CN104312924B - 雪白丝衣霉菌ff1-2及其筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种雪白丝衣霉菌株，命名为雪白丝衣霉菌FF1-2，保藏编号为CCTCC？NO：M2013547。雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的筛选方法由分离、纯化步骤组成。雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在棒曲霉素降解中的用途。采用本发明筛选方法筛选出的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株，在含有500μg/mL棒曲霉素的液体培养基中使用，降解率达到100％，在含有500μg/mL棒曲霉素的苹果浆中使用，降解率达到97％以上，降解率不受待降解物的pH值的影响。可应用于水果及其制品、果渣饲料生产中。

Description

雪白丝衣霉菌FF1-2及其筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及到雪白丝衣霉的一种菌株。
背景技术
棒曲霉素(Patulin，PAT)，又称展青霉素，是一种具有较强毒性的真菌代谢产物，晶体无色棱形，分子式为C7H6O4，分子量为154，化学名称为4-羟基4-氢-呋喃(3,2-碳)骈吡喃-2(6-氢)酮[4-hydroxy-4-H-furo(3,2c)pyran-2(6H)-one]。具有基因毒性和细胞毒性，能导致哺乳动物细胞的DNA损伤，染色体畸变，并具有致癌性，免疫毒性和生殖毒性，在动物活体内，会损害肾脏、肝脏和肠等器官组织，长期或短期接触棒曲霉素会引起人及动物严重的健康问题。
除棒曲霉以外，多种真菌可以产生棒曲霉素。在许多因霉菌腐败的水果，如苹果、杏子、蓝莓、樱桃、葡萄、梨、桃子和李子及其制品中都有发现，以苹果发霉最易产生该种毒素。在酸性条件下，该毒素稳定，耐热，在水果制品生产过程中不易去除，成为判断食品质量安全的一个重要指标，受到世界各国及国际组织的极大关注。我国是水果及其制品生产和出口的大国，棒曲霉素的污染问题，也成为限制我国水果及制品出口的瓶颈问题之一。因此，为了保障人们的食品安全和身体健康，保证水果制品的顺利出口，研发环保、安全、经济、高效、实用的棒曲霉素新型脱除技术显得尤为重要。
目前，对棒曲霉素采用的脱毒方法主要是物理吸附，辐照处理，化学处理和生物降解。虽然所有的这些处理都在一定程度上减轻毒素污染，但其不足在于：吸附脱除法处理，棒曲霉素没有得到根本的降解，而是转移进了吸附剂，水，果渣和沉淀物中，依然对食用果渣饲料的动物及环境造成潜在的危害(张小平等,苹果汁中棒曲霉素控制技术研究进展.中国农业科学，2004，37(11):1672-1676)；辐照和化学处理法可能造成水果制品重要营养物质的丢失，品质劣化，成本较高等。
由于物理和化学方法去除棒曲霉素存在种种应用缺陷，目前生物降解成为安全、高效且环保的解毒方法而备受国内外关注，研究对象主要是酵母菌。培养液中棒曲霉素的浓度不超过200μg/mL时，降解率最高可达到99％，同样条件处理果汁效果极不理想(Harwig等，DisappearanceofpatulinfromapplejuicefermentedbySaccharomycesspp.CanInstFoodSciTechnolJ，1973，6(1):45-46.Stinson等，Disappearanceofpatulinduringalcoholicfermentationofapplejuice.ApplEnvironMicrobiol，1978，36(4):620–622；Castoria等，ConversionoftheMycotoxinPatulintotheLessToxicDesoxypatulinicAcidbytheBiocontrolYeastRhodosporidiumkratochvilovaeStrainLS11，JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2011,59(21):11571-11578.)。利用酵母菌进行棒曲霉素的生物控制是有效的，但酵母本身对该毒素是敏感的，当浓度大于200μg/mL时，酵母发酵解毒就会被完全抑制(Sumbu等，Actionofpatulinonayeast.ApplEnvironMicrobiol,1983，45(1):110–115)。因此，生物方法降解更高浓度棒曲霉素的研究还未见报道。
由于微生物数量大、种类多，基因资源丰富，几乎所有导致环境污染的有机物都能被微生物所分解，而且干净彻底、无二次污染。因此，寻找不同微生物消除棒曲霉素污染的潜力巨大。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于提供一株雪白丝衣霉菌FF1-2。
