CN104328083B - 温度和糖双重敏感的水凝胶基材的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了3‑丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在制备细胞片获取基材中的应用，提供了一种双重敏感水凝胶基材制备方法，步骤简单易行，无需大型设备，反应平稳，不污染环境，在临床治疗上有很高的应用前景和实用价值。按照本发明制备方法制得的双重敏感水凝胶细胞片获取基材与传统的细胞片获取方法相比，具有很好的生物相容性的，不会残留有害物质，同时能使获得的细胞片层保持较高的活性。

Description

温度和糖双重敏感的水凝胶基材的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种材料工程技术领域，特别涉及无支架材料组织工程领域，具体涉及一种细胞片获取基材及其制备方法和应用。

背景技术

细胞片技术是指将细胞在特殊基材上培养，在获取的过程中不使用任何蛋白水解酶，可生成具有完整的细胞外间质与细胞间连接的无损细胞片的技术。应用此技术可获得同种细胞单层，同种细胞多层及不同种细胞多层细胞片，目前已用于修复角膜、食管、牙周韧带等单层组织，构建心肌组织，重建肝小叶、肾小球和血管等组织，在临床治疗领域有着广泛的应用前景。

在传统的细胞片技术中，研究最多的是聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)温度敏感材料。因其无需使用胰蛋白酶，只需通过温度变化调节表面亲水与疏水性转变就可实现细胞在其表面的自主贴附与自行分离，被广泛用于低损伤或无损伤细胞片层的获取，在细胞治疗技术、再生医学，特别是无支架材料的组织工程领域显示出极大的潜力。然而，温度诱导的细胞脱附通常需要将细胞在20℃甚至更低的温度下孵育约30分钟或者更长的时间，有报道证明，当温度低于32℃时细胞的新陈代谢过程将会受到抑制，获得的细胞片的细胞活性因此可能会随之降低，同时可能会降低后续的临床治疗效率。

近年来，除了温度敏感材料，其他多种智能材料如电敏感材料、磁性材料、pH以及光敏感性材料等也被成功用于低损伤或无损伤的收获细胞及细胞片层。这些新的智能材料极大地丰富了低损伤或无损伤细胞片层的获取手段，对细胞片组织工程的发展具有极大的推动作用。然而，由此类智能材料构建的细胞培养基材均存在各自的不足，如：通过电敏感或磁性的细胞培养基材收获细胞或细胞片层不可避免地会使得培养基材中的化学物质残留在所收获的细胞中，这将对后续的应用产生不可预知的影响；采用pH值敏感性材料收获细胞将则导致局部生理pH的偏差，会对细胞的活性造成损伤；光敏感性材料目前均是基于紫外光的诱导，同样会损伤收获的细胞。

开发和使用更多新颖的智能材料，对丰富细胞片收获方式以及克服当前存在的问题均有极大的实际应用价值，本发明由此而来。

发明内容

本发明所要解决的第一方面的问题在于克服现有技术中的不足，提供3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在制备细胞片获取基材中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供的第一方面的技术方案：3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在无支架材料组织工程中的应用。

优选地，3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA在制备细胞片获取基材中的应用。

优选地，所述制备细胞片获取基材的方法，其包括如下步骤：

S1.称取适量N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA和少量细胞粘附肽Ac-RGD分别溶于水中，在MBA水溶液中通入氩气，然后将Ac-RGD的水溶液快速加入到N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA的水溶液，并加入少量连二亚硫酸钠水溶液，磁子搅拌反应；

S2.将AAPBA溶于NaOH水溶液中，然后将温度敏感性单体NIPAAm、辅助单体丙烯酰胺AAm、另一部分交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA溶于前述NaOH水溶液中并混合均匀；

S3.将步骤(1)制得的溶液和(2)制得的两种溶液混合并通氩气，然后加入氧化还原引发剂APS/TEMED，混合均匀后浇铸到两层玻璃板之间，静置反应。

3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA是一种含有苯硼酸基团和双键的单体化合物。其中，硼酸基团是生物相容性的官能团，有着较低的细胞毒性和免疫原性，在水相中可与顺式二醇动态结合形成硼酸酯，同样，苯硼酸基团在弱碱性条件下也可以和含有多羟基的化合物(糖类)形成稳定的复合体系，因此苯硼酸衍生物是具有糖响应性的化合物。同时，AAPBA带有的双键可参与交联反应，在其碱性水溶液中通过氧化还原反应引发可与温度敏感性单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)交联反应形成水凝胶。

本发明的第二方面所要解决的问题在于提供一种温度和糖双重敏感水凝胶基材的制备方法，其包括如下步骤：

S1.称取适量N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA和少量细胞粘附肽Ac-RGD分别溶于水中，在MBA水溶液中通入氩气，然后将Ac-RGD的水溶液快速加入到N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA的水溶液，并加入少量连二亚硫酸钠水溶液，磁子搅拌反应；

