CN104306325A - 一种抗肿瘤水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤水凝胶的制备方法，采用丝胶蛋白和明胶为基质，将装载阿霉素的氧化石墨烯分散其中，并以戊二醛为交联剂，促使丝胶蛋白与丝胶蛋白、丝胶蛋白与氧化石墨烯发生交联反应，并有明胶分子穿插于其中，最终形成抗肿瘤水凝胶。本发明制备的抗肿瘤水凝胶一方面能够通过调节水凝胶中丝胶蛋白的浓度，高效调控释药速度；另一方面由于氧化石墨烯的表面积极大，可以显著增加水凝胶的载药量，获得增强抗肿瘤效果和减少因多次用药给患者带来痛苦的效果。

Description

一种抗肿瘤水凝胶的制备方法

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤水凝胶的制备方法。

背景技术

水凝胶是常见的一种凝胶，是通过共价键、范德华力、氢键等作用相互交联形成三维网络结构，在水中能够溶胀但不溶解的聚合物，具有良好的吸水性，是一类集吸水、保水和缓释于一体的功能高分子材料。具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网络内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物。凡是水溶性或亲水性的高分子，通过一定的方式(物理或化学)交联成高分子网络体系，均可形成水凝胶。

化疗是肿瘤治疗的常用方法之一。抗肿瘤药物不但对肿瘤细胞有杀灭作用，而且对正常细胞也有损伤作用。高血药浓度虽然能够很好地杀灭肿瘤细胞，但对正常细胞的损伤也很大，患者通常难以忍受。血药浓度低，对正常细胞的损伤小，但杀灭肿瘤细胞的能力也降低。因此稳定的血药浓度对于杀灭肿瘤细胞和减轻正常细胞的损伤显得尤为重要，如何确保长而稳定的血药浓度是本领域要解决的难题。缓释是通常采用的方法，有利于维持血药稳态，同时也有利于减少毒副作用。将抗肿瘤药物包裹在水凝胶中，是实现缓释的方法之一。

阿霉素（DOX）是治疗肿瘤的常用药物，它的作用机理是通过对RNA和DNA合成的抑制，杀死肿瘤细胞。但是该药物除引起骨髓抑制、胃肠道毒性及脱发外，尚可引起严重的心脏毒性，这在一定程度上使其临床应用受到限制。

阿霉素（DOX）水凝胶通常是以明胶为基质，采用简单、分散的方式将DOX装载于水凝胶中，但是存在释放速度难以控制的问题，通常是释放过快，释放周期减短，尤其是装载量大时，快速释放会导致血药浓度上升过快，对心脏的毒性将增大。

发明内容

解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，本发明提供一种抗肿瘤水凝胶的制备方法，采用丝胶蛋白和明胶为基质，将装载阿霉素的氧化石墨烯分散其中，并以戊二醛为交联剂，通过控制丝胶蛋白浓度，实现高效调控阿霉素释放速度。

技术方案：本发明提供的抗肿瘤水凝胶的制备方法，包括以下制备步骤：（1）将负载有阿霉素的氧化石墨烯溶液（溶液中阿霉素的浓度为1~4mg/ml，氧化石墨烯浓度为1~2mg/ml）与0.5~10%(W/V)的丝胶蛋白溶液混合均匀得到混合液，氧化石墨烯溶液和丝胶蛋白溶液的体积比为1︰(2~5)；（2）将步骤（1）所得混合液与5~10%（W/V）明胶溶液混合，混合液与明胶溶液的体积比为(0.5~1.5)︰1，然后加入25%(W/V)戊二醛，丝胶蛋白与戊二醛的质量比为1︰(0.05~0.25)，置于20~40℃下反应20min~12h，得到抗肿瘤水凝胶。

本发明采用丝胶蛋白和明胶为基质，将装载阿霉素的氧化石墨烯分散其中，并以戊二醛为交联剂，丝胶蛋白与丝胶蛋白、丝胶蛋白与氧化石墨烯发生交联，并有明胶分子穿插于其中，最终形成抗肿瘤水凝胶。由于氧化石墨烯对阿霉素的吸附作用和水凝胶中网状结构的协同作用，减慢了阿霉素的释放，起了很好的缓释作用；并且通过控制丝胶蛋白浓度，可以灵活调节阿霉素的释放速度。