本发明所要解决的另一个技术问题在于为雪白丝衣霉菌FF1-2菌株提供一种筛选方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于为雪白丝衣霉菌FF1-2菌株提供一种新用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：命名为雪白丝衣霉菌FF1-2，于2013年11月5日保藏于武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013547。
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的ITS-5.8SrDNA序列为：
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的菌落形态：
按照常规操作，接种雪白丝衣霉菌FF1-2菌株于MEA培养基(由青岛日水生物技术有限公司生产)上，28℃培养5天观察单菌落形态呈乳白色，绒毛状，直径为3～4cm，继续培养，菌落铺满整个培养皿，直径为9cm，背面呈榄褐色，并逐渐变黑，有轻微芳香气味。
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株主要产孢结构的形态特征为：
分生孢子梗顶端多次轮生细的烧瓶状分生孢子梗，内壁芽生瓶梗式产孢。瓶梗基部膨大，顶端变尖细呈长柄状。分生孢子生于分生孢子梗的顶端，椭圆形，无色，单胞，3～5μm×2～4μm，形成短链状。厚垣孢子球形，褐色，直径6～8μm，间生或顶生。
上述雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的筛选方法如下：
1、分离
含有雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的酒窖窖泥每1.0g加入到装有50～100mL无机盐液体培养基的三角瓶中，加入7mg/mL的棒曲霉素水溶液作为碳源，棒曲霉素购于Sigma公司，使棒曲霉素的终浓度为0.3mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制成培养物，吸取5ml培养物转接于50～100mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.45mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制备成菌悬液。取5ml菌悬液于50～100mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.6mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时，选择含有微生物的菌悬液重复1次得最终菌悬液。
2、纯化
吸取0.5mL最终菌悬液，涂布于含0.5mg/mL棒曲霉素的无机盐固体培养基上，37℃避光培养至长出单菌落，挑取较大的单菌落，获得纯培养物，于PDA固体培养基富集，得到雪白丝衣霉菌株，命名为雪白丝衣霉菌FF1-2，PDA斜面4℃保存。
在本发明筛选方法的分离步骤1中的无机盐液体培养基由下述的原料及其配比制备成：
搅拌溶解，调pH至5.0，121℃灭菌20分钟，制备成无机盐液体培养基。
在纯化步骤2的无机盐固体培养基的原料及其配比是在无机盐液体培养基的原料配比基础上增加琼脂20g，于灭菌前加入，制备成无机盐固体培养基。
上述雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在棒曲霉素降解中的用途。使用方法如下：
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株于PDA斜面37℃活化7天，加入10mL无菌水，制备成浓度为106个/mL的孢子悬液，用高效液相色谱仪检测待降解物中棒曲霉素的含量，待降解物的pH值为3～5时，加入孢子悬液，使每含1μg棒曲霉素的待降解物中含有20～200个孢子，30～37℃振荡培养至检测不出棒曲霉素或30～37℃存放至检测不出棒曲霉素止。上述的含棒曲霉素的待降解物可以是苹果汁、苹果渣、苹果浆、培养液以及含有棒曲霉素的水果制品。
采用本发明筛选方法筛选出的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株，在含有500μg/mL棒曲霉素的液体培养基中使用，降解率达到100％，在含有500μg/mL棒曲霉素的苹果浆中使用，降解率达到97％以上，降解率不受待降解物的pH值的影响。
附图说明
图1是雪白丝衣霉菌FF1-2在MEA培养基上培养5天的菌落形态照片。
图2是雪白丝衣霉菌FF1-2在MEA培养基上培养9天的菌落形态照片。
