CN104322563B

CN104322563B - 水稻基腐病菌抗生素zeamines在植物病害防治中的应用

Info

Publication number: CN104322563B
Application number: CN201410487673.4A
Authority: CN
Inventors: 张炼辉; 廖立胜; 陈少华; 贺飞; 周佳暖; 王惠杉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2014-09-22
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-09-22
Also published as: CN104322563A

Abstract

本发明公开了水稻基腐病菌Dickeya zeae产生的抗生素物质zeamines的新用途，具体为用于防治真菌性植物病害。通过室内生物测定和盆栽试验，本发明发现水稻基腐病菌Dickeya zeae产生的抗生素zeamines对霜疫霉属（Peronophythora Chen）、炭疽菌属（Colletotrichum Corda）、梨孢属（Pyricularia）、葡萄孢属（Botrytis sp.）、丝核菌属（Rhizoctonia）、镰胞菌属（Fusarium）等属的常见植物病害具有良好的防治作用。本发明对zeamines用于防治植物病害的新用途提出了新的思路，为微生物代替化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，对解决植物病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。

Description

水稻基腐病菌抗生素zeamines在植物病害防治中的应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及水稻基腐病菌抗生素zeamines在植物病害防治中的应用，特别是水稻基腐病菌抗生素zeamines作为杀真菌剂在植物病害方面的应用。

背景技术

生物防治这一门科学的产生是从利用天敌防治有害生物开始。19世纪80年代，美国加州从澳大利亚引进澳洲瓢虫控制吹绵蚧取得了极大的成功，轰动国际昆虫学领域，传统生物防治科学的新纪元由此诞生。经过100多年来的发展，生物防治已在理论上和方法上成为具有较完整的基础理论体系和方法学的学科。1987年，美国国家科学院将生物防治的定义扩大为：利用自然的或经过改造的生物、基因或基因产物来减少有害生物的作用，使其有利于有益生物如作物、树木、动物和益虫及微生物。

近年来，伴随着生物学、植物病理学等学科的快速发展，农药中杀菌剂的研究已进入了一个新兴的时代。高毒、高残留、高抗药性的化学农药逐渐淡出历史舞台，取而代之的是更安全、低残留、低抗药性的生物源农药。生物农药( Biopesticides ) 是利用生物活体或者其代谢产物对有害生物进行防治的一类制剂，是生物防治的物质基础和重要手段。微生物农药是生物源农药的重要代表，具有开发利用途径多，不易产生抗性等特点。例如我国20世纪70年代研究生产的井冈霉素，具有高效、长效、安全、价廉等特点，几十年来一直是控制水稻纹枯病的首选农药品种。此外还具有下列优点：种类繁多，研发的选择余地大；对环境安全，无公害，无残留；专一性强，活性高，生产成本低，发酵工艺简单；对非靶标生物安全。其中，细菌类生物农药剂的研究趋于活跃，主要用于防治植物土传病害，在全国的应用面积已超过亿亩。细菌类 100多种生物农药中苏云金杆菌(Bacillus thuringiersis,B.t. )是目前世界上用途最广，应用最成功的生物杀虫剂，占生防制剂总量90%以上。细菌中还有许多含抗菌物质。如在芽孢杆菌产生的抗菌肽中，多数抗细菌，少数抗真菌。Wakayama等从蜡状芽孢杆菌( B. cereus )中纯化出一种抗真菌环状多肽Mycocerin，其抑菌谱广，活力强，能同时对丝状真菌和酵母起作用，且耐热性和稳定性好。近年来多肽类抗生素的研究日益受到重视，研究的进一步发展可通过基因定点突变技术对其分子结构进行修饰，以提高其活性。

