CN104293801A - 一种水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其应用 - Google Patents

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田大成
司伟娜
张小辉
杨四海
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本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其应用。本发明公开了水稻稻瘟病新抗性基因RMg37的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。此基因为NBS-LRR类型抗病基因家族的成员。本发明中的抗稻瘟病基因克隆自对稻瘟病菌表现出高抗的水稻品系,并将其转化至对稻瘟病菌感病的品种中,利用稻瘟病菌侵染的方法对其抗病能力进行评估,从而最终确定该基因对水稻稻瘟病具有抗性。

Description

一种水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其应用
 
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其应用。
背景技术
稻瘟病是由水稻病菌(Magnaporthe oryzae)引起的真菌水稻病害。稻瘟病、白叶枯病以及纹枯病是世界范围内水稻的三大病害,其中稻瘟病是危害最严重的一种。作为世界性的病害,稻瘟病每年在全球范围内造成水稻产量损失达10%-30%。而在中国,自从20世纪90年代以来,稻瘟病的年发生面积均在380万公顷(hm2)以上。并且在南北稻区,稻瘟病的危害最为严重,每年均有不同程度的稻瘟病害发生,重病区严重时甚至会有局部田区颗粒无收。因此,对稻瘟病防治抵御一直都是研究的热点。但是,常规的化学农药已不能解决植物病害日趋严重的耐药性,并且农药带来的污染问题也亟需解决。而实践证明,利用水稻自身所携带的抗病基因培育抗病品种,是最为有效环保的防治和控制稻瘟病害的方法。
植物在长期抵御外界病虫害的过程中演化出了“双保险”防御体系(Young et al. 2006)。第一层防御体系是通过细胞表面的受体识别一些保守的微生物来源的分子出发的古老的、普遍的免疫反应。而在第二层防御体系,植物通过具有特异性识别病原菌效应分子的抗病基因,来抵抗突破第一道防线的病原菌。根据结构特点的不同,抗病基因主要包括5种类型:NBS-LRR、RLK、RLP、STK及其他类型。含有抗病基因的抗性品种往往产量低、品质差,而高产或质优品种又无抗性,为了选育集高产,优质和多抗为一体的改良品种,人们从很早就开始意识到抗病基因的重要性,传统的方法培育抗病品种的方法,通常是将携带有抗病基因的抗病品种与感病的优质高产的品种杂交,然后不停的回交,达到将抗病基因“引入”优质品种,得到高产优质抗病品种的目的。尽管这种方法十分有效,但是这种方法费事费力,并且通过此种方法选育出来抗病品种只有往往由于周期较长,病菌进化产生新的株系而造成抗性的丧失。1986年由剑桥大学的Alan Coulson提出由剑桥大学的Alan Coulson提出图位克隆方法大大解决了这个问题,图位克隆是将目标基因定位到染色体的精确位置,并利用与之紧密连锁的分子标记以及染色体移步筛选到含有该目标基因的亚克隆,然后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。这种方法取得了很好的效果,在植物抗病基因的克隆中起到了非常重要的作用,但因其周期长、费时费力、分离和等位性检测较难等原因,不适合大量克隆抗病基因的需要。同时,因抗病基因独特的遗传方式,也使该方法的应用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因为例,该类基因在基因组中通常成簇(gene cluster) 分布,在不同品种的同源染色体间的位置和结构也多呈不对称分布,等位关系不明确,拷贝数变异大 (Yang et al. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。这些遗传现象,大大增加了图位克隆的难度,严重影响了抗病基因的克隆效率。并且对于应对像稻瘟病这种快速进化的病菌依然存在着育种周期过长的问题。截止到目前为止,仅有23个抗稻瘟病基因被克隆出来。
