CN104293733A - 卵巢组织冻融后早期体外培养液及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生殖医学领域，具体而言，涉及卵巢组织冻融后早期体外培养液及培养方法。该卵巢组织冻融后早期体外培养液，包括：用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液。第一培养液是一种胶原酶溶液，冻融后的卵巢组织通过其处理之后，用胶原酶对胶原等组织的酶解作用，溶解部分胶原蛋白，使致密的卵巢组织间质疏松，有利于后续长期培养中第二培养液渗透，使第二培养液与同组织中不同位置细胞(尤其中央位置细胞)充分接触，有利于其充分吸收营养成分和排出代谢废物，从而更好的体外生长发育。

Description

卵巢组织冻融后早期体外培养液及培养方法

技术领域

本发明涉及生殖医学领域，具体而言，涉及卵巢组织冻融后早期体外培养液及培养方法。

背景技术

近年来，女性生育力保护和保存已成为生殖医学领域亟需解决的重大课题。而在女性生育力保存技术中，卵巢组织超低温保存是最有潜力和最受关注的技术。具体的，先将人卵巢组织进行超低温保存；使用时对其进行解冻复苏，冻融后人卵巢组织的应用技术主要包括卵巢组织自体移植技术和卵巢组织体外培养技术。卵巢冷冻保存技术主要适用人群为年轻恶性肿瘤存活者，因而自体移植技术可能因卵巢组织自体移植使肿瘤细胞传播或再种植。由于对自体移植技术安全性担忧，使卵巢组织体外培养成为最有潜力的冻融后人卵巢组织临床应用技术，目前正逐渐成为生殖医学研究的新热点。

研究者一直致力于卵巢组织体外培养体系的改进和创新。目前，人卵巢组织体外培养采用多阶段序贯培养，其中早期阶段采用原位培养---始基卵泡不从间质组织中分离出来的原位培养方式。离体的卵巢组织或卵泡没有血供，其营养主要由培养液提供，所以培养液的选择对卵巢组织及卵泡的生长至关重要。

但是，由于人卵巢组织结构致密，间质中含有丰富胶原，培养液渗透到卵巢组织的中心非常困难，使得卵巢组织中心部位细胞(包括始基卵泡)不能充分吸收营养成分，妨碍了整个卵巢组织在体外的生长发育。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵巢组织冻融后早期体外培养液，以解决冻融后的卵巢组织在体外早期培养过程中，其中心部位不能充分吸收营养成分的技术问题。

本发明的另一个目的在于提供一种利用上述培养液来体外培养冻融后卵巢组织的方法。

在本发明的实施例中提供了卵巢组织冻融后早期体外培养液，用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：0.8-1.2份胶原酶和8.8-9.2份含有10％胎牛血清的L-15培养液；所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为8-12％人白蛋白、体积份数为0.8-1.2％的ITS，含量为0.2-0.4IU/ml的人卵泡刺激素、45-55μg/ml的维生素C、0.4-0.5mmol/L的丙酮酸、1.5-2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70-80IU/ml的青霉素和70-80μg/ml链霉素。

本发明提供的这种卵巢组织冻融后早期体外培养液，其包括用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；第一培养液是一种胶原酶溶液，冻融后的卵巢组织通过其处理之后，用胶原酶对胶原等组织的酶解作用，溶解部分胶原蛋白，使致密的卵巢组织间质疏松，有利于后续长期培养中第二培养液渗透，使第二培养液与同组织中不同位置细胞(尤其中央位置细胞)充分接触，有利于其充分吸收营养成分和排出代谢废物，从而更好的体外生长发育。

另外，本发明提供的第二培养液，其以α-MEM为基础培养液，且还包括体积份数为8-12％人白蛋白、体积份数为0.8-1.2％的ITS，含量为02-0.4IU/ml(体积份数为0.27-0.54％)的人卵泡刺激素、45-55μg/ml的维生素C、0.4-0.5mmol/L的丙酮酸、1.5-2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70-80IU/ml的青霉素、70-80μg/ml链霉素和8-12mmol/L的亮氨酸；既定浓度的各种有效因子可以保证预处理后的卵巢组织能够充分的吸收营养，为其体外产生长以及产生卵泡做好准备。更为重要的是，在第二培养液中，含有既定浓度的亮氨酸，由于亮氨酸是mTOR的激动剂，添加了亮氨酸的第二培养液能激活始基卵泡中mTOR的表达，从而解除对始基卵泡启动的抑制，使卵巢组织中多个始基卵泡同时获得激活，能够有多个卵泡同时发育，最大程度利用了卵巢组织中的卵泡储备，减少生育力储备的浪费。

一种根据上述培养液体外培养冻融后卵巢组织的方法，包括以下步骤：

将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织；

将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，在继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液。

可选的，在所述步骤将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织中，具体包括：

将冻融后的卵巢组织在无菌超净工作台上切成体积为1-1.2mm³的块状；

将块状的所述卵巢组织放入含有10％胎牛血清的L-15培养液后，在温度为35-37℃、CO₂体积含量为4-5％的培养箱中孵育8-10分钟，得到孵育后的卵巢组织小块；

