CN104278089A

CN104278089A - 一种野败型不育基因pcr检测引物及其应用

Info

Publication number: CN104278089A
Application number: CN201410492719.1A
Authority: CN
Inventors: 戴伟民; 张帮华; 宋小玲; 强胜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-09-24
Also published as: CN104278089B

Abstract

本发明公开了一种野败型不育基因PCR检测引物WA7及一种组合引物WA7/RED4。该组合引物WA7/RED4包括WA7正向引物5’-TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、WA7反向引物5’-TACTTTCAGGAGGGGAGGCA-3’、RED4正向引物5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’和RED4反向引物5’-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。采用本发明组合引物WA7/RED4，一次PCR即可有效完成对杂交稻、杂草稻和常规稻的鉴定，简便，快速，准确，易于实现批量化检测。

Description

一种野败型不育基因PCR检测引物及其应用

技术领域

本发明涉及一种野败型不育基因PCR检测引物及一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻用的组合引物。

背景技术

亚洲栽培稻（Oryza sativa）是我国重要的粮食作物之一。在种植面积上，常规稻（Oryza sativa），即可以留种且后代不分离的水稻品种，占一半左右；三系杂交稻（Oryza sativa）种植也占一半左右。其中在三系杂交稻中，野败型三系杂交稻是目前最主要种植类型。

近年来，在我国的水稻田中，又出现了另一种稻属植物—杂草稻（Oryza sativa），其往往与栽培稻相伴生，分布极为广泛，几乎存在于世界上所有的稻作生产区。在世界上温带地区一些种植水稻国家危害已成为仅次于稗草和千金子的第三大杂草，密度达到2-40株/m²时可使水稻减产19%-89%，全季度干扰可使水稻减产61%，且蔓延速度不断加快，危害程度不断升级。

我们在对我国水稻主要种植区域进行杂草调查过程中，发现在许多地区，同一块田中会出现杂交稻、杂草稻、常规稻混杂在一起的情况。由于杂交稻、杂草稻和常规稻三者都属于禾本科稻属，拥有同一学名（Oryza sativa），形态上也非常相似。因此，甚至科研人员在研究采样时候，也有时会分辨不清。由于杂交稻产量高、种植面积大、需要企业生产的种子量大，如果种子不纯，将会导致企业、农户等大量损失。现有对杂交稻是否含有不育基因进行检测，已有多条分子标记被开发（Narayanan et al., 1996; Sane et al., 1997; Yashitola et al., 2004; Rajendrakumar et al., 2007），然而这些引物只是当时开发出来用于对保持系和不育系进行了筛选。因此，当我们尝试用这些引物对杂交稻、杂草稻和常规稻进行筛选时候，根本不能使用。

如果开发出快速检测杂交稻、杂草稻和常规稻分子标记，将有利于人们快速有效分辨杂交稻、杂草稻和常规稻，提高稻种纯度以及科研样品准确度。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能够有效筛选杂交稻的分子标记。

为了达到上述目的，本发明提供了一种野败型不育基因PCR检测引物，该引物为WA7，包括正向引物5’- TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、反向引物5’- TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’。

本发明还提供了上述引物WA7在筛选杂交稻方面的应用。

为了能够一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻，本发明还提供了一种组合引物WA7/RED4，包括WA7正向引物5’- TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、WA7反向引物5’- TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’、RED4正向引物5’- TTACAGGGGAGCAGAAACA -3’和RED4反向引物5’- TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC -3’。

本发明还提供了上述组合引物在一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻方面的应用，具体检测方法如下：

