CN104293687A - 一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法，所述方法是将酿酒酵母的ARX1基因敲除；本发明方法可以高效地获得对乙酸耐性显著提升的酿酒酵母工程菌株，在高浓度乙酸(3g/l以上)存在时，乙醇发酵速率明显提高，发酵时间缩短24h以上。本发明方法获得的酿酒酵母工程菌株较亲株适用于发酵培养基存在高浓度乙酸(染菌或原料预处理过程中产生)时的燃料乙醇发酵生产工艺。

Description

一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法
(一)技术领域
本发明涉及微生物菌株乙酸耐受性的方法，特别涉及一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法。
(二)背景技术
近些年来，全球经济快速增长，石油等化石能源的消耗量大幅增加，价格持续走高，同时面临着资源枯竭的危机及各种环境问题。由于生物燃料(醇类、碳氢化合物及生物柴油)具有补充化石燃料资源、可再生、环保等优势，受到了各国的广泛关注。燃料乙醇是世界上生产和使用量最大的生物燃料，我国已成为世界上第三大燃料乙醇生产应用国。
燃料乙醇对缓解能源紧张和改善环境质量起到了重要作用，因此提高燃料乙醇的产量和改进乙醇生产工艺显得尤为重要。在燃料乙醇生产过程中，乙酸是酿酒酵母面临的一种重要的胁迫因子。乙酸是酿酒酵母发酵葡萄糖生产乙醇过程中一种代谢副产物。同时纤维素原料在蒸汽爆破和酸水解预处理过程，以及细菌污染同样也会产生乙酸。随着乙酸在醪液中不断积累，会抑制酵母的生长繁殖，最终影响发酵结果，是限制酵母乙醇发酵效率的主要原因之一。因此，选育耐高浓度乙酸的酿酒酵母菌株是提高燃料乙醇发酵效率的重要途径之一。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法，所述方法是将酿酒酵母的ARX1基因敲除(所述ARX1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示，ARX1基因的核苷酸序列上下游延长1000bp为SEQ ID NO:3所示)。
进一步，所述ARX1基因敲除是以PUG6载体质粒为PCR模板，在引物ARX1S和引物ARX1A的作用下进行PCR扩增，获得1930bp的DNA片段作为基因敲除组件，然后将敲除转入酿酒酵母进行同源重组，即获得提高乙酸耐受性的酿酒酵母；
引物ARX1S为：
5'-TAGCACAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3'；
引物ARX1A为：
5'-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3'。
更进一步，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741(购自ATCC，编号ATCC 201388)。
本发明所述提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法按如下步骤进行：
(1)基因敲除组件的构建：以PUG6载体质粒(GenBank号：AF298793.1)为模板，在引物ARX1S和引物ARX1A的作用下进行PCR扩增，获得1930bp的DNA片段(即基因敲除组件，核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示)；
引物ARX1S为：
5'-TAGCACAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3'；
引物ARX1A为：
5'-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3'；
(2)乙酸耐受性酿酒酵母菌株的获得：将酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BY4741菌体细胞约108个，1mg/ml鲑鱼精DNA50μl，0.5g/ml的聚乙二醇水溶液240μl(聚乙二醇分子量为3350)，1.0M醋酸锂溶液36μl，步骤(1)获得的1930bp的DNA片段25μl混合，枪头吹打混匀，30℃培养半小时后，42℃水浴热击40min，12000rpm离心1min，去上清，沉淀用1ml YPD液体培养基重悬，30℃、120rpm培养2-3h，吸取100μl培养液涂布于含终浓度300μg/ml新霉素(geneticin,G418；购自默克公司)的YPD平板，30℃培养2天后，取平板上长出来的菌落提取基因组为模板，分别以敲除验证引物和ARX1基因内部引物进行PCR反应，所述敲除验证引物为KS和AARX1，ARX1基因内部引物为ARX1-S和ARX1-A；电泳检测ARX1基因内部引物扩增无条带而敲除验证引物扩增的单一条带为1129bp，判断为ARX1基因缺失的酿酒酵母菌株；
引物KS为5'-GATCGCGTATTTCGTCTCG-3'；
引物AARX1为5'-TAATCAGCTTCGGCGGT AT-3'；
引物ARX1-S为5'-TGG ACAAATCGC ACAAACT-3'；
引物ARX1-A为5'-GAATGGATA AACGCCTTGT-3'。
