CN104316460A - 一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用，属于生物传感检测技术领域。基于TiO₂-CdSe复合物作为光电信标物质，CdSe量子点以其量子尺寸效应、介电效应及表面积效应，增强了TiO₂的光电性能，可实现对实体组织目标DNA及其管家基因的灵敏、特异及快速检测，本发明制备的传感器具有设备简单、成本低、易于微型化和集成化的优点，易于推广。

Description

一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用，该传感器用于生物组织DNA的检测，属于生物传感检测技术领域。

背景技术

纵观适配体传感器的发展，可以发现大多数课题组对于DNA传感器的研究主要集中在短链DNA（20-60bp），同时这些DNA大多是根据需要，事先根据一定的规则进行设计，然后由生物公司代工合成，但DNA片段并非实际存在，应用价值不大。若要使DNA生物传感器用于实际检测，则被检测的DNA应该是真实存在的，这就需要从实际问题中找寻需要检测、识别的DNA，然后根据需要，设计传感器，应用于实践。

鉴于此，本专利将利用TiO₂-CdSe纳米复合材料的信号放大作用及体系中光致电信号的强度变化，对真实生物细胞经培养后抽提的DNA目标片段进行检测。本发明具有成本低、制备简单、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，克服了目前DNA检测方法局限于纯生物领域的弊端。

发明内容

本发明的目的之一是基于赖氨酸对DNA的生物特异亲和性及TiO₂-CdSe纳米复合材料，制备了一种特异性强，灵敏度高的光电生物传感器；

本发明的目的之二是将该传感器用于实体组织抽提DNA的检测。

本发明的技术方案如下：

1. 一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法

（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2 V/s扫速，在-1.5~2.5 V电位范围，在含有5×10^-3 mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0~9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；

（2）滴涂2~18 μL 的TiO₂-固态CdSe复合物或2~18μL 的TiO₂-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（3）继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的上游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（4）继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的下游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。

2. 上述TiO₂-固态CdSe复合物和TiO₂-液态CdSe复合物制备 

（1）TiO₂的制备

0.01~0.03 mol的钛酸丁酯溶于30~90 ml乙醇中，逐滴加入至10~30mL超纯水中，搅拌12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 ℃下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4~8次，80 ℃下真空干燥12 h，制得TiO₂；

（2）CdSe的制备

移取0.6~1.0 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl₂溶液的250 mL三口烧瓶中，用1 mol/L NaOH调pH至10，加入8~12 mL Na₂SeSO₃溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；

所述Na₂SeSO₃溶液是将1~20 mmol Se和5~15 mmol Na₂SO₃加入到50mL超纯水中，90 ℃反应3 h，过滤去渣，制得Na₂SeSO₃溶液；

所述CdCl₂溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将 1~2 g CdCl₂·2.5H₂O溶于40 mL超纯水制得；

（3）TiO₂-固态CdSe复合物的制备

 将0.002~0.006 g TiO₂，0.002~0.006 g 固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡8~12 h，11000转/min、23℃下离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-固态CdSe复合物；

（4）TiO₂-液态CdSe复合物的制备

0.002~0.006 g TiO₂与2~6mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡8~12 h，11000转/min离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-液态CdSe复合物。

3.目标DNA及其管家基因的检测步骤

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在10~50 mL、 pH 7 ~ 9的PBS，0.1~0.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。

本发明的成果：

（1）L-赖氨酸有良好的热稳定性、生物亲和性，本发明中将L-赖氨酸进行电聚合，修饰于ITO电极表面，提供了可保持生物活性的固载DNA等生物大分子的方法，同时该方法不需经过预处理，电极选择性、灵敏度和重现性较好，电极响应快，测得线性范围为3.5 pmol/L ~ 30 nmol/L，检测限为1.2 pmol/L。