水稻基腐病菌（Dickeya Zeae）菌体单生，短杆状，两端钝圆，大小为0.7 μm×1.4-1.75 μm，周生多根鞭毛。革兰氏染色反应呈阴性，不形成芽胞和荚膜。刘琼光等（2008，2009）发现D. zeae能产生抗生素，相反，侵染双子叶植物的D. chrysanthemi则不产生抑制水稻种子发芽的抗生素。进一步突变实验结果表明，D. zeae产生的抗生素对抑制水稻种子发芽至关重要，并引起水稻秧苗致萎；而侵染双子叶植物的D. chrysanthemi则不产生抑制水稻种子发芽的抗生素。这些初步实验结果表明，D. zeae的致病机理和D. chrysanthemi不同，抗生素是D. zeae侵染单子叶植物的重要致病因子。近期研究表明水稻基腐病菌代谢产生的抗生素zeamines对多种革兰氏阴性和革兰氏阳性菌，包括多种植物病原细菌和动物病原细菌都有高强度的抑制作用（Wu等，2010）。实验表明Zeamines抗生素是一种非常有潜力、有价值的新型抗生素药物，需要深入的研究与开发。

关于zeamines的杀真菌活性还未见报道。应用zeamines在植物病害的防治也还未见报道，尤其是对农业产品采后病害的防治方面更未见报道。

研究zeamines对植物病真菌的抑菌活性，将zeamines应用到植物病害的防治上，对解决病原物对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。而具体研究zeamines在农业果实产品采后病害的防治应用，具有巨大的经济效益前景。目前还没有见到相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供zeamines的一个新用途。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供zeamine 在防治真菌性植物病害方面的应用。

所述的zeamines是从水稻基腐病菌Dickeya zeae 发酵培养液中提取物中的活性成分。

所述zeamines的制备方法是通过离心收集水稻基腐病菌D. zeae发酵培养液上清，利用5M的NaOH将发酵液的pH值上调成10，再利用旋转蒸发仪将pH为10的发酵液上清浓缩为原体积的1/10。利用三倍体积的有机溶剂（正丁醇:乙酸乙酯=2:1）萃取二次。再使用蒸发仪将有机溶剂蒸干后，使用乙醇将其溶解，过凝胶柱吸附，使用甲醇洗脱。将含有抑菌活性的甲醇溶液蒸干浓缩之后，在利用高效液相色谱（HPLC）进一步纯化、分析、收集活性物质。结构鉴定确认活性成分为zeamines。

将zeamines配置成一定浓度的供试药液，采用菌丝生长速率法、孢子囊萌发法、离体组织（叶片、果实等）对霜疫霉属（Peronophythora Chen）、炭疽菌属（ColletotrichumCorda）、梨孢属（Pyricularia）、葡萄孢属（Botrytis sp.）、丝核菌属（Rhizoctonia）、镰胞菌属（Fusarium）等属的常见植物病害进行了室内毒力测定并进行了温室盆栽试验。试验结果表明，zeamines对供试病原菌具有良好的抑菌效果，可以开发其在防治植物病害中的新用途。

作为一个优选方案，本发明提供了所述zeamines以8 μg/mL浓度应用于防治荔枝霜疫霉病。

本发明的有益效果是：

本发明突破以往zeamines只是对一些细菌的抑制效果的简单测试，对zeamines的应用提出了新思路，并确定了水稻基腐病菌发酵液提取活性成分zeamines用于防治真菌性植物病害的技术方案。为微生物源代替化学合成杀菌剂提供了新的开发资源，对解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。

附图说明

图1为zeamines对荔枝霜疫霉属（Peronophythoralichi）病菌菌丝的抑制作用；其中图A表示为培养基中加入10%甲醇对照；图B表示为培养基含有终浓度为0.5μg/mL 的zeamines；图C表示为培养基含有终浓度为1μg/mL 的zeamines；图D表示为培养基含有终浓度为2μg/mL 的zeamines；图E表示为培养基含有终浓度为4μg/mL 的zeamines；图F表示为培养基含有终浓度为8μg/mL 的zeamines。