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741菌体细胞制备方法为：挑取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741(MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)接种至20ml YPAD液体培养基(10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l腺嘌呤半硫酸，溶剂为去离子水，pH值5.5)中，30℃、200rpm培养12-16h。吸取1ml培养液转接到25ml 2×YPAD液体培养基(20g/l酵母粉，40g/l蛋白粉，40g/l葡萄糖，160mg/l腺嘌呤半硫酸，溶剂为去离子水，pH值5.5)中，30℃、200rpm培养2-3h(OD600值为3)，然后取1ml培养液离心，沉淀用无菌水洗两遍，获得菌体细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明方法可以高效地获得对乙酸耐性显著提升的酿酒酵母工程菌株，在高浓度乙酸(3g/L以上)存在时，乙醇发酵时间缩短24h以上。本发明方法获得的酿酒酵母工程菌株较亲株适用于发酵培养基存在高浓度乙酸(染菌或原料预处理过程中产生)时的燃料乙醇发酵生产工艺。
(四)附图说明
图1为ARX1基因敲除组件示意图。
图2为敲除组件和阳性转化子电泳验证图，泳道1为实施例1引物ARX1S和ARX1A扩增产物，泳道2为实施例2敲除验证引物(KS和AARX1)扩增产物，泳道3为实施例2ARX1基因内部引物(ARX1-S和ARX1-A)扩增产物。
图3为菌株BY4741与BYΔarx1乙酸耐受性比较，a表示菌体浓度3×107cells/ml，b表示菌体浓度3×106cells/ml，c表示菌体浓度3×105cells/ml。
图4为菌株BY4741与BYΔarx1在发酵条件下CO2失重比较。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
YPAD液体培养基组成：10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l腺嘌呤半硫酸，溶剂为去离子水，pH值为5.5。
YPD液体培养基组成：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.5。
实施例1 PUG6敲除组件的构建
根据已报道的酿酒酵母ARX1基因及其侧翼序列(GenBank号:NC_001136.10)，以及PUG6质粒loxp位点上下游部分基因序列(GenBank号：AF298793.1)，设计一对引物ARX1S和ARX1A，以pUG6质粒为模板扩增敲除组件(引物由上海桑尼生物科技合成)，组件的构成为ARX1基因同源序列(41bp)+PUG6匹配序列(18bp)+loxp+G418筛选标记+loxp+PUG6匹配序列(18bp)+ARX1同源序列(41bp)。
ARX1S为：
5'-TAGCACAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3'；
ARX1A为：
5'-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3'。
以质粒PUG6为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：5×buffer 10μl，dNTP 3μl，模板2μl，引物2μl(已各取1μl混合稀释到10μl沸水浴5min)，DNA聚合酶(Prime star；宝生物工程(大连)有限公司)0.5μl，ddH2O32.5μl，PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s；61.9℃退火15s；72℃延伸2min。得到PCR扩增产物，PCR清洁回收试剂盒(AXYGEN生物技术有限公司)回收后，琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物片段(图2泳道1)，结果表明长度为1930bp的敲除组件构建成功，敲除组件的序列为SEQ ID NO:1所示：
GCTAAAACTATCATGGCTCTAGCTATCTCCCACGAGGATACTCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGGACATATTGTCGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAGAACGCGGCCGCCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCACCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACTGTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGAAGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCACGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAATCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTTAAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCGGCCGCGGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGTTCATTTGCTCAGAATCTTGCATTATAATTACATTTTATTT