（1）DNA提取：提取待检测的杂草稻、杂交稻或常规稻DNA；

（2）PCR扩增：将步骤（1）提取的DNA进行PCR扩增；其中 PCR扩增采用上述组合引物；

（3）电泳：将步骤（2）中的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，染色观察。

步骤（2）中PCR扩增体系为： DNA 1μL，2×PCR Mix 5.0μL，组合引物WA7/RED4 0.25 μL，ddH₂O 3.5μL；DNA浓度为10 ng/μl ； 2×PCR Mix 成分为：dNTP 0.2 mmol L^-1、KCl 100 mmol L^-1、Tris-HCl 20 mmol L^-1、Taq Polymerase 5 U/100 μL、MgCl₂ 3.0 mmol L^-1；所述Tris-HCl的pH值为8.5。

PCR扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸l min，30 个循环；最后72℃延伸8 min。

本发明相比现有技术具有以下优点：通过对野败型不育基因和红色果皮基因，进行NCBI序列比对，设计和筛选一系列特异性检测三系杂交稻和杂草稻的引物，进而通过组合扩增片段大小的引物，优化两者混合比例及PCR程序，形成有效检测的分子组合标记WA7/ RED4，一次PCR即可有效完成对杂交稻、杂草稻和常规稻的鉴定。本发明对杂交稻、杂草稻及常规稻的检测简便，快速，准确，易于实现批量化检测，对于稻种混杂度检测等具有良好的应用前景。

附图说明

图1为各样品利用本发明组合引物进行分子标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图中，M为100bp Marker；1为江苏扬州（杂草稻）；2为江苏如皋（杂草稻）；3为江苏南京（杂草稻）；4为江苏盐城（杂草稻）；5为江苏连云港（杂草稻）；6为江苏宜兴（杂草稻）；7为江苏泗洪（杂草稻）；8为江苏徐州（杂草稻）；9为江苏沭阳（杂草稻）；10为江苏扬州（常规稻）；11为江苏如皋（常规稻）；12为江苏南京（常规稻）；13为江苏盐城（常规稻）；14为江苏连云港（常规稻）；15为江苏苏州（常规稻）；16为江苏宜兴（常规稻）；17为江苏泗洪（常规稻）；18为江苏徐州（常规稻）；19为江苏沭阳（常规稻）；20为三系杂交稻Ⅱ优838（杂交稻）；21为三系稻杂交汕优63（杂交稻）；22为三系杂交稻抗优63（杂交稻）； 23为三系杂交稻神州3号（杂交稻）；24为三系杂交稻Ⅱ优98（杂交稻）；25为三系杂交稻Ⅱ优838（杂交稻）；26为三系杂交稻Ⅱ优86（杂交稻）；27为三系杂交稻宜优673（杂交稻）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

本发明进行杂交稻、杂草稻和常规稻检测用的组合引物WA7/RED4，包括WA7正向引物5’- TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、WA7反向引物5’- TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’、RED4正向引物5’- TTACAGGGGAGCAGAAACA -3’和RED4反向引物5’- TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC -3’。

利用上述引物进行杂交稻、杂草稻和常规稻一次性检测的方法如下：

1、DNA提取：提取各样品的DNA，提取方法如下：

（1）颖果

取单粒种子去壳后于研钵中；

加300μL预热(65℃)抽提液(100 mmol L^-1 Tris-HCl pH 8.0, 20 mmol L^-1 EDTA, 500 mmol L^-1 NaCl, 1.5% SDS)研磨后，再加入100μL预热(65℃)抽提液冲洗，转入1.5/mL离心管中，加预热(65℃)400μL抽提液溶液。65℃水浴30分钟，期间混匀3次；

加入100μl NaAc(1/4体积),摇匀;

加入400μl (等体积)氯仿-异戊醇(内含4%（v/v）异戊醇，10%（v/v）乙醇)，摇匀；

离心(12000rpm、 5min)，要注意配平;转移上清液至另一1.5ml管中，400μl左右;

加入-20℃预冷的无水乙醇(2倍体积)至一定刻度，摇匀;

离心(12000rpm、5min);

弃无水乙醇，加入70%乙醇400ul左右，稍微混匀后放置10min左右，弃酒精、倒扣离心管于吸水纸上使DNA干燥;

