CN104313133B - 一种核酸内切酶ⅷ活性测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，所述方法包括：首先根据单链DNA模板合成一段引物，其中所述引物由两部分构成，5’端的正常引物部分和3’端的末端封闭引物部分，该两部分之间以dUTP相连；将该合成引物与单链DNA模板退火形成复合物；随后在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶Ⅷ (EndoVIII)的作用下在引物的dUTP位置产生脱嘧啶位点；接着利用具有链置换活性的聚合酶合成双链DNA，然后测定反应体系中双链DNA和单链DNA的相对量，并根据该检测结果推导出核酸内切酶Ⅷ活性程度，其中核酸内切酶Ⅷ活性程度与反应体系中双链DNA的量成正相关。与现有技术相比，本发明的方法无放射性污染，操作简单便捷，可以对EndoⅧ活性进行定量的检测分析。

Description

一种核酸内切酶Ⅷ活性测定方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体来说涉及一种核酸内切酶Ⅷ活性测定方法。
背景技术
大肠杆菌EndoⅧ (Endonuclease VIII, Endo VIII) 由大肠杆菌nei基因编码。EndoVIII既有N-糖基化酶活性也有AP-裂解酶活性。N-糖基化酶活性可释放双链DNA上受损的嘧啶碱基，产生一个脱嘧啶(AP)位点。AP-裂解酶活性则分别在AP位点的3’和5’端切割磷酸二酯键，产生3’磷酸和5’磷酸末端。能被Endo Ⅷ识别并切除的受损碱基包括：尿素、5,6-二羟基胸腺嘧啶、胸腺嘧啶乙二醇、5-羟基-5-甲内酰脲、尿嘧啶乙二醇、6-羟基-5,6-二氢胸腺嘧啶和甲基羟丙二酰脲。
Endo VIII可应用于单细胞凝胶电泳或称彗星实验（Collins, A. et al.(1993). Carcinogenesis . 14, 1733-1735.）。彗星实验是简单、快捷检测DNA微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法。
此外，在分子生物学的某些领域中，Endo VIII具有独特的作用。例如，NEB公司的USERTM酶，就是一种由尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和Endo VIII组成的混合酶。UDG识别dUTP位点，将dU碱基切除，产生脱嘧啶(AP)位点。Endo VIII进而在AP位点切割，从而将核苷酸切除。这样，只要在单链或双链的特定位置引入dUTP位点，就可以用这两种酶，将单链切断，或者在双链上产生切口（Gap）。
传统的EndoⅧ测活方法采用的是一种半定量的检测方法。首先合成一条末端荧光标记的34mer的双链寡核苷酸，其中一条链的中间有一个dUTP。用UDG将dU碱基切除后，产生AP位点。再将EndoⅧ做一系列的稀释倍数进行反应，用变性胶电泳分离单链产物。结果用电泳图谱的分析存在相当强的主观性，缺乏定量指导，不能准确测定切刻内切酶的活性，从而不能很好地保持批次之间的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于建立一种简便、快速、非放射性且定量的EndoⅧ测活方法，其原理如图1所示。
具体来说，本发明采用以下技术方案：
一种核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：首先根据单链DNA模板合成一段引物，其中所述引物由两部分构成，5’端的正常引物部分和3’端的末端封闭引物部分，该两部分之间以dUTP相连；将该合成引物与单链DNA模板退火形成复合物；随后在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶Ⅷ (EndoVIII)的作用下在引物的dUTP位置产生脱嘧啶位点；接着利用具有链置换活性的聚合酶合成双链DNA，然后测定反应体系中双链DNA和单链DNA的相对量，并根据该检测结果推导出核酸内切酶Ⅷ活性程度，其中核酸内切酶Ⅷ活性程度与反应体系中双链DNA的量成正相关。
优选地，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料，例如可在市面上商购获得的picogreen染料。
优选地，所采用的单链DNA模板是单链环状DNA模板，聚合反应所形成的双链DNA是在该单链环状DNA模板上形成互补链而形成的双链环状DNA。更优选，所采用的单链DNA模板是M13噬菌体单链DNA，以利于建立标准的测定方法。
作为建立标准测定方法的一个优选实例，所采用的具有链置换活性的聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I。
