CN104316460B - 一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用，属于生物传感检测技术领域。基于TiO2-CdSe复合物作为光电信标物质，CdSe量子点以其量子尺寸效应、介电效应及表面积效应，增强了TiO2的光电性能，可实现对实体组织目标DNA及其管家基因的灵敏、特异及快速检测，本发明制备的传感器具有设备简单、成本低、易于微型化和集成化的优点，易于推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法及其应用，该传感器用于生物组织DNA的检测，属于生物传感检测技术领域。
背景技术
纵观适配体传感器的发展，可以发现大多数课题组对于DNA传感器的研究主要集中在短链DNA（20-60bp），同时这些DNA大多是根据需要，事先根据一定的规则进行设计，然后由生物公司代工合成，但DNA片段并非实际存在，应用价值不大。若要使DNA生物传感器用于实际检测，则被检测的DNA应该是真实存在的，这就需要从实际问题中找寻需要检测、识别的DNA，然后根据需要，设计传感器，应用于实践。
鉴于此，本专利将利用TiO2-CdSe纳米复合材料的信号放大作用及体系中光致电信号的强度变化，对真实生物细胞经培养后抽提的DNA目标片段进行检测。本发明具有成本低、制备简单、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，克服了目前DNA检测方法局限于纯生物领域的弊端。
发明内容
本发明的目的之一是基于赖氨酸对DNA的生物特异亲和性及TiO2-CdSe纳米复合材料，制备了一种特异性强，灵敏度高的光电生物传感器；
本发明的目的之二是将该传感器用于实体组织抽提DNA的检测。
本发明的技术方案如下：
1.一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法
（1）将1.0cm×2.5cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2V/s扫速，在-1.5~2.5V电位范围，在含有5×10-3mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0~9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂2~18μL的TiO2-固态CdSe复合物或2~18μL的TiO2-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂10~20μL、5~50μg/mL的目标DNA的上游引物或10~20μL、10~20μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂10~20μL、5~50μg/mL的目标DNA的下游引物或10~20μL、10~20μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
2.上述TiO2-固态CdSe复合物和TiO2-液态CdSe复合物制备
（1）TiO2的制备
0.01~0.03mol的钛酸丁酯溶于30~90ml乙醇中，逐滴加入至10~30mL超纯水中，搅拌12min，将得到的混合物转移至高压釜中，200℃下反应10h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4~8次，80℃下真空干燥12h，制得TiO2；
（2）CdSe的制备
移取0.6~1.0mL的巯基乙酸加入到60mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用1mol/LNaOH调pH至10，加入8~12mLNa2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；
所述Na2SeSO3溶液是将1~20mmolSe和5~15mmolNa2SO3加入到50mL超纯水中，90℃反应3h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1~2gCdCl2·2.5H2O溶于40mL超纯水制得；
（3）TiO2-固态CdSe复合物的制备
将0.002~0.006gTiO2，0.002~0.006g固态CdSe于5ml的离心管中，加入4mL超纯水，震荡8~12h，11000转/min、23℃下离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-固态CdSe复合物；
（4）TiO2-液态CdSe复合物的制备
0.002~0.006gTiO2与2~6mL液态CdSe于10mL的离心管中，震荡8~12h，11000转/min离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-液态CdSe复合物。
3.目标DNA及其管家基因的检测步骤
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在10~50mL、pH7~9的PBS，0.1~0.3mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1V，取样间隔20s，取样时间20s，运行时间400s，光源选择365nm、385nm、405nm、430nm、450nm、530nm、570nm、600nm，记录电流变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。
本发明的成果：
（1）L-赖氨酸有良好的热稳定性、生物亲和性，本发明中将L-赖氨酸进行电聚合，修饰于ITO电极表面，提供了可保持生物活性的固载DNA等生物大分子的方法，同时该方法不需经过预处理，电极选择性、灵敏度和重现性较好，电极响应快，测得线性范围为3.5pmol/L~30nmol/L，检测限为1.2pmol/L。
（2）本发明使用TiO2做为光电信标物质之一，拓展了TiO2的使用范畴，同时利用CdSe量子点显著的量子尺寸效应及小的粒子尺寸，增强了传感器的光电性能。
（3）本发明所检测DNA均从实际生物组织中提取，实用价值高。
具体实施方式：
为进一步说明，结合一下实施例具体说明：
实施例1一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法
（1）将1.0cm×2.5cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2V/s扫速，在-1.5~2.5V电位范围，在含有5×10-3mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂2μL的TiO2-固态CdSe复合物或2μL的TiO2-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂10μL、5μg/mL的目标DNA的上游引物或10μL、10μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂10μL、5μg/mL的目标DNA的下游引物或10μL、10μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