将所述孵育后的卵巢组织小块加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织。

可选的，在所述将块状的所述卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织的步骤中：

所述培养的时间为25-30分钟。

可选的，在所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液的步骤中；

所述培养皿为4孔或24孔培养皿。

可选的，在所述步骤将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织之后，在所述步骤将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液之前，还包括：

将培养皿的内部包被有由琼脂糖或海藻酸钠珠作为细胞外基质的三维支架。

可选的，在所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液的步骤中，所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿具体包括：

在培养皿的每个孔中预先加入700-850微升第二培养液，再加入3-4块呈块状的预处理后卵巢组织。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例四提供的卵巢组织冻融后早期体外培养液流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明提供的这种卵巢组织冻融后早期体外培养液，用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：0.8-1.2份胶原酶和8.8-9.2份含有10％胎牛血清的L-15培养液；所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为8-12％人白蛋白、体积份数为0.8-1.2％的ITS，含量为02-0.4IU/ml(体积份数为0.27-0.54％)的人卵泡刺激素、45-55μg/ml的维生素C、0.4-0.5mmol/L的丙酮酸、1.5-2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70-80IU/ml的青霉素、70-80μg/ml链霉素和8-12mmol/L的亮氨酸。需要指出的是，ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒钠)是胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠的混合制剂，具有提高卵巢组织发育率的作用。在本发明中，优选的，1％ITS含10μg/ml胰岛素、5.5μg/ml转铁蛋白和6.7ng/ml亚硒酸钠。含10％胎牛血清的L-15培养液；其是指在L-15培养基中，加入胎牛血清，使其体积含量达到10％；而L-15培养基是细胞生物学领域常用的一种培养基，在此不做赘述。

接下来，本发明是结合上述内容，举出了第一培养液和第二培养液的具体实施例，请参考以下内容：

实施例一

本实施例的卵巢组织冻融后早期培养液包括：用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：0.8份胶原酶和9.2份含有10％胎牛血清的L-15培养液；所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为8％人白蛋白、体积份数为0.8％的ITS，含量为0.2IU/ml的人卵泡刺激素、45μg/ml的维生素C、0.4mmol/L的丙酮酸、1.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70IU/ml的青霉素、70μg/ml链霉素和8mmol/L的亮氨酸。

实施例二

本实施例的卵巢组织冻融后早期培养液包括：用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：1份胶原酶和9份含有10％胎牛血清的L-15培养液；所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为10％人白蛋白、体积份数为1％的ITS，含量为0.3IU/ml的人卵泡刺激素、50μg/ml的维生素C、0.47mmol/L的丙酮酸、2mmol/L的L－谷氨酰胺、75IU/ml的青霉素、75μg/ml链霉素和10mmol/L的亮氨酸。

实施例三

本实施例的卵巢组织冻融后早期培养液包括：用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：1.2份胶原酶和8.8份含有10％胎牛血清的L-15培养液；所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为12％人白蛋白、体积份数为1.2％的ITS，含量为0.4IU/ml的人卵泡刺激素、55μg/ml的维生素C、0.5mmol/L的丙酮酸、2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、80IU/ml的青霉素、80μg/ml链霉素和12mmol/L的亮氨酸。

为了使得本发明上述实施例的卵巢组织冻融后早期体外培养液得到更好的应用，更加有效应用到医学领域中，本发明还在上述实施例的基础之上提供了实施例四，实施例四给出了利用上述实施例的卵巢组织冻融后早期体外培养液培养冻融后卵巢组织的方法，现做详细的阐述和解释，请参考图1：

实施例四

请参考图1，在本实施例中，卵巢组织冻融后早期体外培养液的制备方法包括以下步骤：

步骤101：将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织；

在该步骤中，由于冻融后的卵巢组织，为了使其能够充分恢复活性，优选的，在进行预处理之前需要对其进行孵育操作，具体的，在本实施例中，为了实现较好的孵育效果，其操作可以按照以下步骤进行：

S1：将冻融后的卵巢组织在无菌超净工作台上切成体积为1-1.2mm³的块状；

将冻融后卵巢组织裁剪成体积为1-1.2mm³的块状组织，使后续培养组织块体积更小，有利于后续培养的过程中，营养液更容易渗入，使得组织细胞能够更加充分的吸收营养液。

S2：将块状的所述卵巢组织放入含有10％胎牛血清的L-15培养液后，在温度为35-37℃、CO₂体积含量为4-5％的培养箱中孵育8-10分钟，得到孵育后的卵巢组织小块；

在培养箱中，将温度设定在35-37℃、CO₂体积含量为4-5％，进而为卵巢组织提供适宜的体外生长条件，可保证其健康生长；另外，在孵育的过程中，培养时间优选控制在8-10分钟。

