CN104311661A - 一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，利用本发明方法制备的抗猪仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体，是一种针对仔猪大肠杆菌疾病具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂，能针对仔猪大肠杆菌病进行有效的防治；其制备方法采用辛酸沉淀法提取抗仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。

Description

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法。

背景技术

仔猪大肠杆菌病是由致病性大肠埃希菌引起的仔猪疾病的总称，包括仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病三种。已知引起仔猪大肠杆菌病的主要病原带有K88、K99、987P和F41纤毛抗原的大肠杆菌。本病主要发生于母猪场和集约化猪场，窝内传染快，发病率90％以上，病死率可高达70％；同时，一旦传入猪场，就可能连续发生，数年不断，很难根除。给规模化猪场的疾病防控带来很大困难。

目前主要用疫苗免疫来预防该疾病的发生，通过免疫孕期母猪，小猪通过初乳获得母源抗体。然而对于未接种疫苗的个体，当其感染上述病症后临床上主要采取对症治疗和抗生素类药物预防并发症的发生，但是由于该病发病急、致死率高，上述治疗方法的效果不理想。因此，急需一种针对仔猪大肠杆菌病特异性强、抗菌谱广、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法。以实现注射一种针剂即可较全面的治疗因各型大肠杆菌抗原菌株所导致的疾病，同时具有较明显的疗效。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

优选的，步骤2)所述的四联灭活疫苗中K88纤毛抗原含量不小于100单位/mL，F41纤毛抗原含量不小于100单位/mL，K99纤毛抗原含量不小于50单位/mL，987P纤毛抗原含量不小于50单位/mL，总菌数不超过2×10¹⁰个/mL。

优选的，步骤2)中对活鸡的免疫次数为2次。

优选的，步骤3)所述的蛋黄中抗大肠杆菌K88纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌K99纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌F41纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌987P纤毛的特异抗体效价均不低于1:64。

优选的，步骤3)中消毒方法为：用水将高免鸡蛋外表洗净，再用0.01～0.1％的百毒杀浸泡3-5min，擦干，再用乙醇溶液擦洗，晾干。

优选的，步骤3)中甲醛溶液的加入量为：保证加入甲醛后得到的混合溶液中甲醛浓度为0.1％(v/v)。

针对以上技术方案及其各优选方案的任一项，可以进行如下优选：

步骤3)所述的辛酸沉淀法提取抗体包括以下步骤：

a)取醋酸盐缓冲液与蛋黄混合，调整混合液pH至4.2～4.8，即得到蛋黄稀释液，向蛋黄稀释液中滴加辛酸，而后静置沉淀；

b)将步骤a)得到的产物离心，收集上清，向其中加入PBS缓冲液，再调整其pH至6.8～7.6，即得到含抗体的上清液。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)中辛酸的滴加时间不超过30min。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)醋酸盐缓冲液与蛋黄的混合比例为(3～7):1(v/v)。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)中辛酸的滴加量为：每mL稀释蛋黄液滴加14～18μL辛酸。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)中辛酸的滴加在室温温度下进行。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)中辛酸的滴加条件为：在对蛋黄稀释液进行搅拌的条件下滴加。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)中滴加辛酸前对蛋黄稀释液置于0～10℃静置。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)所述的静置沉淀是在0～10℃进行的。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)所述的静置沉淀时间为1～3h。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤a)中调整pH至4.5。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤b)中PBS缓冲液的加入量为收集得到的上清液体积的1/5～1/20。

在以上辛酸沉淀法提取抗体具体步骤的基础上优选的，步骤b)调整pH至7.2。

在以上技术方案中，所述PBS缓冲液是本技术领域的通用配方；所述醋酸盐缓冲液可以是本技术领域通用的配方，也可以是以下具体配方：取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5(电位滴定法)，用水稀释至100ml即得。

在以上技术方案中，抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备完毕后还应对产物进行抗体效价测定，其具体方法可以是用ELISA法，分别用K88、K99、987p、F41作为包被抗原分别测定其抗体效价。