图2为zeamines对荔枝霜疫霉属（Peronophythoralichi）病菌孢子囊的抑制作用；其中，图A表示为培养基中加入10%甲醇对照；图B表示为培养基含有终浓度为0.5μg/mL 的zeamines；图C表示为培养基含有终浓度为1μg/mL 的zeamines；图D表示为培养基含有终浓度为2μg/mL 的zeamines；图E表示为培养基含有终浓度为4μg/mL 的zeamines；图F表示为培养基含有终浓度为8μg/mL 的zeamines。

图3为zeamines对香蕉枯萎病的盆栽防治效果；A表示没有用zeamines处理植株，并接种病菌；B表示表示用10μg/mL 的zeamines处理植株，并接种病菌；C表示表示用20μg/mL 的zeamines处理植株，并接种病菌；D表示表示用10μg/mL 的zeamines处理植株，并接种病菌；E表示表示用40μg/mL 的zeamines处理植株，并接种病菌。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细说明本发明，但实施例并不能限定本发明的保护范围。

实施例1 zeamines的制备

将OD₆₀₀=1.0的D. zeae种子液接入产毒培养基（LS培养基），25^oC、180rpm培养36个小时后，通过离心收集水稻基腐病菌D. zeae发酵培养液上清。所得发酵液用2L锥形瓶密封遮光保存待下一步提取用。

本发明采用的是常规的化合物分离提取的方法对发酵液中抑菌活性物质的分离与提取。利用5M的NaOH将发酵液的pH值上调成10，再利用旋转蒸发仪将pH为10的发酵液上清浓缩为原体积的1/10。利用三倍体积的有机溶剂（正丁醇:乙酸乙酯=2:1）萃取二次。再使用蒸发仪将有机溶剂蒸干后，使用乙醇将其溶解，过凝胶柱吸附，使用甲醇洗脱。将含有抑菌活性的甲醇溶液蒸干浓缩之后，在利用高效液相色谱（HPLC）进一步纯化、分析、收集活性物质。结构鉴定确认活性成分为zeamines。

实施例2 zeamines对霜疫霉属（Peronophythora Chen）病菌的抑制作用。

用10%的甲醇作为溶剂溶解提取物，然后再与CDA（胡萝卜培养基）培养基配置成带zeamines培养基，以菌丝生长速率法测定不同浓度提取物对荔枝霜疫霉菌丝生长的抑制作用。具体操作是：

采用菌丝生长速率法：用10%甲醇作为溶剂将zeamines配置成一定浓度的供试药剂，准确加入一定量的zeamines溶液到50^oC融化的CDA培养基中，使培养基中zeamines的终浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL，每个浓度倒3重复的培养平板。以相同体积的10%甲醇作为对照。供试病菌荔枝霜疫霉菌在直径为9cm的培养基平板上培养5天后，在菌落边缘菌丝生长旺盛处用灭菌的4mm的打孔器钻取菌饼，分别接种于每个培养皿的中央，有菌丝的一面向上。25^oC培养箱数天后，观察并记录实验结果。实验结果见图1，图1结果表明，zeamines对荔枝霜疫霉病菌菌丝生长的抑制效果明显高于对照组，在2μg/mL；4μg/mL；8μg/mL的zeamines浓度下抑制率达到99.2%、99.7%、100%，显示出很强的抑菌作用。

实施例3：zeamines对霜疫霉属（Peronophythora Chen）病菌的抑制作用。

采用载玻片测定（方中达，1998），将在CDA培养基上培养6天的荔枝霜疫霉菌用无菌水洗下孢子囊，配置孢子囊溶液，调整孢子囊浓度为每个视野（10×10倍）约40~60个孢子囊。向孢子囊悬浮液中加不同量的zeamines溶液，是其终浓度分别为0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL。取50μL孢子悬浮液滴在凹玻片上，再将凹玻片置于已放一张滤纸的9cm培养皿内，并在滤纸上滴加少量无菌水以保湿，盖上培养皿，置于28^oC黑暗培养6个小时后，在光学显微镜下观察孢子囊萌发情况。实验结果如图2所示，实验结果表明：处理6个小时，光学显微镜下观察，随着处理浓度的升高，孢子囊萌发率相应降低，抑制率依次为98.7%、86.4%、67.9%、7.5%、2.3%、0%，显示出很强的抑菌作用。