图3是雪白丝衣霉菌FF1-2在显微镜下放大400倍的菌丝及厚垣孢子照片。
图4是雪白丝衣霉菌FF1-2在显微镜下放大400倍的分生孢子照片。
图5是雪白丝衣霉菌FF1-2的ITS-5.8SrDNA序列拼接结果。
图6是雪白丝衣霉菌FF1-2基于ITS-5.8SrDNA序列的邻接法系统发育树。
图7是雪白丝衣霉菌FF1-2在培养液中降解棒曲霉素5天时的高效液相色谱图。
图8是对照组未经雪白丝衣霉菌FF1-2降解的培养液稀释5倍后的高效液相色谱图。
图9是不同pH环境下雪白丝衣霉菌FF1-2的降解率曲线图。
图10是不同时间雪白丝衣霉菌FF1-2对苹果浆中棒曲霉素的降解率图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
命名为雪白丝衣霉菌FF1-2菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013547。
雪白丝衣霉菌FF1-2的ITS-5.8SrDNA序列为：
上述雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的筛选方法如下：
1、分离
含有雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的酒窖窖泥每1.0g加入到装有75mL无机盐液体培养基的三角瓶中，加入7mg/mL的棒曲霉素水溶液作为碳源，使棒曲霉素的终浓度为0.3mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制成培养物，吸取5ml培养物转接于75mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.45mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制备成菌悬液。取5ml菌悬液于75mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.6mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时，选择含有微生物的菌悬液重复1次得最终菌悬液。
上述的无机盐液体培养基由下述的原料及其配比按常规方法制成：
搅拌溶解，调pH至5.0，121℃灭菌20分钟，制备成无机盐液体培养基。
2、纯化
吸取0.5mL最终菌悬液，涂布于含0.5mg/mL棒曲霉素的无机盐固体培养基上，37℃避光培养至长出单菌落，挑取较大的单菌落，获得纯培养物，于PDA固体培养基富集，得到雪白丝衣霉菌株，命名为雪白丝衣霉菌FF1-2，PDA斜面4℃保存。
上述的无机盐固体培养基由下述的原料及其配比按常规方法制成：
所用的原料在无机盐液体培养基的原料配比基础上增加琼脂20g，于灭菌前加入，制备成无机盐固体培养基。
对采用本实施例筛选的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株进行了形态学鉴定以及分子生物学分类鉴定，各种试验情况如下：
1、形态学鉴定
(1)菌落形态
按照常规操作，接种雪白丝衣霉菌FF1-2菌株于MEA培养基上，28℃培养5天观察单菌落形态见图1，由图1可见，该菌菌落呈乳白色，绒毛状，直径3～4cm。继续培养4天，菌落铺满整个培养皿，直径为9cm，背面呈榄褐色，并逐渐变黑，如图2所示，有轻微芳香气味。
(2)主要产孢结构的形态特征
用400倍的显微镜观察雪白丝衣霉菌FF1-2菌株，菌丝及厚垣孢子形态观察结果见图3，分生孢子形态观察结果见图4。由图3可见，厚垣孢子呈球形、褐色，直径为6～8μm，间生或顶生；由图4可见，分生孢子梗顶端多次轮生细的烧瓶状分生孢子梗，内壁芽生瓶梗式产孢，瓶梗基部膨大，顶端变尖细呈长柄状，分生孢子生于分生孢子梗的顶端、椭圆形、无色、单胞、3～5μm×2～4μm，形成短链状。
2、分子生物学分类鉴定
将雪白丝衣霉菌FF1-2菌株送南京金斯瑞生物科技有限公司进行ITS-5.8SrDNA序列扩增和测序分析，结果见如图5和序列表。
用NCBI的BLAST分析工具，将雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的ITS-5.8SrDNA序列与GenBank数据库中的其他DNA序列进行序列比对分析，并用mega软件构建依赖于ITS-5.8SrDNA序列的邻接法系统发育树，计算菌株间的序列相似性，结果见图6。由图6可见，雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的ITS-5.8SrDNA序列与已公布的雪白丝衣霉菌(Byssochlamysnivea)序列相似性达98.0％。雪白丝衣霉菌FF1-2菌株可归于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，散囊菌纲(Eurotiomycets)，发菌科(Trichocomaceae)丝衣霉属(Byssochlamys)。与丝衣霉属中已公布的雪白丝衣霉菌(Byssochlamysnivea)分类地位更为相近。
