CN104278049A - 利用葡串细基格交配性基因诱导异旋孢腔菌突变菌株恢复有性生殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7恢复有性生殖的方法。本发明所提供的使异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7恢复有性生殖的方法，为如下(A)或(B)：(A)包括如下步骤：将葡串细基格孢的两个交配型基因同时导入异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7，得到重组菌；将所述重组菌自交即可产生有性世代；(B)包括如下步骤：将葡串细基格孢的两个交配型基因分别导入异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7。实验证明，本发明将葡串细基格孢的MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因导入到异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7(丧失了有性生殖能力)中，C4-41.7菌株恢复了有性生殖能力。本发明对于探索细基格孢属真菌的有性进化及发育遗传机制具有重要意义，为其它类群真菌的性别起源、分化及发育研究提供了理论与经验积累。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种使异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7恢复有性生殖的方法。
背景技术
真菌的生活史主要包含无性阶段和有性阶段，无性生殖不需要核配与减数分裂，体细胞直接以断裂、裂殖或芽殖方式产生无性孢子。有性生殖则需要性细胞或性器官结合，经过核配与减数分裂产生各种类型的有性孢子。无性生殖生长周期短，保留了母本的优良性状且物种数量迅速增加，在稳定环境条件下，具突出的优越性。但在恶劣生境下，有性生殖处于优势地位。有性生殖两性亲本分别传递一半的遗传信息，可以进行基因重组与遗传变异，利于优良基因快速传播，使不良基因逐渐消退，由此增强了生物对不良环境的适应性。真菌性别分化及有性进化是自然选择的结果，在适应性选择进化过程中，有性生殖受遗传因子和环境因子的协同调控。
细基格孢属是暗色丝孢真菌中的一个重要类群，由Preuss于1846年提出，1851年以葡串细基格孢(U.botrytis)为模式种正式建立。该属的几个近似属(链格孢属Alternaria Nees、匍柄霉属Stemphylium Wallr、埃里砖格孢属Embellisia E.G.Simmons及假格孢属Nimbya E.G.Simmons)均已经发现了有性态，然而迄今为止，细基格孢属的有性态尚未发现。因此，对该属真菌的分类描述仅限于无性特征，如分生孢子的形态、大小、纵横隔膜数、长宽比及孢壁结构等，有时难免会出现属间分类标准的重叠，致使细基格孢属的界定长期存在分歧。细基格孢属许多种的分类地位常游移于匍柄霉属和链格孢属之间，造成错误鉴定或同物异名。二十世纪中叶，Simmons(1967)对该属进行了系统研究，较全面地阐述了细基格孢属真菌的分类特征，对一些分类单位进行了认真的订正，对Preuss有关细基格孢属的观点给予支持和认可。在对大量的模式标本和代表性培养物认真观察和描述的基础上，对本属的合法分类地位给予肯定。
目前，对细基格孢属的分类及系统学研究较为成熟，通过形态学与分子系统学结合的方法发现了大量新的物种，丰富了细基格孢属物种资源并积累了大量基因信息。然而涉及本属有性进化研究的资料基本没有，因此相关方面研究有待开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种使异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7恢复有性生殖的方法。
本发明所提供的使异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7恢复有性生殖的方法，可为如下(A)或(B)：
(A)可包括如下步骤：将葡串细基格孢的两个交配型基因同时导入异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7，得到重组菌株；将所述重组菌株自交即可产生有性世代；
(B)可包括如下步骤：将葡串细基格孢的两个交配型基因分别导入异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7，得到重组菌株1和重组菌株2；将所述重组菌株1和所述重组菌株2杂交即可产生有性世代。
将所述葡串细基格孢的两个交配型基因分别记为MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因；所述MAT1-1-1基因编码的蛋白质的氨基酸序列具体为序列表中序列1；所述MAT1-2-1基因编码的蛋白质的氨基酸序列具体为序列表中序列2。
进一步，所述MAT1-1-1基因的序列为序列表中序列3或序列5；所述MAT1-2-1基因的序列为序列表中序列4或序列6。
其中，序列3是葡串细基格孢MAT1-1-1基因的基因组序列，由1217个核苷酸组成，其中第248-294位为内含子序列；序列5是葡串细基格孢MAT1-1-1基因的cDNA序列，由1170个核苷酸组成。序列3和序列5均编码序列表中序列1所示的蛋白质。序列4葡串细基格孢MAT1-2-1基因的基因组序列，由1083个核苷酸组成，其中第482-535位为内含子序列；序列6是葡串细基格孢MAT1-2-1基因的cDNA序列，由1029个核苷酸组成。序列4和序列6均编码序列表中序列2所示的蛋白质。
在所述(A)方法中，所述MAT1-1-1基因和所述MAT1-2-1基因是通过同一个重组表达载体A导入所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的；
在所述(B)方法中，所述MAT1-1-1基因是通过重组表达载体B1导入所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的；所述MAT1-2-1基因是通过重组表达载体B2导入所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的。
进一步，所述重组表达载体A中启动所述MAT1-1-1基因和所述MAT1-2-1基因共同转录的启动子为GPD1启动子；