实施例2 ARX1基因敲除菌株的构建
(1)酿酒酵母菌体细胞：挑取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741(MATa；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0；购自ATCC，编号ATCC201388)接种至20ml YPAD液体培养基中，30℃、200rpm培养12-16h。吸取1ml培养液转接到25ml 2×YPAD液体培养基中，30℃、200rpm培养2-3h(OD600值为3)，然后取1ml培养液离心，沉淀用无菌水洗两遍，获得菌体细胞。
(2)ARX1基因缺失的酿酒酵母菌株构建：将步骤(1)制备的菌体细胞108个，10mg/ml鲑鱼精DNA(沸水煮10min，置于冰水混合物冷却)50μl，500g/l的PEG3350为240μl，1.0M醋酸锂溶液36μl，扩增产物片段25μl(实施例1制备)混合，枪头吹打混匀，30℃培养半小时后，42℃水浴热击40min，12000rpm离心1min，去上清，沉淀用1ml YPD液体培养基重悬，30℃、120rpm培养2-3h，吸取100μl培养液涂布于含终浓度300μg/ml的新霉素(geneticin,G418；购自默克公司)的YPD平板，30℃培养2天后，平板上长出来的菌落用酵母基因组提取试剂盒(ThermoFisher Scientific)提取基因组。设计转化子验证引物两对：敲除验证引物(KS和AARX1)；ARX1基因内部引物(ARX1-S和ARX1-A)。
引物KS为5'-GATCGCGTATTTCGTCTCG-3'；
引物AARX1为5'-TAATCAGCTTCGGCGGT AT-3'；
引物ARX1-S为5'-TGG ACAAATCGC ACAAACT-3'；
引物ARX1-A为5'-GAATGGATA AACGCCTTGT-3'。
以基因组为模板进行PCR扩增，反应体系为：2×taq酶10μl，引物1μl，模板1μl，ddH2O 8μl，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；51.9℃和50.5℃退火30s；72℃延伸1.5min。通过PCR的方法进行验证，电泳后ARX1基因内部引物(ARX1-S和ARX1-A)无条带，而敲除验证引物(KS和AARX1)的单一条带为1129bp，判断为ARX1基因缺失的酿酒酵母菌株，命名为酿酒酵母菌株BYΔarx1。同样条件下以等量无菌水替代扩增产物片段作为对照。
实施例3乙酸耐受性和发酵性能比较
(1)从斜面上挑取酿酒酵母BY4741和酿酒酵母BYΔarx1菌株分别接种至25ml YPD液体培养基中，30℃过夜培养，用无菌水将菌体调整到3×107cells/ml，并依此10倍稀释2个梯度。用移液枪吸取4μl点样于YPD平板(对照)和含3.5g/l乙酸的YPD平板，点样后30℃恒温培养箱中培养观察。图3显示ARX1敲除菌株BYΔarx1在含乙酸的YPD平板上的生长明显优于出发菌株BY4741。
(2)吸取步骤(1)中BY4741和BYΔarx1在30℃培养过夜后的菌液，6000r/min离心，将菌体接种至发酵培养基中(250ml锥形瓶，每瓶100ml培养基，组成：100g/l葡萄糖，10g/l蛋白胨，5g/l酵母膏，3.5g/l乙酸，溶剂为去离子水，pH值为4.5)，接种后发酵液初始菌浓度为1OD，34℃、80rpm摇床培养，每隔8h对锥形瓶进行称重。图4为绘制的时间-CO2失重曲线。结果显示菌株BYΔarx1的发酵延滞期明显短于出发菌株BY4741，发酵时间缩短24小时左右。

Claims (3)

1.一种提高酿酒酵母菌株乙酸耐受性的方法，其特征在于所述方法是将酿酒酵母的ARX1基因敲除。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述ARX1基因敲除是以PUG6载体质粒为模板，在引物ARX1S和引物ARX1A的作用下进行PCR扩增，获得1930bp的DNA片段作为基因敲除组件，然后将敲除组件转入酿酒酵母进行同源重组，即获得提高乙酸耐受性的酿酒酵母；
引物ARX1S为：
5'-TAGCACAGCCAACCCATAATGCCTTCTAAAAACTCCATCAACAGATTGTACTGAGAGTG-3'；
引物ARX1A为：
5'-TCTCCTAATATACATAAACCGAGCCATTCCTACTATACAAGATACCGCTCGCCGCAGCC-3'。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741。
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