有益效果：本发明制备的抗肿瘤水凝胶一方面能够通过调节水凝胶中丝胶蛋白的浓度，高效调控释药速度，有助于延长水凝胶中抗肿瘤药物释放时间和维持稳定的释放速率，另一方面由于氧化石墨烯的表面积极大，富含多种基团，具有疏水和亲水性，因而可以显著增加水凝胶的载药量，获得增强抗肿瘤效果和减少因多次用药给患者带来痛苦的效果。

附图说明

图1为实施例4制得的抗肿瘤水凝胶照片；

图2为实施例4制备的水凝胶的阿霉素累积释放曲线；

图3为实施例5制备的水凝胶的阿霉素累积释放曲线；

图4为实施例6制备的水凝胶的阿霉素累积释放曲线。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不因此局限于下述实施例，而是由本发明的权利要求书和说明书限定。

实施例中丝胶蛋白和氧化石墨烯制备，以及氧化石墨烯吸附阿霉素的方法如下：

（1）丝胶制备：取干净的削口茧，剪成面积大约1cm²左右的茧片，取40g用蒸馏水清洗2-3次，置于5000ml 0.5%（W/V)的NaHCO₃溶液，煮沸45min，加水使与初始体积相同，再次煮沸30min，然后将蚕丝取出，沥干，挤出其中残留的丝胶液；继续蒸煮丝胶液使其浓缩，得到丝胶粗提液。将丝胶粗提液透析2-3天（透析袋截留分子量3500~7000），以除去其中可溶性的小分子杂质；用聚乙二醇12000~20000浓缩至蛋白含量10%左右，获得丝胶蛋白溶液。

（2）利用Hummers’法制备氧化石墨烯：将23ml98%的浓硫酸加入三角烧瓶中，置于冰浴上，保持温度低于6℃，然后加入325目的鳞片状石墨粉1g，低速搅拌1h，使充分混合，随即在一小时内分批少量的加入3g高锰酸钾，在温度低于10℃的条件下反应4h，此过程中反应液逐渐呈墨绿色；将三角瓶移入35℃油浴锅继续反应30min后向反应液中缓慢连续注入46mL去离子水，温度升至98℃反应15min，反应完成后，将反应液转入烧杯中，趁热加入约20mL浓度为5%的蒸馏水，直至不再产生气泡为止，溶液变为亮黄色，然后用5%的盐酸溶液和去离子水洗涤三到四次，洗涤方法为使用高速离心机8000r/min离心15min，直至氯化钡检测无白色沉淀产生，然后将反应液超声剥离，使其高度分散在溶液中，使用磷酸盐缓冲液将其调至pH6，储存待用。

（3）氧化石墨烯吸附阿霉素：称取28mg盐酸阿霉素溶于1mL蒸馏水中，加入到6mL 1mg/ml的氧化石墨烯溶液中，超声1h，在黑暗条件下于振荡器上室温反应24h，超声1h，继续搅拌24h；取1/2体积的反应液于14000r/min下高速离心1h，检测上清液中阿霉素含量，可计算出阿霉素的吸附率，沉淀为负载有阿霉素的氧化石墨烯，取沉淀，加水分散得溶液。

实施例1

将负载有阿霉素的氧化石墨烯溶液（阿霉素的含量为4mg/ml，氧化石墨烯浓度为2mg/ml）与7.5%(W/V)的丝胶蛋白溶液在黑暗条件下混合均匀得到混合液，两者的体积比为1:5；

将上述混合液与10%（W/V）明胶溶液混合，两者的体积比为1.5:1，然后加入戊二醛，每1g丝胶蛋白加入0.05g的25%(W/V)戊二醛，置于40℃下反应20min，得到氧化石墨烯-阿霉素-丝胶蛋白-明胶水凝胶，即本发明的抗肿瘤水凝胶。

实施例2

将负载有阿霉素的氧化石墨烯的溶液（阿霉素的含量为2.5mg/ml，氧化石墨烯浓度为1.5mg/ml）与0.5%(W/V)的丝胶蛋白溶液在黑暗条件下混合均匀得到混合液，两者的体积比为1:3。

将上述混合液与5%（W/V）明胶溶液混合，两者的体积比为1:1，然后加入戊二醛，每1g丝胶蛋白加入0.15g的25%(W/V)戊二醛，置于30℃下反应4h，得到氧化石墨烯-阿霉素-丝胶蛋白-明胶水凝胶，即本发明的抗肿瘤水凝胶。