（2）本发明使用TiO₂做为光电信标物质之一，拓展了TiO₂的使用范畴， 同时利用CdSe量子点显著的量子尺寸效应及小的粒子尺寸，增强了传感器的光电性能。

（3）本发明所检测DNA均从实际生物组织中提取，实用价值高。

具体实施方式：

为进一步说明，结合一下实施例具体说明：

实施例1 一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法

（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2 V/s扫速，在-1.5~2.5 V电位范围，在含有5×10^-3 mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；

（2）滴涂2 μL的TiO₂-固态CdSe复合物或2μL 的TiO₂-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（3）继续滴涂10 μL、5 μg/mL的目标DNA的上游引物或10 μL、10 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（4）继续滴涂10 μL、5 μg/mL的目标DNA的下游引物或10 μL、10 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。

实施例2 一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法

（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2 V/s扫速，在-1.5~2.5 V电位范围，在含有5×10^-3 mol/L的L-赖氨酸、pH为7.4的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；

（2）滴涂10 μL 的TiO₂-固态CdSe复合物或10μL 的TiO₂-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（3）继续滴涂15 μL、25 μg/mL的目标DNA的上游引物或15 μL、15μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（4）继续滴涂15 μL、30 μg/mL的目标DNA的下游引物或15 μL、16 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。

实施例3 一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法

（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2 V/s扫速，在-1.5~2.5 V电位范围，在含有5×10^-3 mol/L的L-赖氨酸、pH为9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；

（2）滴涂18 μL 的TiO₂-固态CdSe复合物或18μL 的TiO₂-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（3）继续滴涂20 μL、50 μg/mL的目标DNA的上游引物或20 μL、20 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（4）继续滴涂20 μL、50 μg/mL的目标DNA的下游引物或20 μL、20 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。

实施例4  TiO₂-固态CdSe复合物和TiO₂-液态CdSe复合物制备 

（1）TiO₂的制备

0.01 mol的钛酸丁酯溶于30ml乙醇中，逐滴加入至10mL超纯水中，搅拌12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 ℃下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4次，80 ℃下真空干燥12 h，制得TiO₂；

（2）CdSe的制备

移取0.6 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl₂溶液的250 mL三口烧瓶中，用1 mol/L NaOH调pH至10，加入8 mL Na₂SeSO₃溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；

所述Na₂SeSO₃溶液是将1 mmol Se和10 mmol Na₂SO₃加入到50 mL超纯水中，90 ℃反应3 h，过滤去渣，制得Na₂SeSO₃溶液；

所述CdCl₂溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将 1.5 g CdCl₂·2.5H₂O溶于40 mL超纯水制得；

（3）TiO₂-固态CdSe复合物的制备

将0.004 g TiO₂，0.004 g 固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡10 h，11000转/min、23℃下离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-固态CdSe复合物；

（4）TiO₂-液态CdSe复合物的制备

0.004 g TiO₂与4mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡10 h，11000转/min离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-液态CdSe复合物。

实施例5  TiO₂-固态CdSe复合物和TiO₂-液态CdSe复合物制备 

（1）TiO₂的制备

0.02 mol的钛酸丁酯溶于60 ml乙醇中，逐滴加入至20 mL超纯水中，搅拌12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 ℃下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗6次，80 ℃下真空干燥12 h，制得TiO₂；

（2）CdSe的制备

移取0.8mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl₂溶液的250 mL三口烧瓶中，用1 mol/L NaOH调pH至10，加入10 mL Na₂SeSO₃溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；

所述Na₂SeSO₃溶液是将10 mmol Se和10 mmol Na₂SO₃加入到50mL超纯水中，90 ℃反应3 h，过滤去渣，制得Na₂SeSO₃溶液；

所述CdCl₂溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将 1.5 g CdCl₂·2.5H₂O溶于40 mL超纯水制得；

（3）TiO₂-固态CdSe复合物的制备

 将0.003 g TiO₂，0.003 g 固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡10 h，11000转/min、23℃下离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-固态CdSe复合物；

（4）TiO₂-液态CdSe复合物的制备

0.003 g TiO₂与4mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡10 h，11000转/min离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-液态CdSe复合物。