S2.将AAPBA溶于NaOH水溶液中，然后将温度敏感性单体NIPAAm、辅助单体丙烯酰胺AAm、另一部分交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA溶于前述NaOH水溶液中并混合均匀；

S3.将步骤(1)制得的溶液和(2)制得的两种溶液混合并通氩气，然后加入氧化还原引发剂APS/TEMED，混合均匀后浇铸到两层玻璃板之间，静置反应。

优选地，步骤S1中，其中Ac-RGD是序列为Ac-Arg-Gly-Asp-Cys的短肽，且Ac-RGD与MBA的摩尔比为1:10。

优选地，所述方法中各反应组分最终摩尔比为

NIPAAm:AAPBA:AAm:MBA:Ac-RGD＝2:0.1:0.6:0.1:0.005。

优选地，步骤S1中，Ac-RGD与MBA在室温下反应6h，后置于-4℃保存。

优选地，步骤S3中，所述引发剂的使用量为5mg APS，5μL TEMED。

本发明的第三方面所要解决的问题在于提供上述制备方法得到的温度和糖双重敏感水凝胶基材。

所述双重敏感水凝胶基材为片状，透明性好，厚度为0.75mm。

本发明的第四方面在于提供一种温度和糖双重敏感水凝胶基材在无支架材料组织工程中的应用。

优选地，所述无支架材料组织工程为细胞片工程。

所述温度和糖双重敏感水凝胶基材在细胞片工程的实施步骤如下：

S4.将步骤S3制得的双重敏感水凝胶置于PBS溶液中浸泡除去残留单体和碱；

S5.将含有种子细胞的细胞悬液加入到步骤S4得到的水凝胶片层上，置于37℃培养箱培养至细胞生长成为连续的细胞片；

S6.将原来的培养基吸净，加入含一定浓度糖的或温度降低的新鲜培养基，置于倒置显微镜下观察细胞片的脱附。

AAPBA经过合成与提纯之后，可与NIPAAm等其他组分交联反应制备双重敏感水凝胶。细胞实验表明，本发明制得的双重敏感凝胶基材对细胞有非常好的相容性，同时制备的水凝胶透明性好，可以满足细胞培养与细胞片获取的需求，达到减少温度的降低幅度、克服由温度降低引起细胞活性降低的目的。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA在制备细胞片获取基材中的应用，提供了一种双重敏感水凝胶基材制备方法，步骤简单易行，无需大型设备，反应平稳，不污染环境，在临床治疗上有很高的应用前景和实用价值。按照本发明制备方法制得的双重敏感水凝胶细胞片获取基材与传统的细胞片获取方法相比，具有很好的生物相容性的，不会残留有害物质，同时能使获得的细胞片层保持较高的活性。

附图说明

图1为实施例1双重敏感水凝胶基材于不同温度和糖浓度条件下的照片；

图2为实施例2双重敏感水凝胶基材的细胞培养细胞活力检测结果图(其中，图(a)和图(c)的水凝胶基材不含Ac-RGD，图(b)和图(d)的水凝胶基材含Ac-RGD，图(a)和图(b)为FITC-鬼笔环肽和DAPI的细胞染色图)；

图3为细胞片于双重敏感水凝胶基材表面脱附图(恒温为37℃，更换含10g/L果糖培养基之后细胞片的脱附图)；

图4为细胞片于双重敏感水凝胶基材表面脱附图(变温为20℃，更换含10g/L果糖培养基之后细胞片的脱附图)。

具体实施方式

以下结合附图1作进一步描述：

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

其中，3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA，N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA为普通市售产品，Ac-RGD由苏州强耀生物科技有限公司合成。

实施例1双重敏感水凝胶基材的制备

首先制备Ac-RGD/MBA水溶液，将125mg MBA溶于5mL去离子水中并通氩气5min，40mg Ac-RGD溶于40μL去离子水中，将Ac-RGD的水溶液加入MBA水溶液中，再滴加5滴100mg/mL连二亚硫酸钠水溶液，密封后置于室温下反应6h后转移至-4℃冰箱中备用。然后称取AAPBA 19mg溶于0.875mL的8mg/mL NaOH水溶液中，称取225mg NIPAAm，42mg AAm，8mg MBA溶于2mL去离子水中。取一只洁净离心管，在其中加入上述AAPBA NaOH水溶液，NIPAAm/AAm/MBA水溶液和383μL Ac-RGD/MBA水溶液，混合均匀，通氩气5min，然后依次加入100μL的50μL/mL TEMED水溶液和100μL 50mg/mL APS水溶液，快速搅拌均匀后加入到制胶专用的两块玻璃板中间，两层玻璃板间距为0.75mm，置于37℃下反应2h。之后将水凝胶片切成直径为1.4cm的圆片，产品如图1所示。