将雪白丝衣霉菌FF1-2(ByssochlamysniveaFF1-2)寄存于中国武汉，中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO：M2013547。
实施例2
本实施例的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的筛选方法如下：
在分离步骤1中，将含有雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的酒窖窖泥每1.0g加入到装有50mL无机盐液体培养基的三角瓶中，加入7mg/mL的棒曲霉素水溶液作为碳源，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制成培养物，吸取5ml培养物转接于50mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.45mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制备成菌悬液。取5ml菌悬液于50mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.6mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时，选择含有微生物的菌悬液重复1次得最终菌悬液。该步骤中，所用的无机盐液体培养基的原料及其配比和制备方法与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同。筛选出雪白丝衣霉菌FF1-2菌株。
实施例3
本实施例的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的筛选方法如下：
在分离步骤1中，将含有雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的酒窖窖泥每1.0g加入到装有100mL无机盐液体培养基的三角瓶中，加入7mg/mL的棒曲霉素水溶液作为碳源，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制成培养物，吸取5ml培养物转接于100mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.45mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时制备成菌悬液。取5ml菌悬液于100mL无机盐液体培养基中，加入相同浓度的棒曲霉素水溶液，使棒曲霉素的终浓度为0.6mg/mL，37℃，200r/min避光振荡培养120小时，选择含有微生物的菌悬液重复1次得最终菌悬液。该步骤中，所用的无机盐液体培养基的原料及其配比和制备方法与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同。筛选出雪白丝衣霉菌FF1-2菌株。
实施例4
采用实施例1筛选的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在含有棒曲霉素培养液中的降解用途，其使用方法如下：
1、棒曲霉素母液的配制
将棒曲霉素(购于Sigma公司)配制成浓度为5mg/mL的母液。配制方法为：吸取2mLpH为4.0的冰醋酸水溶液，溶解10mg棒曲霉素。
2、配制含有500μg/mL棒曲霉素的培养液
马铃薯去皮，200g切块煮沸30分钟，用纱布过滤，补足水至1000mL，用1mol/L的盐酸水溶液调pH至4.0，121.3℃灭菌20分钟，配制成PDA无糖液体培养基。临用前每8mLPDA无糖液体培养基中添加5mg/mL棒曲霉素母液1mL，配制成含有棒曲霉素的培养液9mL。
3、雪白丝衣霉菌FF1-2菌株降解培养液中的棒曲霉素
将雪白丝衣霉菌FF1-2菌株于PDA斜面37℃活化7天，加入10mL无菌水，制备成浓度为106个/mL的孢子悬液。吸取孢子悬液1mL，加入上述的含有棒曲霉素的培养液9mL中，总体积10mL，棒曲霉素浓度为500μg/mL，对照组，吸取1mL无菌水于棒曲霉素浓度相同的9mL的培养液中。各2组平行。37℃，200r/min避光振荡培养5天，10000r/min离心10min，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱法(HPLC)检测其中残留的棒曲霉素。对照组稀释5倍后检测。
