의 특정 특색이 오직 하나의 구현 예로 개시되지만, 이러한 특색은 제공되거나 또는 특정 적용에 대해 바람직하거나 장점이 있을 수 있는 것과 같은 다른 구현 예들의 하나 이상의 다른 특색과 조합될 수 있다.

Claims (31)

  1. 활성화된 응혈원제를 얻는 단계; 및
    상기 활성화된 응혈원제와 혈액 유체 분취액을 접촉시켜 트롬빈 혈청을 포함하는 혼합물을 형성시키는 단계; 및
    상기 혼합물로부터 상기 트롬빈 혈청을 추출하는 단계를 포함하는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  2. 제1 혈액 유체 분취액과 응혈원제를 접촉시켜 활성화된 응혈원제를 형성시키는 단계;
    상기 활성화된 응혈원제를 저장하는 단계;
    상기 저장된 활성화된 응혈원제와 제2 혈액 유체 분취액을 접촉시켜 트롬빈 혈청을 포함하는 혼합물을 형성시키는 단계; 및
    상기 혼합물로부터 상기 트롬빈 혈청을 추출하는 단계를 포함하는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  3. 제1 혈액 유체 분취액과 응혈원제를 접촉시켜 상기 응혈원제의 표면에 결합된 프로트롬비나제 효소 복합체를 포함하는 활성화된 응혈원제를 형성시키는 단계;
    상기 활성화된 응혈원제를 저장하는 단계;
    상기 저장된 활성화된 응혈원제와 제2 혈액 유체 분취액을 접촉시켜 피브린겔을 포함하는 혼합물을 형성시키는 단계;
    상기 피브린겔을 분말화시키는 단계;
    상기 분말화 단계 이후에, 상기 혼합물로부터 트롬빈 혈청을 추출하는 단계; 및
    상기 추출된 트롬빈 혈청과 피브리노겐을 접촉시켜 피브린을 얻는 단계를 포함하는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  4. 제1 혈액 유체 분취액과 응혈원제를 접촉시켜 상기 응혈원제의 표면상에 프로트롬비나제 효소 복합체를 포함하는 활성화된 응혈원제를 형성시키는 단계;
    상기 활성화된 응혈원제를 저장하는 단계;
    상기 활성화된 응혈원제와 제2 혈액 유체 분취액을 접촉시키고, 여기서 에탄올은 약 15% 내지 25 부피% 사이의 농도로 존재하여 에탄올로 보충된 트롬빈 혈청을 얻고, 피브린겔을 포함하는 혼합물을 형성시키는 단계;
    상기 피브린겔을 분말화시키는 단계;
    상기 분말화 단계 이후에, 상기 혼합물로부터 에탄올로 보충된 트롬빈 혈청을 추출하는 단계; 및
    상기 추출된 에탄올로 보충된 트롬빈 혈청과 피브리노겐을 접촉시켜 피브린을 얻는 단계를 포함하는 에탄올로 안정화된 트롬빈 혈청의 제조방법.
  5. 청구항 1, 2, 3 또는 4에 있어서,
    상기 방법은 단일 헌혈자로부터 혈액 유체를 얻는 단계를 더욱 포함하고, 여기서 상기 혈액 유체 분취액은 상기 혈액 유체로부터 추출되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 얻어진 혈액 유체는 자가수혈 혈액 유체인 트롬빈 혈청의 제조방법.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 혈액 유체는 전혈, 구연산염 항-응고된 전혈 또는 혈장, 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 혈장, 연막 풍부 혈장, 혈소판 부족 혈장, 전 골수, 구연산염 항-응고된 골수, 전 제대혈, 구연산염 항-응고된 골수, 프로트롬빈을 포함하는 혈액 분획 물질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  8. 청구항 1, 2, 3 또는 4에 있어서,
    상기 혈액 유체의 분취액은 칼슘 이온 없이 함유하도록 재석회화를 수행하는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  9. 청구항 1, 2, 3 또는 4에 있어서,
    상기 응혈원제는 유리, 유리구, 유리솜, 카올린, 세라믹, 면직물, 엘라그산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  10. 청구항 1, 2, 또는 4에 있어서,
    상기 트롬빈 혈청의 추출은 주사기의 플런저를 빼내어 수행되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  11. 청구항 3에 있어서,
    상기 에탄올로 보충된 트롬빈 혈청의 추출은 주사기의 플런저를 빼내어 수행되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  12. 청구항 2, 3 또는 4에 있어서,
    상기 활성화된 응혈원제는 약 1 분 내지 10 시간 사이의 시간 동안 저장되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  13. 청구항 2, 3 또는 4에 있어서,
    상기 활성화된 응혈원제는 부가적인 혈액 유체 분취액으로 반복적으로 사용되어 요구시 트롬빈 혈청을 산출하는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  14. 청구항 3 또는 4에 있어서,
    상기 피브린겔의 분말화는 1회 이상 수행되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  15. 청구항 3 또는 4에 있어서,
    상기 피브린겔의 분말화는 기계적 교반에 의해 수행되는 트롬빈 혈청의 제조방법.