S3：将所述孵育后的卵巢组织小块加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织。

具体的，在利用第一培养液酶解的过程中，为了不至于酶解过度造成损伤，且还能使卵巢组织达到适宜疏松度的，优选的，培养的时间为25-30分钟。

步骤102：将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液；

在步骤102中，在长期培养的过程中优选使用4孔或24孔培养皿；并且还利用35-37℃培养箱进行培养。另外，在长期培养的过程中，为了实现更好的培养效果，使得细胞能够正常扩增，优选的，在步骤101和步骤102之间还包括：将培养皿的内部包被有由琼脂糖或海藻酸钠株作为细胞外基质的三维支架，使用细胞外基质作为培养支架，可以使卵巢组织块更好地贴壁生长，有利于间质组织向外生长以及营养物质的充分交换。。

另外，在培养的过程中，优选的，在培养皿的每个孔中预先加入700-850微升第二培养液后，再加入3-4块呈块状的预处理后卵巢组织，该操作可以使得所有的块状卵巢组织能够被完全浸没，进而使得卵巢组织的各个部位的细胞能够充分的吸收营养，为其提供维持生长所需足够的营养物质。另外，该实施例的方法中所用的培养液均为实施例二中所举出的培养液。

表1 本发明的卵巢组织冻融后早期体外培养系统与现有技术对比1

表2 本发明的卵巢组织冻融后早期体外培养系统与现有技术对比2

综上，由于离体的卵巢组织或卵泡没有血供，其营养主要由培养系统中培养液提供。因此，卵巢组织中各种细胞成分充分同培养液接触，对于吸收氧、能量等营养成分，同时排出代谢废物具有重要意义。但由于人卵巢组织结构致密，间质中有丰富胶原结缔组织，培养液渗透到卵巢组织的中心非常困难，对于组织中心部位细胞，包括始基卵泡吸收营养成分不利，妨碍体外生长发育。另外，在体外培养过程中，卵巢组织中仅有少量始基卵泡获得激活，多数始基卵泡不能激活，最终闭锁或凋亡，造成卵泡储备的巨大浪费。

针对上述两个技术问题，本申请中，采用新型人卵巢组织冻融后早期体外培养系统(培养液及其培养方法)，该方法解决了目前培养系统两个重要缺陷，请参考表1和表2：

1、通过将卵巢组织在含胶原酶的第一培养液中预培养30分钟，利用胶原酶对胶原等组织的酶解作用，使卵巢间质组织结构更疏松，利于培养液渗透，使位于组织中心部位细胞，包括始基卵泡能充分吸收营养成分，有利于体外生长发育。

2、通过在第二培养液中添加一定浓度的亮氨酸，由于亮氨酸是mTOR激动剂，能激活mTOR的表达，解除对始基卵泡启动的抑制，使卵巢组织中多数始基卵泡同时获得激活，能够有多个卵泡同时发育，最大程度利用了卵巢组织中的卵泡储备。获得的卵子可进行进一步的后期培养或直接进行应用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种卵巢组织冻融后早期体外培养液，其特征在于，包括：

用于将冻融后的卵巢组织预处理的第一培养液和将预处理后的卵巢组织长期培养的第二培养液；

其中，在所述第一培养液中，按照体积份数计，包括：0.8-1.2份胶原酶和8.8-9.2份含有10％胎牛血清的L-15培养液；

所述第二培养液以α-MEM为基础培养液，且所述第二培养液中包括体积份数为8-12％人白蛋白、体积份数为0.8-1.2％的ITS，含量为0.2-0.4IU/ml的人卵泡刺激素、45-55μg/ml的维生素C、0.4-0.5mmol/L的丙酮酸、1.5-2.5mmol/L的L－谷氨酰胺、70-80IU/ml的青霉素、70-80μg/ml链霉素和8-12mmol/L的亮氨酸。

2.一种根据权利要求1的培养液体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织；

将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液。

3.根据权利要求2所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述步骤将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后卵巢组织中，具体包括：

将冻融后的卵巢组织在无菌超净工作台上切成体积为1-1.2mm³的块状；

将块状的所述卵巢组织放入含有10％胎牛血清的L-15培养液后，在温度为35-37℃、CO₂体积含量为4-5％的培养箱中孵育8-10分钟，得到孵育后的卵巢组织小块；

将所述孵育后的卵巢组织小块加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织。

4.根据权利要求3所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述将块状的所述卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织的步骤中：

所述培养的时间为25-30分钟。

5.根据权利要求4所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液的步骤中；

所述培养皿为4孔或24孔培养皿。

6.根据权利要求5所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述步骤将冻融后的卵巢组织加入到第一培养液中，在35-37℃培养箱下培养，得到预处理后的卵巢组织之后，在所述步骤将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液之前，还包括：

将培养皿的内部包被有由琼脂糖或海藻酸钠珠作为细胞外基质的三维支架。

7.根据权利要求6所述的体外培养冻融后卵巢组织的方法，其特征在于，在所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿中，继续培养，隔天更换一次新鲜的第二培养液的步骤中，所述将预处理后卵巢组织加入到含有第二培养液的培养皿具体包括：

在培养皿的每个孔中预先加入700-850微升第二培养液，再加入3-4块呈块状的预处理后卵巢组织。