实施例2一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法
（1）将1.0cm×2.5cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2V/s扫速，在-1.5~2.5V电位范围，在含有5×10-3mol/L的L-赖氨酸、pH为7.4的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂10μL的TiO2-固态CdSe复合物或10μL的TiO2-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂15μL、25μg/mL的目标DNA的上游引物或15μL、15μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂15μL、30μg/mL的目标DNA的下游引物或15μL、16μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
实施例3一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法
（1）将1.0cm×2.5cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2V/s扫速，在-1.5~2.5V电位范围，在含有5×10-3mol/L的L-赖氨酸、pH为9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂18μL的TiO2-固态CdSe复合物或18μL的TiO2-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂20μL、50μg/mL的目标DNA的上游引物或20μL、20μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂20μL、50μg/mL的目标DNA的下游引物或20μL、20μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器。
实施例4TiO2-固态CdSe复合物和TiO2-液态CdSe复合物制备
（1）TiO2的制备
0.01mol的钛酸丁酯溶于30ml乙醇中，逐滴加入至10mL超纯水中，搅拌12min，将得到的混合物转移至高压釜中，200℃下反应10h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4次，80℃下真空干燥12h，制得TiO2；
（2）CdSe的制备
移取0.6mL的巯基乙酸加入到60mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用1mol/LNaOH调pH至10，加入8mLNa2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；
所述Na2SeSO3溶液是将1mmolSe和10mmolNa2SO3加入到50mL超纯水中，90℃反应3h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1.5gCdCl2·2.5H2O溶于40mL超纯水制得；
（3）TiO2-固态CdSe复合物的制备
将0.004gTiO2，0.004g固态CdSe于5ml的离心管中，加入4mL超纯水，震荡10h，11000转/min、23℃下离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-固态CdSe复合物；
（4）TiO2-液态CdSe复合物的制备
0.004gTiO2与4mL液态CdSe于10mL的离心管中，震荡10h，11000转/min离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-液态CdSe复合物。
实施例5TiO2-固态CdSe复合物和TiO2-液态CdSe复合物制备
（1）TiO2的制备
0.02mol的钛酸丁酯溶于60ml乙醇中，逐滴加入至20mL超纯水中，搅拌12min，将得到的混合物转移至高压釜中，200℃下反应10h，用超纯水和无水乙醇分别清洗6次，80℃下真空干燥12h，制得TiO2；
（2）CdSe的制备
移取0.8mL的巯基乙酸加入到60mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用1mol/LNaOH调pH至10，加入10mLNa2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；
所述Na2SeSO3溶液是将10mmolSe和10mmolNa2SO3加入到50mL超纯水中，90℃反应3h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1.5gCdCl2·2.5H2O溶于40mL超纯水制得；
（3）TiO2-固态CdSe复合物的制备
将0.003gTiO2，0.003g固态CdSe于5ml的离心管中，加入4mL超纯水，震荡10h，11000转/min、23℃下离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-固态CdSe复合物；
（4）TiO2-液态CdSe复合物的制备
0.003gTiO2与4mL液态CdSe于10mL的离心管中，震荡10h，11000转/min离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-液态CdSe复合物。
实施例6TiO2-固态CdSe复合物和TiO2-液态CdSe复合物制备
（1）TiO2的制备
0.03mol的钛酸丁酯溶于90ml乙醇中，逐滴加入至30mL超纯水中，搅拌12min，将得到的混合物转移至高压釜中，200℃下反应10h，用超纯水和无水乙醇分别清洗8次，80℃下真空干燥12h，制得TiO2；
（2）CdSe的制备
移取1.0mL的巯基乙酸加入到60mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用1mol/LNaOH调pH至10，加入12mLNa2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4h，制得液态CdSe；将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；