  16. 실질적인 누출 없이 응혈원제 및 혈액 유체를 보유하도록 구성된 하나 이상의 격실을 포함하는 반응 챔버, 여기서 보유된 상기 응혈원제는 상기 혈액 유체와 반응하도록 구성되어 피브린겔을 형성하고;
    상기 반응 챔버 내로 및 밖으로 유체를 도입하기 위한 수단;
    상기 반응 챔버에 미립자 물질을 보유하기 위한 수단; 및
    상기 피브린겔로부터 트롬빈 혈청을 격리시키는 수단을 포함하고;
    여기서 하나 이상의 고체 분리된 물체는 상기 반응 챔버에 존재하고, 상기 고체 분리된 물체는 상기 피브린겔을 분말화하기 위해 크기별로 분류되는 혈액 유체의 취급장치.
  17. 청구항 16에 있어서,
    상기 분리된 물체는 적어도 4 mm의 횡단면을 갖는 혈액 유체의 취급장치.
  18. 청구항 16에 있어서,
    상기 반응 챔버는 적어도 하나의 루어 록 (luer lock)을 포함하는 캡에 의해 밀봉된 좁은 말단을 포함하는 실린더형 병 (cylindrical bottle)인 혈액 유체의 취급장치.
  19. 청구항 16에 있어서,
    상기 유체를 도입하기 위한 수단은 어댑터이고, 여기서 4 방향 멈춤 꼭지는 상기 어댑터에 연결되며, 상기 4 방향 멈춤 꼭지는 적어도 두 개의 일-방향 밸브를 포함하는 혈액 유체의 취급장치.
  20. 청구항 16에 있어서,
    상기 장치는 미립자 물질을 보유하기 위한 필터를 더욱 포함하고, 상기 필터는 상기 응혈원제의 크기 미만의 기공 크기를 갖는 혈액 유체의 취급장치.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 필터는 직경이 약 30 마이크론을 초과하는 미립자 물질을 보유하도록 크기가 부여된 혈액 유체의 취급장치.
  22. 청구항 16에 있어서,
    상기 도입 수단은 유체의 도입 및 제거를 위한 적어도 하나의 스왑 포트와 함께 제공되는 혈액 유체의 취급장치.
  23. 청구항 16에 있어서,
    상기 장치는 상기 반응 챔버의 지속된 가압을 피하도록 구성된 에어 벤트를 더욱 포함하는 혈액 유체의 취급장치.
  24. 청구항 16에 있어서,
    상기 반응 챔버는 플라스틱으로 만들어진 혈액 유체의 취급장치.
  25. 청구항 16에 있어서,
    상기 반응 챔버는 유리로 만들어진 혈액 유체의 취급장치.
  26. 청구항 16에 있어서,
    상기 고체 분리된 물체는 유리 물체, 금속 물체, 플라스틱 물체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 유체의 취급장치.
  27. 청구항 16에 있어서,
    상기 고체 분리된 물체는 응혈원제가 아닌 혈액 유체의 취급장치.