所述重组表达载体B1中启动所述MAT1-1-1基因转录的启动子为GPD1启动子；
所述重组表达载体B2中启动所述MAT1-2-1基因转录的启动子为GPD1启动子。
更加具体的，所述重组表达载体A为将所述MAT1-1-1基因(序列5)插入到PHDTBAR载体的多克隆位点(如Xho I和Hind III)，并将所述MAT1-2-1基因(序列6)插入到PHDTBAR载体的多克隆位点(如Hind III和Hind III)后形成的重组质粒。
所述重组表达载体B1为将所述MAT1-1-1基因(序列5的第1-1167位)插入到PHDTBAR载体的多克隆位点(如Xho I和Hind III)后形成的重组质粒。
所述重组表达载体B2为将所述MAT1-2-1基因(序列6的第1-1026位)插入到PHDTBAR载体的多克隆位点(如Xho I和Hind III)后形成的重组质粒。
其中，所述PHDTBAR载体是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(a1)用Kpn I单酶切PHDT-OH载体(序列7)，将酶切后所得的大片段进行连接，得到中间载体1；
(a2)将序列表中序列8所示DNA片段正向插入到所述中间载体1的酶切位点EcoRI处，得到的重组质粒即为所述PHDTBAR载体。
在本发明中，所述重组表达载体A、所述重组表达载体B1或所述重组表达载体B2是通过根癌农杆菌介导的方式导入到所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的。
在本发明的一个实施例中，所述根癌农杆菌具体为根癌农杆菌AGL-1。
本发明的另一个目的是提供一种蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，为蛋白质A和蛋白质B。所述蛋白质A的氨基酸序列为序列表中序列1；所述蛋白质B的氨基酸序列为序列表中序列2。
编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。
所述蛋白质A的编码基因的序列具体为序列表中序列3或序列5；所述蛋白质B的编码基因的序列具体为序列表中序列4或序列6。
含有所述蛋白质A的编码基因和/或所述蛋白质B的编码基因的表达盒、重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述蛋白质，或所述基因，或所述表达盒、重组载体或重组菌在使不具有性生殖能力的真菌恢复有性生殖能力中的应用也属于本发明的保护范围。
所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明中，所述不具有性生殖能力的真菌具体为异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7。
实验证明，本发明将葡串细基格孢的MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因导入到异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7(丧失了有性生殖能力)中，C4-41.7菌株恢复了有性生殖能力。本发明对于探索细基格孢属真菌的有性进化及发育遗传机制具有重要意义，为其它类群真菌的性别起源、分化及发育研究提供了理论与经验积累。
附图说明
图1为重组转化子MAT1-1-1和MAT1-2-1基因的PCR分析。其中，1：C4-41.7；2：MAT1-1-1基因；3：MAT1-2-1基因；M：DNA分子量标准。
图2为重组转化子的RT-PCR检测结果。其中，A：重组转化子ChMAT-0{UloMAT1}；B：重组转化子ChMAT-0{UloMAT2}；C：重组转化子ChMAT-0{UloMAT1+2}；M：DNA分子量标准。
图3为重组转化子的荧光定量PCR检测结果。其中，U.botrytis为葡串细基格孢野生型对照。
图4为各菌株交配情况。
A：2829(MAT1-1-1)×2849(MAT1-2-1)；
B：2829(MAT1-1-1)×2829(MAT1-1-1)；
C：2849(MAT1-2-1)×2849(MAT1-2-1)；
D：C4-41.7×C4-41.7；
E：C4-41.7×2829(MAT1-1-1)；
F：C4-41.7×2849(MAT1-2-1)；
G：ChMAT-0{PHDTBAR}×ChMAT-0{PHDTBAR}；
H：ChMAT-0{PHDTBAR}×2829(MAT1-1-1)；
I：ChMAT-0{PHDTBAR}×2849(MAT1-2-1)；
J：ChMAT-0{UloMAT1}×ChMAT-0{UloMAT1}；
K：ChMAT-0{UloMAT1}×C4-41.7；
L：ChMAT-0{UloMAT2}×ChMAT-0{UloMAT2}；
M：ChMAT-0{UloMAT2}×C4-41.7；
N：ChMAT-0{UloMAT1}×ChMAT-0{UloMAT2}；
O：ChMAT-0{UloMAT1+2}×ChMAT-0{UloMAT1+2}。
图5为PHDT-OH载体的载体图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
葡串细基格孢(Ulocladium botrytis)：荷兰真菌菌种保藏中心(简称CBS)，编号为CBS198.67)。
异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)为典型的异宗配合真菌。下述实施例中共涉及三株异旋孢腔菌：
异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7：其中MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因均被敲除。Wirsel et al.(1996)将异旋孢腔菌野生菌株中的MAT基因敲除，得到了不含MAT基因的突变菌株C4-41.7(MAT-0)，该菌株丧失了有性生殖的能力，成为后期不同丝状子囊真菌MAT基因研究的重要资源。参考文献：Wirsel S,Turgeon BG,Yoder OC(1996)Detection of the Cochliobolus heterostrophus mating-type(MAT)locus promotes thefunction of MAT.Curr Genet 29:241-249。公众可从东北农业大学获得。