实施例3

将负载有阿霉素的氧化石墨烯的溶液（阿霉素的含量为1mg/ml，氧化石墨烯浓度为1mg/ml）与10%(W/V)的丝胶蛋白溶液在黑暗条件下混合均匀得到混合液，两者的体积比为1:2。

将上述混合液与7.5%（W/V）明胶溶液混合，两者的体积比为0.5:1，然后加入戊二醛，每1g丝胶蛋白加入0.25g的25%(W/V)的戊二醛，置于20℃下反应12h，得到氧化石墨烯-阿霉素-丝胶蛋白-明胶水凝胶，即本发明的抗肿瘤水凝胶。

实施例4

将负载有阿霉素的氧化石墨烯的溶液（阿霉素的含量为2mg/ml，氧化石墨烯浓度为1mg/ml）与10%(W/V)的丝胶蛋白溶液在黑暗条件下混合均匀得到混合液，两者的体积比为1:4。

将上述混合液与7.5%（W/V）明胶溶液混合，两者的体积比为1:1，然后加入戊二醛，每1g丝胶蛋白加入0.15g的25%(W/V)的戊二醛，置于30℃下反应8h，得到氧化石墨烯-阿霉素-丝胶蛋白-明胶水凝胶，即本发明的抗肿瘤水凝胶。

实施例5

将负载有阿霉素的氧化石墨烯的溶液（阿霉素的含量为2mg/ml，氧化石墨烯浓度为1mg/ml）与5%(W/V)的丝胶蛋白溶液在黑暗条件下混合均匀得到混合液，两者的体积比为1:4。

将上述混合液与7.5%（W/V）明胶溶液混合，两者的体积比为1:1，然后加入戊二醛，每1g丝胶蛋白加入0.15g 25%(W/V)的戊二醛，置于30℃下反应8h，得到氧化石墨烯-阿霉素-丝胶蛋白-明胶水凝胶，即本发明的抗肿瘤水凝胶。

实施例6

在本发明中，氧化石墨烯对阿霉素释放有重要影响。为与实施例4对比，采用阿霉素溶液制备水凝胶，具体方法如下：

将阿霉素溶液（2mg/ml）与10%(W/V)的丝胶蛋白溶液在黑暗条件下混合，两者的体积比为1:4，混合均匀得到混合液；

将上述混合液与7.5%（W/V）明胶溶液混合，两者的体积比为1:1，然后加入戊二醛，每1g丝胶蛋白加入0.15g的25%(W/V)戊二醛，置于30℃下反应8h，得到阿霉素-丝胶蛋白-明胶水凝胶。

在实施例中，以实施例4所得的水凝胶的缓释效果最好；图1是实施例4制备所得的水凝胶图片，图2是实施例4阿霉素的释放曲线。

实施例4与实施例5相比，仅是丝胶蛋白浓度不同，实施例4的浓度高，实施例5浓度低；图2和图3分别为实施例4和实施例5的阿霉素释放曲线，由图可见，实施例5中阿霉素的释放比实施例4的阿霉素要快很多。

实施例4与实施例6相比，实施例4中阿霉素是荷载于氧化石墨烯上，实施例6中阿霉素是游离的；图4是实施例6的阿霉素释放曲线，由图4可见实施例6中阿霉素的释放比实施例4的阿霉素要快很多。

Claims (5)

1.一种抗肿瘤水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：

（1）将负载有阿霉素的氧化石墨烯溶液与0.5~10%(W/V)的丝胶蛋白溶液混合均匀得到混合液，氧化石墨烯溶液和丝胶蛋白溶液的体积比为1:(2~5)；

（2）将步骤（1）所得混合液与5~10%（W/V）明胶溶液混合，混合液与明胶溶液的体积比为(0.5~1.5):1，然后加入戊二醛，丝胶蛋白与戊二醛的质量比为1:(0.05~0.25)，置于20~40℃下反应20min~12h，得到抗肿瘤水凝胶。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤水凝胶的制备方法，其特征在于所述负载有阿霉素的氧化石墨烯溶液中阿霉素的浓度为1~4mg/ml。

3.根据权利要求1所述的抗肿瘤水凝胶的制备方法，其特征在于所述阿霉素为盐酸阿霉素。

4.根据权利要求1所述的抗肿瘤水凝胶的制备方法，其特征在于所述负载有阿霉素的氧化石墨烯溶液中氧化石墨烯浓度为1~2mg/ml。

5.根据权利要求1所述的抗肿瘤水凝胶的制备方法，其特征在于所述戊二醛浓度为25%(W/V)。