高效液相色谱法(HPLC)检测棒曲霉素按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008--2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》进行对比检测，检测结果见图7、图8。由图7可见，37℃，200r/min避光振荡培养雪白丝衣霉菌FF1-2菌株5天，培养液中检测不出棒曲霉素，由图8可见，对照中残余92％以上的棒曲霉素。
实施例5
采用实施例1筛选的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在含有棒曲霉素培养液中的降解用途，其使用方法如下：
棒曲霉素母液的配制步骤1与实施例4相同。
在配制含有500μg/mL棒曲霉素的培养液步骤2中，马铃薯去皮，200g切块煮沸30分钟，用纱布过滤，补足水至1000mL，用1mol/L的盐酸水溶液分别调pH至3.0、4.0、5.0。该步骤中的其他步骤与实施例4相同。
在雪白丝衣霉菌FF1-2菌株降解培养液中的棒曲霉素步骤3中，将雪白丝衣霉菌FF1-2菌株于PDA斜面37℃活化7天，加入10mL无菌水，制备成浓度为106个/mL的孢子悬液。吸取孢子悬液1mL，加入上述的含有棒曲霉素的培养液9mL中，总体积10mL，棒曲霉素浓度为500μg/mL。30℃，200r/min避光振荡培养3、5、7天，分别取样0.5mL，0.22μm微孔滤膜过滤，冻存。高效液相色谱法(HPLC)检测其中残留的棒曲霉素。高效液相色谱法(HPLC)检测棒曲霉素按照中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2008--2007《进出口果汁中棒曲霉毒素的检测方法高效液相色谱法》进行检测，计算降解率：
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在上述环境中均可旺盛生长，形成直径0.1～0.5cm不等的菌丝球。降解率结果见图9。由图9可见，pH的变化(pH为3.0、4.0、5.0)对雪白丝衣霉菌FF1-2菌株的降解能力影响不显著，在30℃，5天后雪白丝衣霉菌FF1-2菌株可降解棒曲霉素97％以上，7天时降解完全。
实施例6
采用实施例1筛选的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在含有棒曲霉素苹果浆中的降解用途，其使用方法如下：
取经过灭菌后不含棒曲霉素的苹果浆500g平均分装于5个三角瓶内，每瓶内加入7mg/mL的棒曲霉素水溶液7.2mL，使苹果浆中棒曲霉素的浓度为500μg/mL。苹果浆的pH值为3～5。
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株于PDA斜面37℃活化7天，加入10mL无菌水，制备成浓度为106个/mL的孢子悬液。在上述4瓶苹果浆中分别加入孢子悬液1mL，37℃避光培养2天，5天，7天，10天。对照组加入无菌水1mL、37℃避光培养10d。取出培养物分别研磨捣碎，每瓶加入150mL乙酸乙酯，振荡抽提1h，无水硫酸钠过滤，收集有机相，重复3次，合并有机相，在42℃下，减压旋转蒸馏至干。pH＝4.0的冰醋酸水溶液15mL溶出，冻存。整个操作过程避光处理。
高效液相色谱法(HPLC)检测其中残留的棒曲霉素。计算降解率：
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在上述苹果浆环境中均可旺盛生长，形成白色菌丝，降解结果见图9，在37℃，5天雪白丝衣霉菌FF1-2菌株降解苹果浆中的棒曲霉素51％以上、7天降解苹果浆中的棒曲霉素超过81％、10天降解苹果浆中的棒曲霉素超过97％。

Claims (3)

1.一种雪白丝衣霉菌株，命名为雪白丝衣霉菌(Byssochlamysnivea)FF1-2，保藏编号为CCTCCNO：M2013547。
2.权利要求1所述的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在棒曲霉素降解中的用途。
3.根据权利要求2所述的雪白丝衣霉菌FF1-2菌株在棒曲霉素降解中的用途，其特征在于用该菌株降解棒曲霉素的方法如下：
雪白丝衣霉菌FF1-2菌株于PDA斜面37℃活化7天，加入10mL无菌水，制备成浓度为106个/mL的孢子悬液，用高效液相色谱仪检测待降解物中棒曲霉素的含量，待降解物的pH值为3～5时，加入孢子悬液，使每含1μg棒曲霉素的待降解物中含有20～200个孢子，30～37℃振荡培养至检测不出棒曲霉素或30～37℃存放至检测不出棒曲霉素止；
上述的含棒曲霉素的待降解物是苹果汁、苹果渣、苹果浆、培养液或者含有棒曲霉素的水果制品。
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