异旋孢腔菌野生菌株2829：只含有MAT1-1-1基因的异旋孢腔菌菌株。中科院微生物所提供标准菌株。
异旋孢腔菌野生菌株2849：只含有MAT1-2-1基因的异旋孢腔菌菌株。中科院微生物所提供标准菌株。
PHDT-OH载体：载体图谱如图5所示，全载体序列如序列表中序列7所示。
pBG载体：记载于“Arie T,Kaneko I,Yoshida T,Noguchi M,Nomura Y,Yamaguchi I(2000)Mating-type genes from asexual phytopathogenic ascomycetes Fusarium oxysporumand Alternaria alternata.Mol Plant-Microbe In 13(12):1330-1339”一文中，公众可从山东农业大学获得。
实施例1、葡串细基格孢MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因的克隆及功能验证
一、葡串细基格孢MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因的基因组序列的克隆
1、葡串细基格孢基因组DNA的提取
采用CTAB法提取葡串细基格孢的总DNA：
(1)取0.2g左右菌丝于液氮中，在研钵中迅速研磨成干粉状。
(2)把粉末转入标号的1.5mL离心管中，每个离心管加650μL CTAB buffer，上下轻轻颠倒数次使之混合均匀。
(3)将离心管放入65℃水浴保温0.5-1h，每10min轻轻颠倒混匀一次。
(4)冷却至室温后，加入等体积(650μL)的氯仿:异戊醇(体积比＝24:1)，颠倒混匀20min。
(5)离心(10000rpm，10min，4℃)，吸取上清液至另一新的离心管中。
(6)在上清液管中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置20min。
(7)离心(10000rpm，10min，4℃)，弃上清液。
(8)用75％乙醇(100μL)洗涤沉淀2次，37℃干燥待乙醇挥发干。
(9)加入600μL无菌水，使沉淀溶解。
(10)加入600μL饱和酚:氯仿:异戊醇(体积比＝25:24:1)，抽提1-3次后静置5min，离心(10000rpm，10min，4℃)，吸取上清液至另一新的离心管中。
(11)加入600μL氯仿:异戊醇(体积比＝24:1)，抽提1-3次后离心(10,000rpm，10min，4℃)，吸取上清液至另一新的离心管中。
(12)上清液加入1/10体积4M NaAc(终浓度为0.1-0.4M)溶液后，加入2倍体积无水乙醇，放置20min后，离心(10000rpm，10min，4℃)沉淀DNA，倒掉上清液。
(13)沉淀用预冷的75％乙醇洗涤2-3次，干燥后溶于150μL无菌水，4℃备用。
取5μL DNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的长度和质量，最后用微量蛋白核酸定量仪检测浓度和纯度，于-20℃保存备用。
2、PCR扩增
以步骤1所得的葡串细基格孢基因组DNA为模板，采用引物对1-F/1-R和引物对2-F/2-R分别进行PCR扩增。
1-F：5’-ATGGACACTGCAGGTTTCGT-3’(序列为序列3的第1-20位)；
1-R：5’-TCAAGCGTTGGGAACATCGTCGA-3’(序列3的第1195-1217位的反向互补序列)。
2-F：5’-ATGAACGCAGAGATCTACCG-3’(序列为序列4的第1-20位)；
2-R：5’-CTAGTAGGTGTCCTGGAAGAAGG-3’(序列4的第1061-1083位的反向互补序列)。
PCR反应结束以后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果显示，采用引物对1-F/1-R进行PCR所得产物大小约为1217bp，进一步测序该PCR产物的序列为序列表中序列3；采用引物对2-F/2-R进行PCR所得产物大小约为1083bp，进一步测序该PCR产物的序列为序列表中序列4。
其中，序列3所示的基因为MAT1-1-1基因，第248-294位为内含子序列，整个序列3编码序列表中序列1所示的蛋白质；序列4所示的基因为MAT1-2-1基因，第482-535位为内含子序列，整个序列4编码序列表中序列2所示的蛋白质。
二、葡串细基格孢MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因的cDNA序列的克隆
1、总RNA的提取
将葡串细基格孢菌株从冻存管中移至PDA平板培养基上，在25℃生化培养箱内培养7天后，用内径5mm的打孔器于菌落边缘取3-5块菌丝块，移植到100mL PD液体培养基中，于25℃恒温摇床振荡培养5d，4层无菌纱布过滤菌丝，放研钵内加液氮研磨至粉末状。然后使用RNA提取试剂盒(OMEGA Fungal RNA Kit，产品目录号为R6840-01)提取RNA，步骤如下：
(1)收集研磨的真菌菌丝100mg于离心管中，迅速加入500μL buffer RB(使用前在每500μL buffer RB中加入10μL巯基乙醇)，漩涡震荡使之完全溶解。
(2)将溶解物移至Spin Column中，13000rpm离心5min。
(3)将上清液转移至一个新的1.5ml离心管中，不要吸入任何杂质；加入0.5倍体积的无水乙醇，漩涡震荡15s使之混匀。
(4)将所有液体(包括沉淀)移入Hibioid RNA mini Column，室温10000rpm离心30s。弃流出液，将吸附柱放入新的收集管中。
(5)加入500μL RNA wash buffer I，盖紧盖子，10000rpm离心30s。弃流出液，将吸附柱放回收集管中。
(6)用DNase I(70μL RDD(购自天根生化科技有限公司，产品目录号：DP431)+10μL DNase(购自天根生化科技有限公司，产品目录号：DP431))处理15min。
(7)再次用500μL RNA wash buffer I洗涤，10000rpm离心30s，弃流出液，将吸附柱放入新的收集管中。
(8)加入700μL RNA wash buffer II(使用前先加无水乙醇)，盖紧盖子，10000rpm离心30s。弃流出液，将吸附柱放回收集管中。
(9)再加入500μL RNA wash buffer II，盖紧盖子，10000rpm离心30s。弃流出液，将吸附柱放回收集管中。然后高速离心1min。控干吸附柱内水分。