  28. 청구항 16에 있어서,
    상기 혈액 유체는 전혈, 구연산염 항-응고된 전혈 또는 혈장, 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 혈장, 연막 풍부 혈장, 혈소판 부족 혈장, 전 골수, 구연산염 항-응고된 골수, 전 제대혈, 구연산염 항-응고된 골수, 프로트롬빈을 포함하는 혈액 분획 물질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 유체의 취급장치.
  29. 청구항 16에 있어서,
    상기 반응 챔버는 건조 칼슘염으로 보충되는 혈액 유체의 취급장치.
  30. 청구항 16에 있어서,
    상기 반응 챔버는 칼슘염 용액으로 보충되는 혈액 유체의 취급장치.
  31. 청구항 29 또는 30에 있어서,
    상기 칼슘염은 염화칼슘인 혈액 유체의 취급장치.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016350067B2 (en) * 2015-11-03 2021-07-01 Health Corporation Of Galilee Medical Center Device and method for treatment of an artificial bone implant with blood
CA3015664C (en) 2016-03-10 2023-10-31 Arthrex, Inc. Systems and methods for preparing a thrombin serum
AU2017230810B2 (en) 2016-03-10 2022-03-10 Arthrex, Inc. Systems and methods for preparing protein enhanced serums
CN106404483A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 上海科华生物工程股份有限公司 一种血清的制备方法
CN108070518B (zh) * 2018-02-11 2018-11-09 衢州顺安电子商务有限公司 一种环保用酶制剂制备装置

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040120942A1 (en) * 2002-12-23 2004-06-24 Mcginnis Daniel Device and process for the preparation of autologous thrombin serum
KR20050105184A (ko) * 2003-01-27 2005-11-03 하베스트 테크놀로지스 코포레이션 응고 억제된 전혈로부터 제조된 자가 또는 동종 혈액응고제
WO2011110948A2 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Antoine Turzi Process,tube and device for the preparation of wound healant composition

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1327261A1 (ru) * 1985-04-24 1987-07-30 Киевское высшее военное авиационное инженерное училище Источник электропитани
CN1091315A (zh) 1992-10-08 1994-08-31 E·R·斯奎布父子公司 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法
US5334216A (en) 1992-12-10 1994-08-02 Howmedica Inc. Hemostatic plug
US5651766A (en) 1995-06-07 1997-07-29 Transfusion Technologies Corporation Blood collection and separation system
US5585007A (en) 1994-12-07 1996-12-17 Plasmaseal Corporation Plasma concentrate and tissue sealant methods and apparatuses for making concentrated plasma and/or tissue sealant
US5733545A (en) 1995-03-03 1998-03-31 Quantic Biomedical Partners Platelet glue wound sealant
US5643192A (en) * 1995-04-06 1997-07-01 Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use
US7045585B2 (en) 1995-11-30 2006-05-16 Hamilton Civic Hospital Research Development Inc. Methods of coating a device using anti-thrombin heparin
WO2000062828A1 (en) 1996-04-30 2000-10-26 Medtronic, Inc. Autologous fibrin sealant and method for making the same
DE19781869T1 (de) 1996-04-30 2000-03-16 Medtronic Inc Verfahren zur Herstellung eines autologen Fibrin-Blutstillungsmittels
US5759171A (en) 1996-09-27 1998-06-02 Thermogenesis Corp. Sprayer for fibrin glue
US7767452B2 (en) 1997-02-20 2010-08-03 Kleinsek Don A Tissue treatments with adipocyte cells
WO1998048938A1 (en) 1997-04-25 1998-11-05 Washington State University Research Foundation Semi-continuous, small volume centrifugal blood separator
IT1292410B1 (it) 1997-06-24 1999-02-08 Roberto Beretta Contenitore di pronto impiego per ottenere colla di fibrina autologa
US6159232A (en) 1997-12-16 2000-12-12 Closys Corporation Clotting cascade initiating apparatus and methods of use and methods of closing wounds
US6478808B2 (en) 1997-12-17 2002-11-12 Closys Corporation Clotting cascade initiating apparatus and methods of use and methods of closing wounds
ES2292212T3 (es) 1997-12-19 2008-03-01 United States Surgical Corporation Sistema dispensador de dos componentes.