所述Na2SeSO3溶液是将20mmolSe和15mmolNa2SO3加入到50mL超纯水中，90℃反应3h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将2gCdCl2·2.5H2O溶于40mL超纯水制得；
（3）TiO2-固态CdSe复合物的制备
将0.006gTiO2，0.006g固态CdSe于5ml的离心管中，加入4mL超纯水，震荡12h，11000转/min、23℃下离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-固态CdSe复合物；
（4）TiO2-液态CdSe复合物的制备
0.006gTiO2与6mL液态CdSe于10mL的离心管中，震荡12h，11000转/min离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-液态CdSe复合物。
实施例7目标DNA的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在10mL、pH7的PBS，0.1mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1V，取样间隔20s，取样时间20s，运行时间400s，光源选择365nm、385nm、405nm、430nm、450nm、530nm、570nm、600nm，记录电流变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定；
（4）线性范围3.5pmol/L~25nmol/L，检测限为1.2pmol/L。
实施例8管家基因的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在50mL、pH9的PBS，0.3mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1V，取样间隔20s，取样时间20s，运行时间400s，光源选择365nm、385nm、405nm、430nm、450nm、530nm、570nm、600nm，记录电流变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品代替管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测
（4）线性范围为1.5pmol/L~15nmol/L，检测限为0.68pmol/L。
Claims (2)
1.一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将1.0cm×2.5cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min，纯氮吹干，将其作为工作电极，铂丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0.05~0.2V/s扫速，在-1.5~2.5V电位范围，在含有5×10-3mol/L的L-赖氨酸、pH为6.0~9.0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-赖氨酸，形成一层聚L-赖氨酸，真空干燥器中保存；
（2）滴涂2~18μL的TiO2-固态CdSe复合物或2~18μL的TiO2-液态CdSe复合物到（1）修饰的工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（3）继续滴涂10~20μL、5~50μg/mL的目标DNA的上游引物或10~20μL、10~20μg/mL管家DNA的上游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干；
（4）继续滴涂10~20μL、5~50μg/mL的目标DNA的下游引物或10~20μL、10~20μg/mL管家DNA的下游引物到工作电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器；
所述TiO2-固态CdSe复合物和TiO2-液态CdSe复合物，制备步骤如下：
（a）TiO2的制备
0.01~0.03mol的钛酸丁酯溶于30~90ml乙醇中，逐滴加入至10~30mL超纯水中，搅拌12min，将得到的混合物转移至高压釜中，200℃下反应10h，用超纯水和无水乙醇分别清洗4~8次，80℃下真空干燥12h，制得TiO2；
（b）CdSe的制备
移取0.6~1.0mL的巯基乙酸加入到60mL超纯水中混匀，将其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口烧瓶中，用1mol/LNaOH调pH至10，加入8~12mLNa2SeSO3溶液，加热至沸腾，回流4h，制得液态CdSe，将液态CdSe加热干燥，制得固态CdSe；
所述Na2SeSO3溶液是将1~20mmolSe和5~15mmolNa2SO3加入到50mL超纯水中，90℃反应3h，过滤去渣，制得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250mL三口烧瓶中，在搅拌状态下，将1~2gCdCl2·2.5H2O溶于40mL超纯水制得；
（d）TiO2-固态CdSe复合物的制备
将0.002~0.006gTiO2，0.002~0.006g固态CdSe于5ml的离心管中，加入4mL超纯水，震荡8~12h，11000转/min、23℃下离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-固态CdSe复合物；
（e）TiO2-液态CdSe复合物的制备
0.002~0.006gTiO2与2~6mL液态CdSe于10mL的离心管中，震荡8~12h，11000转/min离心15min，分离得到固体，将固体加入1mL超纯水，超声，制得TiO2-液态CdSe复合物。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的一种TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器在目标DNA及其管家基因的检测中的应用，检测步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的TiO2-CdSe纳米复合材料光电生物传感器为工作电极，在10~50mL、pH7~9的PBS，0.1~0.3mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1V，取样间隔20s，取样时间20s，运行时间400s，光源选择365nm、385nm、405nm、430nm、450nm、530nm、570nm、600nm，记录电流变化，绘制工作曲线；
（3）将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定。
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