加入200μl TE，加入1ul RNA酶，用手轻弹使之溶解，室温放置10分钟，-20℃保存。

（2）干标本和新鲜材料

在研钵中用液氮研磨成粉末1/3 1.5ml管;

加入600μl65℃提取液(100 mmol L^-1 Tris-HCl pH 8.0, 20 mmol L^-1 EDTA, 500 mmol L^-1 NaCl, 1.5% SDS)摇匀；

65℃温浴30min，间或振荡3-4次，温浴至样液变墨绿色;

加入100μl NaAc(1/4体积),摇匀;

加入-20℃预冷的无水乙醇(2倍体积)至一定刻度，摇匀;离心(12000rpm、5min);

弃无水乙醇，70%乙醇洗两次，弃酒精、倒扣离心管于吸水纸上使DNA干燥;

加入200ulTE，加入1μl RNA酶，用手轻弹使之溶解，室温放置10分钟，-20℃保存。

2、PCR扩增：

采用10 μL PCR 扩增体系[(DNA (10 ng/μl) 1μL，2×PCR Mix 5.0μL，Mix特异性引物 (F/R)（即组合引物WA7/RED4） 0.25 μL，ddH₂O 3.5μL), 其中2×PCR Mix 成分为dNTP 0.2 mmol L^-1、KCl 100 mmol L^-1、Tris-HCl(pH 8.5) 20 mmol L^-1、Taq Polymerase 5 U/100 μL、MgCl₂ 3.0 mmol L^-1 (南京基天生物技术有限责任公司购买)]。反应程序为94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，2℃延伸l min，30 个循环；72℃延伸8 min。

3、电泳：

PCR 扩增后产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，硝酸银染色照相。染色后如图1所示。从图1可以清楚区分杂草稻2-9、常规稻10-19、以及杂交稻20-27。

<110>南京农业大学

<120>一种野败型不育基因PCR检测引物及其应用

<160>4

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>水稻野败型不育基因的正向引物。

<400> 1

TTTGCCTTAT TTTGACCTGT TTGA 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>水稻野败型不育基因的反向引物。

<400> 2

TACTTTCAGG AGGGGAGGCA 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>水稻红色果皮基因的正向引物。

<400> 3

TTACAGGGGA GCAGAAACA 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>水稻红色果皮基因的反向引物。

<400> 4

TCTTCTCCTC TCTTTCAGCA C 21

Claims

1.一种野败型不育基因PCR检测引物，其特征在于：所述引物为WA7，包括正向引物5’- TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、反向引物5’- TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’。

2.权利要求1所述野败型不育基因PCR检测引物在筛选杂交稻方面的应用。

3.一种组合引物，其特征在于：所述组合引物为WA7/RED4，包括WA7正向引物5’- TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、WA7反向引物5’- TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’、RED4正向引物5’- TTACAGGGGAGCAGAAACA -3’和RED4反向引物5’- TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC -3’。

4.权利要求3所述组合引物在一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻方面的应用。

5.权利要求4所述的应用，其特征在于：所述组合引物一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻的步骤如下：

（1）DNA提取：提取待检测的杂草稻、杂交稻或常规稻DNA；

（2）PCR扩增：将步骤（1）提取的DNA进行PCR扩增；所述PCR扩增采用所述组合引物；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中PCR扩增体系为： DNA 1μL，2×PCR Mix 5.0μL，组合引物WA7/RED4 0.25 μL，ddH₂O 3.5μL；所述DNA浓度为10 ng/μl ；所述2×PCR Mix 成分为：dNTP 0.2 mmol L^-1、KCl 100 mmol L^-1、Tris-HCl 20 mmol L^-1、Taq Polymerase 5 U/100 μL、MgCl₂ 3.0 mmol L^-1；所述Tris-HCl的pH值为8.5。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中PCR扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸l min，30 个循环；最后72℃延伸8 min。