实施例4：Zeamines对镰胞菌属（Fusarium）病菌的温室盆栽试验

香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporium）孢子悬浮液的制备：将在PDA培养基上培养7天后，用4mm的打孔器钻取菌饼，将带病原菌菌丝的菌饼接入YPD培养基中，在28℃恒温箱中培养15d，用无菌水配成1×10⁶CFU/mL孢子悬浮液。

盆栽试验在塑料大棚中进行。每个塑料盆钵装满（塘泥和基质土）混合营养土1kg。当香蕉组培苗长出 4~5片真叶时，先取出营养钵中的组培苗，用针刺伤根尖，再将根浸没于1×10⁶CFU/mL的孢子悬浮液中，30min后移栽于盆钵中。并将剩余的病原菌孢子悬浮液浇入栽有香蕉幼苗的土壤中，接种后置于室温、自然光照条件下培养，常规的水肥管理。

接种病原菌10d后的香蕉苗分别灌注三个（40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL）浓度的供试药剂，蒸馏水作为对照，每株灌注药剂100mL，每个处理3个重复，每个重复5株。施药后45天，对照组的香蕉苗出现枯死或假茎开裂，调查蕉苗病情指数。病情分级标准：

1级：（0）假茎基部无褐色；

2级：（+）假茎基部变褐程度只有针鼻儿大小；

3级：（++）假茎基部变褐程度小于假茎直径的1/2；

4级：（+++）假茎基部变褐程度大于1/2；

发病率（%）=发病蕉苗数/总接种蕉苗×100%

实验结果见表1、图3所示：

表1 zeamines对香蕉枯萎病的盆栽防治效果

浓度（μg/mL）	病情指数（%）	发病率（%）
			对照（不含zeamines接病菌）	52.4	87.34
10	25.1	65.51
			20	27.3	35.12
40	7.3	9.29
			对照（不含zeamines不接病菌）	3.1	7.53

实验结果表明：zeamines对香蕉枯萎病有较好的防治效果，防治效果随着浓度的升高而提高。供试浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，处理45天香蕉苗的发病率65.51%、35.12%、9.29%。

实施例5：Zeamines对6种病原菌的最低抑菌浓度的测定

采用固体琼脂稀释法测量zeamines对6种真菌的最低抑菌浓度。根据Lass-Florl的方法将zeamines的甲醇溶液10倍依次稀释，并添加到CDA或PDA培养基中。将6种不同的病原真菌分别在CDA或PDA培养基上培养6天，取菌落边缘菌丝生长旺盛的菌饼，并接种于含有不同浓度zeamines 的LB培养基平板上，每个浓度3个重复，25^oC培养10天，观察并测量结果。结果如表2 所示：

表2 zeamines 对6种病原真菌的最低抑菌浓度

实验结果显示：Zeamines对6种植物病原真菌都有明显的抑制作用，最低抑菌浓度都较低水平，其中对荔枝霜疫霉的抑制显示出最为显著的效果；平均7.84µg/mL的zeamines就能抑制其菌丝生长；对立枯丝核菌的抑制效果也非常明显，平均在15.69µg/mL的浓度就能限制其菌丝的生长。此外，对其余4种病原真菌也表现出良好的抑菌效果。说明zeamines对植物病原真菌具有广谱的杀菌作用。

Claims

1.水稻基腐病菌Dickeya zeae产生的抗生素zeamines 在防治真菌性植物病害方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述zeamines是从水稻基腐病病原菌D.Zeae的培养发酵液中分离提取的抑菌活性成分。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述zeamines的制备方法是先将D.zeae培养发酵、离心收集发酵液，提取得到抑菌活性提取物；提取物经分离、提纯和结构鉴定得到zeamines。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述真菌性植物病害包括霜疫霉属、炭疽菌属、梨孢属、葡萄孢属、丝核菌属、镰刀菌属植物病害。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述zeamines以8 μg/mL浓度应用于防治荔枝霜疫霉病。