利用本发明方法制备的抗猪仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体，是一种针对仔猪大肠杆菌疾病具有特异性、治疗效果好且疗效迅速的治疗制剂，能针对仔猪大肠杆菌病进行有效的防治；其制备方法采用辛酸沉淀法提取抗仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体，该法安全、价格低廉，适于大规模生产，且制备的蛋黄抗体纯度高、效价高、性质稳定、易于保存。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用到的仪器、试剂，如无特殊说明，均为市售常规产品。

实施例1制备猪仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联灭活疫苗

用LB液体培养基培养带有K88、K99、987p和F41纤毛抗原的菌株培养物，经浓缩提高抗原浓度，经甲醛灭活加氢氧化铝胶混匀制备完成。

该苗每毫升成品苗中K88和F41两种纤毛抗原含量≥100个抗原单位，K99和987p两种纤毛抗原含量均≥50个抗原单位，总菌数≤200亿个。该疫苗静止后分层，上层为白色澄清液体，下层为乳白色沉淀物，振摇混匀呈均一浑浊液；疫苗细菌检验应无活菌存在。

实施例2制备猪仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联的高免鸡蛋

(1)选择健康未免疫高产蛋鸡隔离饲养，加强饲料营养，同时加喂头孢噻呋钠以预防细菌感染；

(2)用制备好抗仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联的灭活苗免疫步骤(1)处理过的高免蛋鸡，具体步骤为：

进行三次免疫，首免耳后肌肉注射1-2ml，2周后二免，注射免疫用疫苗1-2ml，再隔2周三免，注射免疫用疫苗1-2ml；

(3)免疫高产蛋鸡后，收集得到的高免鸡蛋。

实施例3利用实施例2制备的高免鸡蛋制备精制蛋黄抗体

(1)分离高免鸡蛋蛋黄：

在实施例2所述二免后1周开始每隔7天抽样分别测定鸡蛋蛋黄中抗大肠杆菌K88、K99、F41、987P纤毛的特异抗体效价，抗体效价均达到1:64以上时收集蛋黄，所述收集蛋黄的具体方法为：将实施例2得到的高免鸡蛋用清水洗净，再用0.05％的百毒杀浸泡3-5min，然后用纱布擦干，再用75％乙醇擦洗一遍，晾干，送入蛋清蛋黄分离机进行蛋黄分离；

(2)制备精制蛋黄抗体：

将步骤(1)所分离的蛋黄中加入醋酸缓冲液进行稀释，其中，蛋黄与醋酸缓冲液的体积比为1：5，所述醋酸缓冲液是指PH3.5的醋酸盐缓冲液，取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5(电位滴定法)，用水稀释至100ml即得；用酸调PH至4.5；按每毫升稀释蛋黄液加16μL辛酸的比例在室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，低温下静置2h，然后以10000r/min的转速离心30min，弃沉淀；上清液经过滤后，加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用碱调PH至7.2；将40％甲醛溶液与该上清液混合，使甲醛的终浓度达到0.1％(V/V)，充分搅拌均匀；

(3)抗体效价的测定：

将步骤(2)最终所得滤液分别进行大肠杆菌K88、K99、F41、987P纤毛抗体效价，运用ELISA，分别用K88、K99、987p、F41作为包被抗原分别进行测定。

实施例4临床疗效试验

1、材料与方法

(1)试验材料

利用实施例3中方法制备得到的抗仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体，抗体效价为1：64。

毒株仔猪大肠杆菌K88、K99、F41、987P强毒分离株。

实验动物3日龄健康仔猪30头。

(2)试验方法

选择洁净级广西巴马小型猪，隔离饲养观察一周后，供试验用。

将试验猪随机分成三组，第一组为空白对照组(10头)，第二组为攻毒对照组(10头)，第三组为攻毒治疗组(10头)。第一组为空白对照组，不注射任何药品，隔离饲养。第二组和第三组每头肌肉注射仔猪大肠杆菌K88、K99、F41、987P强菌株(TCID₅₀:106.5/ml)2ml。于攻毒后24小时给第三组每头皮下注射2ml实施例2所述仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体(1:64)，第二组皮下注射生理盐水2ml。观察猪的发病和死亡情况至第21天。