本发明的优点：
1. 无放射性污染；
2. 操作步骤简单快速，重复性好，稳定性强；
3. 可以对EndoⅧ活性进行定量的检测分析，引物设计容易，便于操作。
附图说明
图1是本发明测定方法的原理图。
图2是采用本发明方法获得的酶活-荧光曲线图。
具体实施方式
本发明建立了一种简便、快速、非放射性且定量的EndoⅧ测活方法，其原理如图1所示。
如图1所示，合成中间有一个dUTP的末端封闭的引物，用该末端封闭引物和单链模板如M13单链环状DNA配制成模板/末端封闭引物复合物，如M13模板/末端封闭引物复合物，当用UDG（将dUTP去掉）和EndoⅧ（断裂磷酸二酯键）作用在M13模板/末端封闭引物复合物上时，可产生一个AP位点，将末端封闭引物切成两部分，形成一个前端与M13单链环状DNA匹配的正常引物和一个后端与M13单链环状DNA不匹配的引物末端封闭引物，大肠杆菌聚合酶Ⅰ可以M13单链环状DNA为模板，以正常引物为引物（加入UDG和EndoⅧ）进行聚合反应。大肠杆菌聚合酶I的链置换活性可将后面的末端封闭引物引物替换下来，继续向3’端进行延伸，生成M13双链DNA。M13双链DNA可被双链特异性的picogreen染料结合，产生荧光。而大肠杆菌聚合酶Ⅰ不能在只有末端封闭引物存在时进行聚合反应，因为引物的末端是封闭的，由此不能生成M13双链DNA，picogreen染料不能结合单链DNA，从而不能产生荧光。
在UDG酶量固定的情况下，EndoⅧ的活性在一定范围内同生成的正常引物的量成正比；而在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ活性一定的情况下，正常引物的量同荧光强度成正比。因此，本发明将EndoⅧ的测活体系同大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的聚合反应体系偶联起来。
本发明人进一步证明了上述假设，从而建立了非放射性、简便、快速且可以定量的EndoⅧ测活方法。
下面将结合具体实施例进一步说明本发明。
实施例1. 荧光法测定核酸内切酶VIII的内切酶活性
M13模板/末端封闭引物复合物的制备：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
引物M13末端封闭引物：5’-aagccatccgcaaaaaugacctct-3’（3’包括但不限于磷酸化，氨基化，间隔子-C7，生物素化等修饰）；
M13模板/末端封闭引物复合物：将M13mp18单链DNA同M13末端封闭引物按摩尔比1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
M13模板/正常引物复合物的制备：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
引物M13正常引物：5’-aagccatccgcaaaaa-3’
M13模板/正常引物复合物：将M13mp18单链DNA同M13正常引物按摩尔比1:1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
M13模板/正常引物/末端封闭引物-短复合物的制备：
M13单链DNA：M13mp18单链DNA (NEB)；
引物M13正常引物：5’-aagccatccgcaaaaa-3’
引物M13末端封闭引物-短：5’-gacctct-3’ （3’包括但不限于磷酸化，氨基化，间隔子-C7，生物素化等修饰）；
M13模板/正常引物/末端封闭引物-短复合物：将M13mp18单链DNA同M13正常引物、M13末端封闭引物-短按摩尔比1:1:1混合，在退火缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mMNaCl）中，70℃加热5分钟后，缓慢降至室温，使模板引物退火。
切刻反应：
UDG为NEB M0280L；
EndoⅧ为NEB 0299L，活性定义为在10 μl缓冲液体系中，37℃条件下，1小时内能够切割1 pmol含一个AP位点*的34 mer寡核苷酸双链所需要的酶量为1U。
UDG反应
温度 时间
25℃ 30分钟
4℃ 保持
EndoⅧ反应
DNA聚合酶反应：
*1-12号管加入对应管号的EndoVIII反应产物。
温度 时间
37℃ 30分钟
4℃ 保持。
picogreen荧光检测
向反应产物中加入0.5 μl picogreen染料（invitrogen P11495）；用荧光酶标仪检测，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。检测结果如下表：
管号 荧光数值
1 179