WO1999045938A1 (en) 1998-03-10 1999-09-16 Baxter International Inc. Thrombin preparation and products and fibrin sealant methods employing same
JP4493857B2 (ja) * 1998-04-20 2010-06-30 メドトロニック，インコーポレイテッド 自家移植フィブリンシーラント及び同種を作成する方法
US6274090B1 (en) 1998-08-05 2001-08-14 Thermogenesis Corp. Apparatus and method of preparation of stable, long term thrombin from plasma and thrombin formed thereby
US6921380B1 (en) 1998-10-01 2005-07-26 Baxter International Inc. Component mixing catheter
US6334842B1 (en) 1999-03-16 2002-01-01 Gambro, Inc. Centrifugal separation apparatus and method for separating fluid components
WO2000074575A1 (en) 1999-06-01 2000-12-14 Closys Corporation Clotting cascade initiating apparatus and methods of use
US6472162B1 (en) 1999-06-04 2002-10-29 Thermogenesis Corp. Method for preparing thrombin for use in a biological glue
US6942880B1 (en) 2001-04-09 2005-09-13 Medtronic, Inc. Autologous platelet gel having beneficial geometric shapes and methods of making the same
US8105580B2 (en) 2001-12-07 2012-01-31 Cytori Therapeutics, Inc. Methods of using adipose derived stem cells to promote wound healing
EP2308963A3 (en) 2001-12-07 2011-09-21 Cytori Therapeutics, Inc. System for processing lipoaspirate cells
WO2004026709A1 (en) 2002-09-19 2004-04-01 Harvest Technologies Corporation Sterile disposable unit
GB0411281D0 (en) * 2004-05-20 2004-06-23 Inverness Medical Switzerland A device and method for detecting blood coagulation
EP1683579A1 (fr) 2005-01-25 2006-07-26 Jean-Denis Rochat Dispositif jetable pour la séparation en continu par centrifugation d'un liquide physiologique
US7694828B2 (en) 2005-04-27 2010-04-13 Biomet Manufacturing Corp. Method and apparatus for producing autologous clotting components
US9096839B2 (en) 2006-04-26 2015-08-04 Arteriocyte Medical Systems, Inc. Compositions and methods of preparation thereof
WO2008022651A1 (en) 2006-08-21 2008-02-28 Antoine Turzi Process and device for the preparation of platelet rich plasma for extemporaneous use and combination thereof with skin and bone cells
US20090044852A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Zeta Controls Limited Solar panel
WO2009111338A1 (en) 2008-02-29 2009-09-11 Biomet Manufacturing Corp. A system and process for separating a material
US8187475B2 (en) 2009-03-06 2012-05-29 Biomet Biologics, Llc Method and apparatus for producing autologous thrombin
RU2457248C2 (ru) * 2010-06-09 2012-07-27 Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" Способ промышленного получения тромбина
US9011846B2 (en) 2011-05-02 2015-04-21 Biomet Biologics, Llc Thrombin isolated from blood and blood fractions
CN102212514B (zh) * 2011-06-17 2012-10-24 上海科华检验医学产品有限公司 一种用于血液采集容器的血液促凝剂
US8586324B2 (en) 2011-08-15 2013-11-19 Biomet Biologics, Llc Method and apparatus to create autologous clotting serum

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040120942A1 (en) * 2002-12-23 2004-06-24 Mcginnis Daniel Device and process for the preparation of autologous thrombin serum
JP2006515853A (ja) * 2002-12-23 2006-06-08 コーブ・カーディオヴァスキュラー・インコーポレーテッド 自己トロンビン血清の製剤用装置および方法
KR20050105184A (ko) * 2003-01-27 2005-11-03 하베스트 테크놀로지스 코포레이션 응고 억제된 전혈로부터 제조된 자가 또는 동종 혈액응고제
WO2011110948A2 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Antoine Turzi Process,tube and device for the preparation of wound healant composition

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