(10)将吸附柱放到新的离心管内，加入50-100μL DEPC处理水，高速离心1min，收集RNA。
2、紫外检测RNA产率和纯度
取出10μL RNA样品，用40μL DEPC处理水稀释至50μL，同时设50μL DEPC处理水空白对照，于紫外分光光度计检测A260、A280、A230的相对吸收值。RNA产率可在A260检测紫外吸收，1个单位大约相当40μg单链RNA/mL。纯度较高的RNA的A260/A280应在1.7-2.0之间，A260/A230应在1.8-2.2之间。
3、反转录cDNA第一链的合成
取2μg总RNA，在冰浴中按以下体系配置混合液：10×RT Buffer 2μL；dNTP(各2.5mM)2μL；Oligo-dT15(10μM)2μL；Quant Reverse Transcriptase 1μL；总RNA 2μg；RNase Free ddH2O补足20μL。其中，10×RT Buffer、dNTP、Oligo-dT15、Quant Reverse Transcriptase和RNase Free ddH2O均为天根生化科技有限公司生产的试剂盒(产品目录号为KR103-04)中的产品。
将反应液彻底混匀后，简短离心，37℃温育60min。加入180μL DEPC处理的ddH2O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃备用。
实验同时设置3支阴性对照：(1)加入第一链反应所需的所有试剂，但不加模板RNA；(2)加除了反转录酶外的所有试剂；(3)加除引物外的所有试剂。
4、RT-PCR
以总RNA反转录合成的cDNA为模板，采用引物对1-Xho-F/1-Hind-R和引物对2-Xho-F/2-Hind-R分别进行RT-PCR扩增。
A.引物对1-Xho-F/1-Hind-R的序列如下：
1-Xho-F：5’-CCGCTCGAGATGGACACTGCAGGTTTCGT-3’(下划线部分为XhoI的识别序列，其后的序列为序列5的第1-20位)；
1-Hind-R：5’-CCCAAGCTTAGCGTTGGGAACATCGTCGA-3’(下划线部分为Hind III的识别序列，其后的序列为序列5的第1148-1167位的反向互补序列)。
B.引物对2-Xho-F/2-Hind-R的序列如下：
2-Xho-F：5’-CCGCTCGAGATGAACGCAGAGATCTACCG-3’(下划线部分为XhoI的识别序列，其后的序列为序列6的第1-20位)；
2-Hind-R：5’-CCCAAGCTTGTAGGTGTCCTGGAAGAAGG-3’(下划线部分为Hind III的识别序列，其后的序列为序列6的第1007-1026位的反向互补序列)。
C.引物对2-Hind-F/2-Hind-R的序列如下：
2-Hind-F：5’-CCCAAGCTTATGAACGCAGAGATCTACCG-3’(下划线部分为HindIII的识别序列，其后的序列为序列6的第1-20位)；
2-Hind-R：5’-CCCAAGCTTGTAGGTGTCCTGGAAGAAGG-3’(下划线部分为Hind III的识别序列，其后的序列为序列6的第1007-1026位的反向互补序列)。
反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃总延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析。
RT-PCR反应结束以后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果显示，采用引物对1-Xho-F/1-Hind-R进行RT-PCR所得产物大小约为1170bp，进一步测序该PCR产物的序列为“CCGCTCGAG+序列5的第1-1167位+AAGCTTGGG”；采用引物对2-Xho-F/2-Hind-R进行RT-PCR所得产物大小约为1029bp，进一步测序该PCR产物的序列为“CCGCTCGAG+序列6的第1-1026位+AAGCTTGGG”；采用引物对2-Hind-F/2-Hind-R进行RT-PCR所得产物大小约为1029bp，进一步测序该PCR产物的序列为“CCCAAGCTT+序列6的第1-1026位+AAGCTTGGG”。
其中，序列5为MAT1-1-1基因的cDNA序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质；序列6为MAT1-2-1基因的cDNA序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质。
三、含有MAT1-1-1基因和/或MAT1-2-1基因的重组表达载体的构建
以pBG和PHDT-OH为基础载体，构建了适宜转化C4-41.7菌株的双丙氨膦抗性载体PHDTBAR。然后，以PHDTBAR为基础构建三个MAT基因异源表达载体：MAT1-1-1基因单独表达，MAT1-2-1基因单独表达及MAT1-1-1和MAT1-2-1基因同时表达的载体。根据细基格孢交配型基因序列设计PCR引物，并根据异源表达载体PHDTBAR多克隆位点信息，选择合适的酶切位点，将目的基因序列连入载体。所得克隆经菌落PCR初步验证后，再测序验证以用于后续实验。具体如下：
1、PHDTBAR载体的构建
从pBG载体上得到双丙氨膦抗性基因，将PHDT-OH载体上的潮霉素抗性基因替换掉，得到了重组载体PHDTBAR。具体操作如下：
(1)从pBG载体上扩增得到双丙氨膦抗性基因，采用的引物为BIA-ECOR-F和BIA-ECOR-R。
BIA-ECOR-F：5’-CCGGAATTCAGCTTTTGCCCATGACGGC-3’；
BIA-ECOR-R：5’-CCGGAATTCTCAGATCTCGGTGACGGGCA-3’。
(2)将PHDT-OH载体用Kpn I单酶切，然后用T4DNA连接酶(大连宝生物公司，2011A)将骨架载体大片段进行连接，得到中间载体1。
(3)采用限制性内切酶EcoR I单酶切步骤(1)1中采用引物对BIA-ECOR-F/BIA-ECOR-R进行PCR扩增所得的产物，胶回收后与经过同样单酶切的步骤(2)中得到的中间载体1相连，得到重组质粒PHDTBAR。经测序，重组质粒PHDTBAR为在中间载体1的EcorRI处正向插入了序列表中序列8所示DNA片段后的到的重组质粒。
2、PHDTBAR-MAT1的构建