实施例6  TiO₂-固态CdSe复合物和TiO₂-液态CdSe复合物制备 

（1）TiO₂的制备

0.03 mol的钛酸丁酯溶于90 ml乙醇中，逐滴加入至30mL超纯水中，搅拌12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 ℃下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗8次，80 ℃下真空干燥12 h，制得TiO₂；

（2）CdSe的制备

移取1.0 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl₂溶液的250 mL三口烧瓶中，用1 mol/L NaOH调pH至10，加入12 mL Na₂SeSO₃溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；

所述Na₂SeSO₃溶液是将20 mmol Se和15 mmol Na₂SO₃加入到50 mL超纯水中，90 ℃反应3 h，过滤去渣，制得Na₂SeSO₃溶液；

所述CdCl₂溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将2 g CdCl₂·2.5H₂O溶于40 mL超纯水制得；

（3）TiO₂-固态CdSe复合物的制备

将0.006 g TiO₂， 0.006 g 固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡12 h，11000转/min、23℃下离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-固态CdSe复合物；

（4）TiO₂-液态CdSe复合物的制备

0.006 g TiO₂与6mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡12 h，11000转/min离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-液态CdSe复合物。

实施例7目标DNA的检测

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在10 mL、 pH 7的PBS，0.1mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定；

（4）线性范围3.5 pmol/L~ 25 nmol/L，检测限为1.2 pmol/L。

实施例8 管家基因的检测

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在50 mL、 pH 9的PBS，0.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品代替管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测

（4）线性范围为1.5 pmol/L~15 nmol/L，检测限为0.68 pmol/L。

Claims (3)

1.一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法，其特征包括以下步骤：

（1）将1.0 cm×2.5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2 V/s扫速，在-1.5~2.5 V电位范围，在含有5×10^-3 mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0~9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；

（2）滴涂2~18 μL 的TiO₂-固态CdSe复合物或2~18 μL 的TiO₂-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（3）继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的上游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（4）继续滴涂10~20 μL、5~50 μg/mL的目标DNA的下游引物或10~20 μL、10~20 μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。

2.根据权利要求1所述的一种TiO₂-CdSe复合纳米材料光电生物体传感器的制备方法，所述TiO₂-固态CdSe复合物和TiO₂-液态CdSe复合物，制备步骤如下：

（1）TiO₂的制备

0.01~0.03 mol的钛酸丁酯溶于30~90 ml乙醇中，逐滴加入至10~30mL超纯水中，搅拌12 min，将得到的混合物转移至高压釜中，200 ℃下反应10 h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4~8次，80 ℃下真空干燥12 h，制得TiO₂；

（2）CdSe的制备

移取0.6~1.0 mL的巯基乙酸加入到60 mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl₂溶液的250 mL三口烧瓶中，用1 mol/L NaOH调pH至10，加入8~12 mL Na₂SeSO₃溶液，加热至沸腾，回流4 h，制得液态CdSe，将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；

所述Na₂SeSO₃溶液是将1~20 mmol Se和5~15 mmol Na₂SO₃加入到50 mL超纯水中，90 ℃反应3 h，过滤去渣，制得Na₂SeSO₃溶液；

所述CdCl₂溶液是在250 mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将 1~2 g CdCl₂·2.5H₂O溶于40 mL超纯水制得；

（3）TiO₂-固态CdSe复合物的制备

 将0.002~0.006 g TiO₂，0.002~0.006 g 固态CdSe于5 ml的离心管中，加入4 mL超纯水，震荡8~12 h，11000转/min、23℃下离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-固态CdSe复合物；

（4）TiO₂-液态CdSe复合物的制备

0.002~0.006 g TiO₂与2~6 mL液态CdSe于10 mL的离心管中，震荡8~12 h，11000转/min离心15 min，分离得到固体，将固体加入1 mL超纯水，超声，制得TiO₂-液态CdSe复合物。

3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器，其特征在于，用于目标DNA及其管家基因的检测，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO₂-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在10~50 mL、 pH 7 ~ 9的PBS，0.1~0.3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；

（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1 V，取样间隔 20s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。