2、试验结果与分析

抗仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体对仔猪大肠杆菌病的临床疗效试验结果，详见表1。

表1仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体对仔猪大肠杆菌病的临

床疗效试验结果

编号	组别	发病率％	死亡率％	有效率％
					第一组	空白对照组	0	0	100
第二组	攻毒对照组	90	80	20
					第三组	攻毒治疗组	20	0	100

由表1可见，第一组未出现任何临床症状，没有发病和死亡；第二组于攻毒后有9头发病，8头死亡，病猪于攻毒后2天表现为体温升高41℃以上，呼吸困难，食欲下降，消受和腹泻等症状；第三组于攻毒后有3头发病，没有死亡。病猪于攻毒后3天表现为食欲下降，精神沉郁，轻微咳嗽等症状，但5天后症状逐渐减轻后恢复。

试验结果表明：抗仔猪大肠杆菌K88-K99-F41-987P四联精制蛋黄抗体对仔猪大肠杆菌病具有良好的治疗效果，疗效显著。

实施例5制备方法实例

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

实施例6制备方法实例

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

在以上技术方案中，

步骤2)所述的四联灭活疫苗中K88纤毛抗原含量为200单位/mL，F41纤毛抗原含量为180单位/mL，K99纤毛抗原含量为120单位/mL，987P纤毛抗原含量为70单位/mL，总菌数不超过2×10¹⁰个/mL。

步骤2)中对活鸡的免疫次数为4次。

步骤3)所述的蛋黄中抗大肠杆菌K88纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌K99纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌F41纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌987P纤毛的特异抗体效价均不低于1:64。

步骤3)中消毒方法为：用水将高免鸡蛋外表洗净，再用0.01％的百毒杀浸泡7min，擦干，再用乙醇溶液擦洗，晾干。

步骤3)中甲醛溶液的加入量为：保证加入甲醛后得到的混合溶液中甲醛浓度为0.1％(v/v)。

实施例7制备方法实例

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

在以上技术方案中：

步骤2)所述的四联灭活疫苗中K88纤毛抗原含量为120单位/mL，F41纤毛抗原含量为210单位/mL，K99纤毛抗原含量为80单位/mL，987P纤毛抗原含量为900单位/mL，总菌数不超过2×10¹⁰个/mL。

步骤2)中对活鸡的免疫次数为2次。

步骤3)所述的蛋黄中抗大肠杆菌K88纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌K99纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌F41纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌987P纤毛的特异抗体效价均不低于1:64。

步骤3)中消毒方法为：用水将高免鸡蛋外表洗净，再用0.1％的百毒杀浸泡3min，擦干，再用乙醇溶液擦洗，晾干。

步骤3)中甲醛溶液的加入量为：保证加入甲醛后得到的混合溶液中甲醛浓度为0.1％(v/v)。

实施例8制备方法实例

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

其中步骤3)所述的辛酸沉淀法提取抗体包括以下步骤：

a)取醋酸盐缓冲液与蛋黄以3:1(v/v)的比例混合，调整混合液pH至4.2，即得到蛋黄稀释液，将其置于1℃静置，而后向蛋黄稀释液中滴加辛酸，辛酸的滴加量为每mL稀释蛋黄液滴加14μL辛酸，而后在1℃条件下静置沉淀；

b)将步骤a)得到的产物离心，收集上清，向其中加入PBS缓冲液，PBS缓冲液的加入量为收集得到的上清液体积的1/5，而后调整其pH至6.8，即得到含抗体的上清液。