采用限制性内切酶Xho I和Hind III双酶切步骤一中采用引物对1-Xho-F/1-Hind-R进行PCR扩增所得的产物，胶回收后与经过同样双酶切的PHDTBAR载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将经Xho I和Hind III双酶切初步鉴定正确(得到大小约为11000bp和1170bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明将PHDTBAR载体的酶切位点Xho I和Hind III之间的小片段替换为序列表中序列5的第1-1167位所示DNA片段的重组质粒命名为PHDTBAR-MAT1。
在重组表达载体PHDTBAR-MAT1中，启动所述MAT1-1-1基因转录的启动子为GPD1启动子。
3、PHDTBAR-MAT2的构建
采用限制性内切酶Xho I和Hind III双酶切步骤一中采用引物对2-Xho-F/2-Hind-R进行PCR扩增所得的产物，胶回收后与经过同样双酶切的PHDTBAR载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将经Xho I和Hind III双酶切初步鉴定正确(得到大小约为11000bp和1029bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明将PHDTBAR载体的酶切位点Xho I和Hind III之间的小片段替换为序列表中序列6的第1-1026位所示DNA片段的重组质粒命名为PHDTBAR-MAT2。
在重组表达载体PHDTBAR-MAT2中，启动所述MAT1-2-1基因转录的启动子为GPD1启动子。
4、PHDTBAR-MAT1-MAT2的构建
采用限制性内切酶Hind III单酶切步骤一中采用引物对2-Hind-F/2-Hind-R进行PCR扩增所得的产物，胶回收后与经过同样双酶切的PHDTBAR-MAT1载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将经Hind III单酶切初步鉴定正确(得到大小约为12170bp和1029bp的两个目的条带)的重组质粒送样测序。将经测序表明于PHDTBAR-MAT1载体的酶切位点Hind III处正向插入了序列表中序列6的第1-1026位所示DNA片段的重组质粒命名为PHDTBAR-MAT1-MAT2。
四、异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7重组转化子的获得及鉴定
1、重组表达载体转化农杆菌AGL-1
将步骤三构建的三种重组表达载体分别转化到农杆菌AGL-1感受态中，得到三种重组农杆菌。具体如下：
①将农杆菌AGL-1感受态置于冰上融化，约10min。
②将1μg(约5μL)的质粒(步骤三构建的重组表达载体)添加到农杆菌AGL-1感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。
③液氮中放置5min。
④37℃热击5min，冰上放置2min。
⑤添加1mL YEB液体培养基，于28℃，150rpm震荡培养3h。
⑥8000rpm离心3min，去掉大约800μL上清后重悬，之后涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL羧苄霉素YEB抗性平板上培养2-3d。
⑦菌落PCR验证转化子，同时保存菌种(含体积分数15％的甘油)于-80℃保存备用。
对于转入PHDTBAR-MAT1载体的重组农杆菌，采用引物对1-F/1-R(序列同上)进行PCR扩增，得到大小为1170bp目的条带的重组农杆菌为阳性，命名为AGL-1/MAT1；对于转入PHDTBAR-MAT2载体的重组农杆菌，采用引物对2-F/2-R(序列同上)进行PCR扩增，得到大小为1029bp目的条带的重组农杆菌为阳性，命名为AGL-1/MAT2；对于转入PHDTBAR-MAT1-MAT2载体的重组农杆菌，分别采用引物对1-F/1-R和引物对2-F/2-R(序列同上)进行PCR扩增，分别得到大小为1170bp和1029bp目的条带的重组农杆菌为阳性，命名为AGL-1/MAT1-MAT2。
采用同样的方法将PHDTBAR空载体导入农杆菌AGL-1感受态中，得到重组农杆菌，采用用引物对BIA-F/BIA-R(BIA-F:AGCTTTTGCCCATGACGGC/BIA-R:TCAGATCTCGGTGACGGGCA)进行PCR扩增，得到大小为1234bp目的条带的重组农杆菌为阳性，命名为AGL-1/PHDTBAR。
2、农杆菌介导的异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7遗传转化
将步骤1获得的三种重组农杆菌分别转化异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7，得到异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的三种重组转化子。具体如下：
A.异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7孢子悬液的制备
(1)将异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7移至CMX培养基(配方：酵母提取物1g、酶水解干酪素0.5g、酸水解干酪素0.5g、木糖10g、Ca(NO3)2·4H2O 1g、KH2PO40.2g、MgSO4·7H2O 0.25g、NaCl 0.15g、琼脂粉15g，去离子水定容至1L，pH6.0)，23℃，16小时光照培养。从培养14d左右的平板刮取适量的异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7孢子到1mL无菌的0.05％(体积分数)Tween20液中，涡旋分散。
(2)用玻璃丝绵过滤除去菌丝，滤液收集于1.5mL离心管中，12000rpm离心3min收集孢子。
(3)去上清，用1mL无菌生理盐水(W/V 0.85％，NaCl)重悬孢子，12000rpm离心5min再次收集孢子。
(4)再用适量的生理盐水重悬孢子，血球计数板计算孢子数目，并将孢子悬液调到105-106孢子/mL浓度。可以直接使用或是4℃保存一周内使用。
B.农杆菌介导的异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7遗传转化
(1)将步骤1获得的重组农杆菌接种于4mL YEB液体培养基(含Rif及Kana抗生素)，于摇床中28℃，250rpm过夜培养。