而我们通过对植物抗病基因起源、进化及结构功能的研究,发现抗病基因主要为一类含有LRR的基因,其中NBS-LRR类型是最大的抗病基因家族。而本发明就是根据抗病基因的这一特征,利用分子生物学和生物信息学手段,根据抗病基因的遗传进化特征,筛选潜在的抗病基因,快速、高效、大量的克隆候选基因,最终在水稻中得到具有水稻稻瘟病抗性的基因。
发明内容
本发明的目的是,分离克隆水稻高抗品种中携带的稻瘟病抗性基因RMg37及包含调控这基因的启动子的DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因RMg37所编码的蛋白质序列。
本发明的另一个目的是提供含有上述抗性基因的载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植株。
本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
本发明涉及克隆和鉴定一种包含RMg37基因的DNA片段,这些基因编码的蛋白能使水稻对稻瘟病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应。其中,所述片段分别如序列表SEQ ID NO:1所示或者基本上相当于SEQ ID NO:1所示的DNA 序列,或者其功能相当于SEQ ID NO:1所示序列的亚片段。这些DNA序列都编码一种NBS-LRR类蛋白,其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2所示。所分离、克隆的RMg37抗性基因编码NBS-LRR蛋白。他们的蛋白都包含两个主要的结构域:NBS和LRR区域,RMg37蛋白的C-末端为5个LRR重复。
根据本发明提供的RMg37基因序列信息(SEQ ID NO:1),本领域技术人员可以通过以下方法获得与RMg37等同的基因:(1)通过数据库检索获得;(2)以RMg37基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得;(3)根据RMg37基因序列信息设计寡核苷酸引物,用 PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、 mRNA和 cDNA中获取;(4)在RMg37基因序列的基础上用基因工程方法改造获得;(5)用化学合成的方法获得该基因。
本发明提供的稻瘟病抗性基因RMg37具有重要的应用价值。将所述的RMg37基因序列用任何一种转化方法导入水稻或其他植物细胞,可获得表达所述基因的转基因抗病品种,从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中,可以对所述基因或其调控序列适当修饰,也可以用其它启动子取代所述基因原有的启动子,从而拓宽抗谱或增强抗性。
本发明具有如下有益效果:将克隆的抗稻瘟病基因转入感病的植物中,有助于获得新的抗病植物。克隆的抗病基因能在不同的物种间转移并利用,从而能够克服传统抗病育种中远缘杂交的困难。此外,可以用转基因技术在植物中累加多个抗病基因,缩短育种周期。本发明还能够进一步提供或应用上述DNA片段获得的抗病转基因植株和相应的种子,以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他植株。
 