2 180
3 190
4 196
5 223
6 299
7 535
8 926
9 1458
10 1691
11 1739
12 1748
13 185
14 1731
这一结果表明：
a. 末端封闭引物的末端是封闭的，不能被大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ催化聚合反应，不能生成M13双链DNA；
b.在UDG存在的条件下，EndoⅧ可以将引物末端封闭引物切成两部分，从而生成末端不封闭的正常引物，从而可被大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ催化进行聚合反应，生成M13双链DNA。在一定范围内，EndoⅧ活性与正常引物的量成正相关，而正常引物的量又显然与picogreen荧光强度成正相关，因此切刻内切酶的活性与荧光强度成正相关，这点已被上表的结果所证明。
c. 1号数值与2号相比没有明显差异，说明聚合酶反应体系中的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ酶量是足量的；12号数值和14号相比没有明显差异，说明EndoⅧ的稀释梯度已达到了切刻反应所需的最大酶量。
通过本实施例，我们将EndoⅧ的反应同大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的聚合反应偶联起来，可以实现对EndoⅧ活性的快速、简便的表征，为后续EndoⅧ活性的精确测定奠定了基础。
本方法的原理如图1所示。
实施例2. EndoⅧ活性-荧光强度曲线的绘制及EC50计算
以2#-12#的EndoⅧ活性单位(mU)的log值为横坐标，荧光强度为纵坐标，用GraphPad Prism5做非线性回归曲线。我们发现，这些数据点可以很好地拟合出一条S型曲线，如图2所示。
通过多次重复实验并计算曲线的半最大效应浓度 (EC50)，我们发现，EC50值在多次实验间保持稳定：
实验 EC50 (mU)
1 6.550
2 6.724
3 7.139
4 6.729
5 6.903
平均值 (mU) 6.81
标准差SD (U) 0.22
变异系数 CV (%) 3.27
因此，这一EC50值可作为本方法中切刻内切酶活性定义。即在实施例1的反应体系中，使荧光强度达到最大值一半的酶量定义为1个荧光法活性单位（fluorescence unit,FU）；1 FU= 6.81mU (NEB unit)。
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (6)

1.一种核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：首先根据单链DNA模板合成一段引物，其中所述引物由两部分构成，5’端的正常引物部分和3’端的末端封闭引物部分，该两部分之间以dUTP相连；将该合成引物与单链DNA模板退火形成复合物；随后在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和核酸内切酶Ⅷ (EndoVIII)的作用下在引物的dUTP位置产生脱嘧啶位点；接着利用具有链置换活性的聚合酶合成双链DNA，然后利用荧光染料通过荧光法测定反应体系中双链DNA和单链DNA的相对量，并且以荧光强度表示双链DNA或单链DNA的相对量，并根据该检测结果推导出核酸内切酶Ⅷ活性程度，其中核酸内切酶Ⅷ活性程度与反应体系中双链DNA的量成正相关。
2.如权利要求1所述的核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料是双链DNA特异性荧光染料。
3.如权利要求2所述的核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是picogreen染料。
4.如权利要求1所述的核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模板是单链环状DNA模板，聚合反应所形成的双链DNA是在该单链环状DNA模板上形成互补链而形成的双链环状DNA。
5.如权利要求4所述的核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，其特征在于，所采用的单链DNA模板是M13噬菌体单链DNA。
6.如权利要求1所述的核酸内切酶Ⅷ活性测定方法，其特征在于，所采用的具有链置换活性的聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I。
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