(2)将培养液12,000rpm离心2min，并用IM液体(配方：M-N溶液100μL、K-buffer 50μL、0.01％FeSO4溶液50μL、50％甘油溶液50μL、Spore Elements 25μL、2M葡萄糖溶液17.5μL、20％NH4NO3溶液12.5μL、1％CaCl2·2H2O溶液5μL、1MMES溶液200μL、100mM AS溶液10μL，加入4480μL去离子水补足5mL，混匀后使用)重悬菌体至OD600为0.15，体积约为10-20mL。
其中，各溶液配方具体如下：
AS(100mM)溶液：称取4.91g AS溶于25mL DMSO中，0.22μm过滤器过滤除菌，分装于1.5mL离心管中，室温保存备用。
MES(1M)溶液：取9.76g MES溶于50mL水中，0.22μm过滤器过滤除菌，室温保存备用。
K-buffer：取6g K2HPO4和4.35g KH2PO4溶于30mL去离子水中，0.22μm过滤器过滤除菌，4℃保存备用。
M-N溶液：称取0.9g MgSO4·7H2O和0.45g NaCl溶于30mL去离子水中，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。
1％CaCl2·2H2O溶液(m/v)：取0.3g CaCl2·2H2O溶于30mL去离子水中，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。
0.01％FeSO4溶液(w/v)：取0.018g FeSO4·7H2O溶于100mL去离子水中，0.22μm过滤器过滤除菌，4℃保存备用。
20％NH4NO3溶液(w/v)：取6g NH4NO3溶于30mL去离子水中，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。
50％甘油溶液(v/v)：取25mL甘油溶于25mL去离子水中，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。
2M葡萄糖溶液：取11.88g葡萄糖溶于30mL去离子水中，0.22μm过滤器过滤除菌，4℃保存备用。
Spore Elements：100mg/L ZnSO4·7H2O、100mg/L CuSO4·5H2O、100mg/L H3BO3、100mg/L MnSO4·H2O、100mg/L Na2MoO4·2H2O，高压蒸汽灭菌后4℃保存备用。
(3)于28℃摇床250rpm培养4-6h，最终OD600值在0.6-0.8之间。
(4)吸取上述500μL菌液与步骤A收集好的500μL异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7孢子悬浮液于1.5mL离心管中，28℃，200rpm培养20min。
(5)将上述混合液均匀涂于几个共培养培养基(配方：向100mL融化的水琼脂培养基中加入M-N溶液2mL、K-buffer 1mL、0.01％FeSO4溶液1mL、50％甘油溶液1mL、Spore Elements 500μL、20％NH4NO3溶液250μL、2M葡萄糖溶液250μL、1％CaCl2·2H2O溶液100μL、1M MES溶液4mL、100mM AS溶液200μL，混匀后使用)中，28℃培养36h。其中，各溶液配方同上。
(6)然后将含有双丙氨膦(产品品牌：Goldbio，货号：B0178)的筛选培养基(配方：向150mL融化的CM培养基中加入浓度为300mg/mL的Cef溶液200μL、浓度为300mg/mL的Carb溶液100μL和800μg/mL的双丙氨膦，混匀后使用)倒入上述平板中，将平板于28℃下培养到转化子出现。其中，CM培养基配方如下：酵母提取物1g、酶水解干酪素0.5g、酸水解干酪素0.5g、葡萄糖10g、Ca(NO3)2·4H2O 1g、KH2PO40.2g、MgSO4·7H2O 0.25g、NaCl 0.15g、琼脂粉15g，去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌备用。
(7)将以上得到的转化子接种到含800μg/mL双丙氨膦的培养基(配方：向150mL融化的CM培养基(配方同上)中加入浓度为300mg/mL的Cef水溶液200μL、浓度为300mg/mL的Carb水溶液100μL和800μg/mL的双丙氨膦，混匀后使用)上进行二次鉴定。
采用同样的方法将重组农杆菌AGL-1/PHDTBAR导入异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7，获得相应的重组转化子，命名为ChMAT-0{PHDTBAR}。
3、异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的三种重组转化子的鉴定
对步骤2得到的具有双丙氨膦抗性的三种重组转化子进行分子鉴定。具体如下：
A.PCR检测
采用CTAB法提取步骤2得到的具有双丙氨膦抗性的三种重组转化子的基因组DNA(具体参照实施例1步骤一1)作为模板。对于转入PHDTBAR-MAT1载体的重组转化子，采用引物对1-F/1-R(序列同上)进行PCR扩增，得到大小为1170bp目的条带(MAT1-1-1基因)的重组转化子为阳性；对于转入PHDTBAR-MAT2载体的重组转化子，采用引物对2-F/2-R(序列同上)进行PCR扩增，得到大小为1029bp目的条带(MAT1-2-1基因)的重组转化子为阳性；对于转入PHDTBAR-MAT1-MAT2载体的重组转化子，分别采用引物对1-F/1-R和引物对2-F/2-R(序列同上)进行PCR扩增，分别得到大小为1170bp和1029bp目的条带的重组转化子为阳性。实验同时设置以未经转化的异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7作为对照。
如图1所示：泳道2为MAT1-1-1基因阳性结果；泳道3为MAT1-2-1基因阳性结果；而泳道1为未经转化的异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7对照，未扩增出相应的目的条带。
B.RT-PCR检测
提取经步骤A鉴定阳性的三种重组转化子的总RNA，反转录(具体操作参照实施例1步骤二1-3)后，进行RT-PCR分子验证(具体操作参照实施例1步骤二4进行)。以EF-1α基因为内参。实验同时设置以未经转化的异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7作为对照。