附图说明
图1为本发明流程示意图。图1A:抗稻瘟病候选位点的确定;图1B-E:抗稻瘟病基因的分离与克隆;图1F-G:抗稻瘟病基因的遗传转化;图1H:转化体的鉴定。
图2为稻瘟病抗性基因RMg37的转化体的潮霉素抗性基因和CaMV 35S 启动子的PCR检测电泳图;图1A为CaMV 35S 启动子的PCR扩增产物,泳道1-6为转化体的PCR扩增产物,泳道7为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物,泳道8为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物;图1B为潮霉素抗性基因的PCR产物,泳道1-6为转化体的PCR扩增产物,泳道7为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物,泳道8为受体新2号的非转化体的PCR扩增产物。
图3为转化有RMg37基因植株抗性鉴定图。图3A:对照植株新2号的抗性鉴定图;图3B:稻瘟病抗性基因RMg37的转化植株的抗性鉴定图。
具体实施方式
水稻抗稻瘟病候选基因的确定:以水稻全基因组测序品种93-11和日本晴为基础,首先鉴定基因组中所有的NBS-LRR类型的抗病基因,并构建系统进化树。在此基础上,我们选取了20个候选的抗稻瘟病基因位点,通过引物设计、在抗稻瘟病的水稻品种中进行长片段PCR、载体构建、转基因、抗性鉴定等过程,最后通过10个来源于中国大陆分布所有水稻主产区的稻瘟病菌系统鉴定,鉴定出1个具有特异性抗性的抗稻瘟病基因。
下述实施例中所用方法如无特别说明,均为常规方法。
实施例1稻瘟病抗性基因RMg37的克隆、载体构建、抗病植株鉴定
本实施例的试验流程如图1所示。
1、抗稻瘟病候选位点RMg37的确定:(1)以单基因形式存在,在日本晴和93-11中各有1个相近的拷贝;(2)在其LRR区域,特别是xxLxLxx区域具有较高的Ka/Ks值;
2、稻瘟病抗性基因RMg37的分离与克隆:利用公共数据库测序品种日本晴(Nipponbare)和93-11为参考序列,设计引物(引物两端皆带有酶切位点BamHI)。引物序列参见序列表,正向引物序列如SEQ ID NO:4所示;反向引物序列如SEQ ID NO:5所示。
以抗病水稻品种Tadukan,Tetep, MH63为模板,利用长片段PCR技术(Long-PCR)扩增候选基因片段。PCR程序如下:95℃预变性5分钟,95℃变性30秒,60℃复性45秒,68℃延伸6分钟,共35个循环,随后72℃保温10分钟,最后10℃恒温。随后对PCR产物进行割胶回收。
3、候选抗性基因与基础载体的连接:用限制性内切酶BamHI,同时酶切PCR产物与基础载体质粒,并纯化。在T4连接酶的作用下,将候选基因片段连入基础载体pCAMBIA1300。
4、候选抗性基因的遗传转化:将携有候选基因的双功能载体导入根癌农杆菌EHA105,采用农杆菌介导法,将候选基因转化到水稻普感品种新2号,TP309和Co39中。最后一共获得20株独立的转化体。
5、PCR分子检测:以转化体DNA为模板,用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S 启动子的特异性引物对其进行PCR反应。潮霉素抗性基因的引物序列参加序列表,正向引物序列如SEQ ID NO:6;反向引物序列如SEQ ID NO:7。CaMV35S 启动子的引物序列参加序列表,正向引物序列如SEQ ID NO:8;反向引物序列如SEQ ID NO:9。
6、转化体的抗性鉴定:选择10个来源地不同,区别力好的独立稻瘟病菌生理小种作为检测的病原菌种。利用稻瘟病菌小种接种感染T2代转基因植株和对照品种,筛选抗病性改变的转化体。抗性鉴定结果显示候选基因RMg37在普感品种新2号的遗传背景下,对2个病原菌株都显示不同程度的抗性,表明候选基因RMg37具有特异性抗性且被成功克隆(图2和图3)。
7、稻瘟病抗性基因RMg37的基因结构和蛋白结构分析:采用步移法对RMg37的DNA序列进行了测序。RMg37基因DNA长度为3394bp,含有1个开放读码框,1个外显子,无内含子。RMg37码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。RMg37基因编码1个由933个氨基酸残基组成的蛋白多肽。RMg37蛋白属于NBS-LRR蛋白,其蛋白的C-末端为5个LRR重复。

Claims (10)

1.一种水稻抗稻瘟病基因RMg37,其核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列,或者其核苷酸序列是与SEQ ID NO:1所示的DNA序列在相似度上≥95%相似的DNA序列,或其核苷酸序列的功能相当于SEQ ID NO:1所示DNA序列的亚片段,或者如SEQ ID NO:1所示的DNA序列经过替换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述基因序列编码的蛋白。
3.根据权利要求2所述的蛋白,其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示,或SEQ ID NO:2所示的序列经过替换、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
4.一种调控如权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因RMg37的启动子,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1所述的一种水稻抗稻瘟病基因RMg37,其特征为含有调控水稻抗稻瘟病基因RMg37的启动子,所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.含有权利要求1所述基因的转化载体。
7.含有权利要求6所述转化载体的宿主细胞根癌农杆菌EHA105。
8.含有权利要求6所述转化载体的转基因植物。
9.权利要求1所述的基因在抗稻瘟病水稻育种中的应用。
10.权利要求2所述蛋白在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。
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