实施例2双重敏感水凝胶基材用于细胞培养、贴附性能和活性检测

将实施例1所得的圆形水凝胶片泡在PBS溶液中，首先恒温于37℃中2h，吸掉原来的PBS换为新鲜的PBS，然后置于20℃下恒温2h，之后再转入37℃中，重复前面的步骤反复洗涤水凝胶片，每天洗3次。2天以后将水凝胶片转入24孔培养板中，加入0.5mL PBS，强紫外灭菌15min。同时制备了不含Ac-RGD的双重敏感水凝胶作为阴性对照组。将浓度为5*10⁴Cell/mL的MC3T3-E1细胞悬液按每孔1mL接种到培养板中的水凝胶片上，放入37℃的5％CO2培养箱中培养。使用的培养基为含有10％FBS的LG-DMEM。为了检测细胞贴附性能和活性，6h后进行细胞骨架和细胞核的染色。首先用PBS溶液清洗细胞3次，每次5min，然后用4％多聚甲醛固定15min，再用PBS溶液清洗细胞3次，每次5min，之后用0.1％Triton X-100/PBS室温破膜5min，PBS清洗细胞3次，每次5min，然后加入含有浓度均为5μg/mL的FITC-鬼笔环肽和DAPI的PBS溶液染色20min，锡箔纸包覆避光，然后用PBS清洗细胞3次，每次20min，清洗过程中用锡箔纸包覆避光。然后置于荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。结果如图2所示。

结果表明，加入Ac-RGD的双重敏感水凝胶利于细胞贴附，水凝胶上的细胞形态良好，而阴性对照组双重敏感水凝胶上的细胞呈圆形，基本不贴附。因此，本发明提供的双重敏感水凝胶可用于细胞培养。

实施例3双重敏感水凝胶基材用于细胞片获取

按照实施例2中的细胞接种方法，于水凝胶表面接种MC3T3-E1细胞，细胞3天之后长成连续的细胞片。分别配制含有10g/L果糖或葡萄糖的DMEM培养基，将含糖培养基分为两组，设置不同的温度以考察水凝胶的温度敏感性对于细胞片脱附的影响，一组恒温于37℃，另一组恒温于20℃。将长满细胞的水凝胶片上的LG-DMEM吸掉，加入温度为37℃或者20℃的含有10g/L果糖或葡萄糖的DMEM培养基，将培养板置于倒置显微镜下观察细胞片的脱附情况并连续拍照记录。结果如图3所示。

结果表明，在一定范围内降低温度或者在培养基中添加糖(果糖和葡萄糖)能够有效促进细胞片的脱附，而且，当两种因素同时作用时，细胞片脱附速度更快，脱附率更高。

当然，上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让人们能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种温度和糖双重敏感水凝胶基材，其由如下步骤制备得到：

S1. 称取N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA和细胞粘附肽Ac-RGD分别溶于水中，在MBA水溶液中通入氩气，然后将Ac-RGD的水溶液快速加入到N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA的水溶液，并加入连二亚硫酸钠水溶液，磁子搅拌反应；Ac-RGD是序列为Ac-Arg-Gly-Asp-Cys的短肽；

S2. 将AAPBA溶于NaOH水溶液中，然后将温度敏感性单体NIPAAm、辅助单体丙烯酰胺AAm、另一部分交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺MBA溶于前述NaOH水溶液中并混合均匀；

S3. 将步骤（1） 制得的溶液和（2）制得的两种溶液混合并通氩气，然后加入氧化还原引发剂APS/TEMED，混合均匀后浇铸到两层玻璃板之间，静置反应；

各反应组分最终摩尔比为NIPAAm : AAPBA : AAm : MBA : Ac-RGD = 2:0.1:0.6:0.1:0.005。

2.根据权利要求1所述的水凝胶基材，其特征在于,步骤S1中，Ac-RGD与MBA在室温下反应6h，后置于-4℃保存。

3.如权利要求1所述的一种温度和糖双重敏感水凝胶基材在体外的无支架材料组织工程中的应用。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述无支架材料组织工程为细胞片工程。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述温度和糖双重敏感水凝胶基材在细胞片工程中的实施步骤如下：

S4. 将双重敏感水凝胶置于PBS溶液中浸泡除去残留单体和碱；

S5. 将含有种子细胞的细胞悬液加入到步骤S4 得到的水凝胶片层上，置于37℃培养箱培养至细胞生长成为连续的细胞片；

S6. 将原来的培养基吸净，加入含糖的或温度降低的新鲜培养基，置于倒置显微镜下观察细胞片的脱附。