RT-PCR引物序列如下：
用于检测葡串细基格孢MAT1-1-1基因的引物对：
QMAT1-1F：5’-GTGGGAAGCCGATCCAAA-3’(序列5的第318-335位)；
QMAT1-1R：5’-CTGGCGTAGGTATGTTGAGGTAAG-3’(序列5的第437-460位的反向互补序列)。
用于检测葡串细基格孢MAT1-2-1基因的引物对：
QMAT1-2F：5’-CCAGTCACGCAAGGCTAAG-3’(序列6的第630-648位)；
QMAT1-2R：5’-GTTGACGGGAAGCGCAGGTT-3’。
用于检测内参基因的引用对：
EF1α-F：5’-TCATCGTCCTCAACCACCC-3’；
EF1α-R：5’-AGAGTTCTCAACAGACTTTCC-3’。
对于转入PHDTBAR-MAT1载体的重组转化子，采用引物对QMAT1-1F/QMAT1-1R进行RT-PCR扩增，得到大小为143bp目的条带(MAT1-1-1基因)的重组转化子为阳性(如图2中A的转化子)，命名为ChMAT-0{UloMAT1}；对于转入PHDTBAR-MAT2载体的重组转化子，采用引物对QMAT1-2F/QMAT1-2R进行PCR扩增，得到大小为127bp目的条带(MAT1-2-1基因)的重组转化子为阳性(如图2中B的转化子)，命名为ChMAT-0{UloMAT2}；对于转入PHDTBAR-MAT1-MAT2载体的重组转化子，分别采用引物对QMAT1-1F/QMAT1-1R和引物对QMAT1-2F/QMAT1-2R进行PCR扩增，分别得到大小为143bp和127bp目的条带的重组转化子为阳性(如图2中C的转化子)，命名为ChMAT-0{UloMAT1+2}。
C.荧光定量PCR检测
提取经步骤B鉴定阳性的三种重组转化子的总RNA，反转录(具体操作参照实施例1步骤二1-3)后，进行荧光定量PCR分子验证。以EF-1α、GAPDH和β-tubulin基因为内参。实验同时设置以未经转化的异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7和葡串细基格孢作为对照。具体如下：
反应体系：2.5×SuperReal PreMix 12.5μL；正向引物(10μM)0.75μL；反向引物(10μM)0.75μL；cDNA模板2.5μL；RNase-free dd H2O 3.5μL。其中，2.5×SuperRealPreMix和RNase-free dd H2O为天根生化科技有限公司生产的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(FP205)试剂盒中的产品。
反应程序：95℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火15s，68℃延伸30s，共进行45个循环；最后65-95℃制备溶解曲线。
荧光定量PCR引物对：
用于检测葡串细基格孢MAT1-1-1基因的引物对为QMAT1-1F/QMAT1-1R(序列同上)；用于检测葡串细基格孢MAT1-2-1基因的引物对为QMAT1-2F/QMAT1-2R(序列同上)；用于检测EF-1α、GAPDH和β-tubulin内参基因的引物对如表1所示：
表1用于检测EF-1α、GAPDH和β-tubulin内参基因的引物对
每个样品做三个重复，用2-△△Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析。所得结果取经过三个内参基因综合分析得到的结果。
结果如图3所示，MAT1-1-1基因在转化子ChMAT-0{UloMAT1}和ChMAT-0{UloMAT1+2}中都能够正常表达，而且与葡串细基格孢野生型中的表达量水平相当。MAT1-2-1基因在转化子ChMAT-0{UloMAT2}和ChMAT-0{UloMAT1+2}中都能够正常表达，而且与葡串细基格孢野生型中的表达量水平相当。
五、异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7重组转化子有性态的诱导
为了验证葡串细基格孢的交配型基因(MAT)在异旋孢腔菌遗传背景下是否具有功能，能否使C4-41.7菌株恢复有性生殖的能力，本发明的发明人进行了如下两方面的研究：
1、ChMAT-0{UloMAT1}×ChMAT-0{UloMAT2}是否产生子囊壳
将Sach固体培养基(配方：去皮马铃薯200g、K2HPO40.25g、CaCO34g、Ca(NO3)21g、MgSO40.25g、Fecl30.02g、琼脂粉15g，去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌备用)倒平板，待培养基凝固后中间平铺1×4cm的玉米叶，将经过上述步骤验证阳性的重组转化子ChMAT-0{UloMAT1}和ChMAT-0{UloMAT2}分别用打孔器取直径5mm大小的菌块对角接种于距玉米叶边缘1.5-2cm处，进行对峙培养，25℃黑暗培养，长出子囊壳后移至光照培养箱中使其成熟(记为ChMAT-0{UloMAT1}×ChMAT-0{UloMAT2})。同时以异旋孢腔菌野生菌株2829和异旋孢腔菌野生菌株2849对峙培养(记为2829(MAT1-1-1)×2849(MAT1-2-1))作为对照。实验重复3次。
结果显示，八周后，ChMAT-0{UloMAT1}×ChMAT-0{UloMAT2}在玉米叶上产生了子囊壳(图4中N)，但与2829(MAT1-1-1)×2849(MAT1-2-1)产生的子囊壳(图4中A)相比，数量较少。这表明将ChMAT-0{UloMAT1}和ChMAT-0{UloMAT2}杂交(异宗配合)，使C4-41.7菌株恢复了产生有性世代的能力。
2、ChMAT-0{UloMAT1+2}×ChMAT-0{UloMAT1+2}是否产生子囊壳
将Sach固体培养基(配方同上)倒平板，待培养基凝固后中间平铺1×4cm的玉米叶，将经过上述步骤验证阳性的重组转化子ChMAT-0{UloMAT1+2}用打孔器取直径5mm大小的菌块接种于距玉米叶边缘1.5-2cm处，25℃黑暗培养，长出子囊壳后移至光照培养箱中使其成熟(记为ChMAT-0{UloMAT1+2}×ChMAT-0{UloMAT1+2})。
同时设置如下13个对照：
对照1：异旋孢腔菌野生菌株2829和异旋孢腔菌野生菌株2849同条件对峙培养(记为2829(MAT1-1-1)×2849(MAT1-2-1))。