步骤a)中辛酸的滴加时间不超过30min。

步骤a)中辛酸的滴加在室温温度下进行。

步骤a)中辛酸的滴加条件为：在对蛋黄稀释液进行搅拌的条件下滴加。

实施例9制备方法实例

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

其中步骤3)所述的辛酸沉淀法提取抗体包括以下步骤：

a)取醋酸盐缓冲液与蛋黄以7:1(v/v)的比例混合，调整混合液pH至4.8，即得到蛋黄稀释液，将其置于10℃静置，而后向蛋黄稀释液中滴加辛酸，辛酸的滴加量为每mL稀释蛋黄液滴加18μL辛酸，而后在10℃条件下静置沉淀；

b)将步骤a)得到的产物离心，收集上清，向其中加入PBS缓冲液，PBS缓冲液的加入量为收集得到的上清液体积的1/20，而后调整其pH至7.6，即得到含抗体的上清液。

步骤a)中辛酸的滴加在室温温度下进行。

实施例10制备方法实例

一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

其中步骤3)所述的辛酸沉淀法提取抗体包括以下步骤：

a)取醋酸盐缓冲液与蛋黄以5:1(v/v)的比例混合，调整混合液pH至4.5，即得到蛋黄稀释液，将其置于4℃静置，而后向蛋黄稀释液中滴加辛酸，辛酸的滴加量为每mL稀释蛋黄液滴加16μL辛酸，而后在4℃条件下静置沉淀；

b)将步骤a)得到的产物离心，收集上清，向其中加入PBS缓冲液，PBS缓冲液的加入量为收集得到的上清液体积的1/10，而后调整其pH至7.2，即得到含抗体的上清液。

步骤a)中辛酸的滴加时间不超过30min。

步骤a)中辛酸的滴加条件为：在对蛋黄稀释液进行搅拌的条件下滴加。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以大肠杆菌K88、K99、F41、987P为抗原制备四联灭活疫苗；

2)取步骤1)制备的四联灭活疫苗免疫活鸡，而后取该活鸡产的蛋，即为高免鸡蛋；

3)取步骤2)制备的高免鸡蛋消毒，而后收集蛋黄利用辛酸沉淀法提取抗体，收集含抗体的上清液向其中加入甲醛溶液，即得到抗大肠杆菌四联蛋黄抗体。

2.根据权利要求1所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤2)所述的四联灭活疫苗中K88纤毛抗原含量不小于100单位/mL，F41纤毛抗原含量不小于100单位/mL，K99纤毛抗原含量不小于50单位/mL，987P纤毛抗原含量不小于50单位/mL，总菌数不超过2×10¹⁰个/mL。

3.根据权利要求1所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤2)中对活鸡的免疫次数为2次。

4.根据权利要求1所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤3)所述的蛋黄中抗大肠杆菌K88纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌K99纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌F41纤毛的特异抗体效价、抗大肠杆菌987P纤毛的特异抗体效价均不低于1:64。

5.根据权利要求1所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤3)中消毒方法为：用水将高免鸡蛋外表洗净，再用0.01～0.1％的百毒杀浸泡3-5min，擦干，再用乙醇溶液擦洗，晾干。

6.根据权利要求1所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤3)中甲醛溶液的加入量为：保证加入甲醛后得到的混合溶液中甲醛浓度为0.1％(v/v)。

7.根据权利要求1～6任一项所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤3)所述的辛酸沉淀法提取抗体包括以下步骤：

a)取醋酸盐缓冲液与蛋黄以(3～7):1(v/v)的比例混合，调整混合液pH至4.2～4.8，即得到蛋黄稀释液，将其置于0～10℃静置，而后向蛋黄稀释液中滴加辛酸，辛酸的滴加量为每mL稀释蛋黄液滴加14～18μL辛酸，而后在0～10℃条件下静置沉淀；

b)将步骤a)得到的产物离心，收集上清，向其中加入PBS缓冲液，PBS缓冲液的加入量为收集得到的上清液体积的1/5～1/20，而后调整其pH至6.8～7.6，即得到含抗体的上清液。

8.根据权利要求7所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤a)中辛酸的滴加时间不超过30min。

9.根据权利要求7所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤a)中辛酸的滴加在室温温度下进行。

10.根据权利要求7所述的一种抗大肠杆菌四联蛋黄抗体制备方法，其特征在于步骤a)中辛酸的滴加条件为：在对蛋黄稀释液进行搅拌的条件下滴加。