对照2：以异旋孢腔菌野生菌株2829同条件单独培养(记为2829(MAT1-1-1)×2829(MAT1-1-1))。
对照3：异旋孢腔菌野生菌株2849同条件单独培养(记为2849(MAT1-2-1)×2849(MAT1-2-1))。
对照4：异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7同条件单独培养(记为C4-41.7×C4-41.7)。
对照5：异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7和异旋孢腔菌野生菌株2829同条件对峙培养(记为C4-41.7×2829(MAT1-1-1))。
对照6：异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7和异旋孢腔菌野生菌株2849同条件对峙培养(记为C4-41.7×2849(MAT1-2-1))。
对照7：重组转化子ChMAT-0{PHDTBAR}同条件单独培养(记为ChMAT-0{PHDTBAR}×ChMAT-0{PHDTBAR})。
对照8：重组转化子ChMAT-0{PHDTBAR}和异旋孢腔菌野生菌株2829同条件对峙培养(记为ChMAT-0{PHDTBAR}×2829(MAT1-1-1))。
对照9：重组转化子ChMAT-0{PHDTBAR}和异旋孢腔菌野生菌株2849同条件对峙培养(记为ChMAT-0{PHDTBAR}×2849(MAT1-2-1))。
对照10：重组转化子ChMAT-0{UloMAT1}同条件单独培养(记为ChMAT-0{UloMAT1}×ChMAT-0{UloMAT1})。
对照11：重组转化子ChMAT-0{UloMAT1}和异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7同条件对峙培养(记为ChMAT-0{UloMAT1}×C4-41.7)。
对照12：重组转化子ChMAT-0{UloMAT2}同条件单独培养(记为ChMAT-0{UloMAT2}×ChMAT-0{UloMAT2})。
对照13：重组转化子ChMAT-0{UloMAT2}和异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7同条件对峙培养(记为ChMAT-0{UloMAT2}×C4-41.7)。
实验重复3次。
结果显示，八周后，ChMAT-0{UloMAT1+2}×ChMAT-0{UloMAT1+2}在玉米叶上产生了子囊壳(图4中O)。这表明将ChMAT-0{UloMAT1+2}自交即可有性世代，C4-41.7菌株恢复了有性生殖，且生殖模式由异宗配合变成了同宗配合。而对于13个对照，除作为阳性对照的对照1外，其余12个对照均未产生子囊壳。
Claims (10)
1.一种使异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7恢复有性生殖的方法，为如下(A)或(B)：
(A)包括如下步骤：将葡串细基格孢的两个交配型基因同时导入异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7，得到重组菌株；将所述重组菌株自交即可产生有性世代；
(B)包括如下步骤：将葡串细基格孢的两个交配型基因分别导入异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7，得到重组菌株1和重组菌株2；将所述重组菌株1和所述重组菌株2杂交即可产生有性世代。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述葡串细基格孢的两个交配型基因分别记为MAT1-1-1基因和MAT1-2-1基因；所述MAT1-1-1基因编码的蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列1；所述MAT1-2-1基因编码的蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述MAT1-1-1基因的序列为序列表中序列3或序列5；所述MAT1-2-1基因的序列为序列表中序列4或序列6。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：在所述(A)方法中，所述MAT1-1-1基因和所述MAT1-2-1基因是通过同一个重组表达载体A导入所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的；
在所述(B)方法中，所述MAT1-1-1基因是通过重组表达载体B1导入所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的；所述MAT1-2-1基因是通过重组表达载体B2导入所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体A中启动所述MAT1-1-1基因和所述MAT1-2-1基因共同转录的启动子为GPD1启动子；
所述重组表达载体B1中启动所述MAT1-1-1基因转录的启动子为GPD1启动子；
所述重组表达载体B2中启动所述MAT1-2-1基因转录的启动子为GPD1启动子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体A、所述重组表达载体B1或所述重组表达载体B2是通过根癌农杆菌介导的方式导入到所述异旋孢腔菌突变菌株C4-41.7的。
7.蛋白质，为蛋白质A和蛋白质B，其特征在于：所述蛋白质A的氨基酸序列为序列表中序列1；所述蛋白质B的氨基酸序列为序列表中序列2。
8.编码权利要求7所述蛋白质的基因；
所述蛋白质A的编码基因的序列具体为序列表中序列3或序列5；所述蛋白质B的编码基因的序列具体为序列表中序列4或序列6。
9.含有权利要求7或8中的所述蛋白质A的编码基因和/或权利要求7或8中的所述蛋白质B的编码基因的表达盒、重组载体或重组菌。
10.权利要求7所述的蛋白质，或权利要求8所述的基因，或权利要求9所述的表达盒、重组载体或重组菌在使不具有性生殖能力的真菌恢复有性生殖能力中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150114 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |