CN103347997A - 制备具有性周期的丝状真菌菌株的方法和制备有性杂交丝状真菌菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备具有性周期丝状真菌菌株的方法，其中对不具有或具有一种类型MAT基因座位的受体丝状真菌菌株进行重组，其中来自不是受体丝状真菌菌株的其他种的一种或者多种交配型基因座位基因和可选的性相关基因被引入到所述受体丝状真菌菌株以产生具有性周期的丝状真菌菌株。

Description

制备具有性周期的丝状真菌菌株的方法和制备有性杂交丝状真菌菌株的方法

发明领域

本发明涉及制备具有性周期丝状真菌菌株的方法，并涉及两个独立菌株有性杂交产生新菌株的用途。

发明背景

由WO/2009/054330已知制备具有性周期丝状真菌菌株对的方法。WO/2009/054330显示利用相同种的另一个分离菌的相反交配型基因座位替代烟草尖镰孢(Fusarium oxysporum)的交配型基因座位产生了一对交配互补的菌株。

等人1997年(Mating type genes from the homothallic fungus Sordariamacrospora are functionally expressed in a heterothallic Ascomycete.Genetics147：567-580)显示通过将大孢指疫霉(S.macrospora)同宗配合的交配基因座位递送入柄孢霉(Podospora ansinera)，后者可以获得以同宗配合方式形成子实体的能力。

Turgean等人1993年(Cloning and analysis of the mating type genes fromCochliobolus heterostrophus.Mol.Gen.Genet.238：270-284)显示通过添加交配型基因座位MAT1-2到含有MAT1-1的菌株，获得功能性同宗配合菌株。

Wirzel等人1998年(Single mating type-specific genes and their 3′UTRs controlmating and fertility in Cochliobolus heterostrophus.Mol.Gen.Genet.259：272-281)显示交配型基因座位的交换改变Cochliobolus heterosporus菌株的性别身份(sexualidentity)和杂交中功能的改变。

等人2008年(Asexual Cephalosporin C producer Acremoniumchrysogenum carries a functional mating type locus.Appl.Environm.Microbiol.74：6006-6016)显示A.chysogenum的MAT1-1基因座位可以替代柄孢霉(Podospora ansinera)中MAT1-1基因座位在性周期中的功能。

Grosse 2008年(The asexual pathogen Aspergillus fumigatus expresses functionaldeterminants of Aspergillus nidulans sexual development Eukaryotic Cell，7：1724-1732)描述了烟曲霉(Aspergillus fumigatus)MAT1-1基因座位在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)同宗配合系统中的功能。

Kwon-Chung和Sugui 2009年(Sexual reproduction in Aspergillus species ofmedical or economical importance：why so fastidious.Trends in Microbiology17：481-487)描述了近期发现的几个以前认为只限于无性生殖的曲霉种的有性生殖能力，及进行性周期所需培养条件的差异。

O′Gorman等人2009年(Discovery of a sexual cycle in the opportunistic fungalpathogen Aspergillus fumigatus，Nature 457，22 January 2009，471-475)公开了烟曲霉(Aspergillus fumigatus)分离菌的MAT1-1和MAT1-2组合的成对杂交。

然而上述现有技术方法不适用于仅已知有一种交配型基因座位的种。例如，黑曲霉(Aspergillus niger)不能进行有性杂交，因为迄今为止仅已知具有MAT1-1交配型基因座位的分离菌。根据上述引用的O′Gorman等人，对于发生在同宗配合真菌中的有性发育，对于分离菌必须包含相反的交配型基因座位。例如，对于具有MAT1-1基因座位的黑曲霉菌株，它将需要具有相反的MAT1-2基因座位的黑曲霉菌株以存在两种交配型。

发明概述

因此，本发明的一个目的是为不具有交配型基因座位或仅具有发现的一种交配型基因座位的丝状真菌种提供性周期。

本发明的另一个目的是提供一种丝状真菌种的不同菌株的有性杂交方法，其中不同菌株间染色体特性的随机交换可以在新的个体中重组。进一步的目的是对基于性周期的菌株提供这样的杂交方法，其中不需要选择性标记。

另一个目的是提供一种从仅已知一种交配型基因座位的种系有性杂交同基因或近等基因株的方法，以便引入有限的多样性并在不丢失同基因株共有的优势特性下交换。

另一个目的是提供一种在新菌株中有性杂交两个菌株遗传背景的方法。

根据本发明可以实现这些目的的一个或多个，其提供一种制备具有性周期丝状真菌菌株的方法，其中对不具有MAT基因座位或具有一种类型MAT基因座位的受体丝状真菌菌株进行重组，其中来自与受体丝状真菌菌株相同属的另一个种的一种或者多种交配型基因座位基因和可选的性相关基因被引入受体丝状真菌菌株以产生具有性周期的丝状真菌菌株。

根据本发明，有可能获得具有相反交配型的丝状真菌个体(例如受体丝状真菌菌株和从该方法得到的菌株)具有相反的交配型，产生一个或多个具有两种相反交配型的菌株对并且菌株具有性周期。

根据本发明，还有可能构建含有双方交配型基因座位的菌株，其在性周期中能够同宗配合或者异宗配合生殖。

附图简述

图1描述了用于从宿主菌株中缺失基因或者基因片段的策略。使用的DNA构建体包含amdS选择性标记，其侧翼是将被缺失基因的同源区(5′和3′)(1)。这些构建体通过在相应基因组基因座位(2)发生双同源重组(X)并替换基因组基因拷贝(3)来进行整合。随后，同向重复(U)间重组除去amdS标记，结果精确切除将被缺失的基因或者基因片段(4)。

图2上面组显示塔宾曲霉(A.tubingensis)分离菌AN205 MAT1-2基因座位内的和周围的基因，下面组显示黑曲霉(A.niger)分离菌CBS513.88 MAT1-1基因座位内的和周围的基因。如黑曲霉基因组中的标注给出了基因数量并通过相同的阴影指示塔宾曲霉基因组中的同源基因。黑条指示这两个分离菌MAT基因座位的独特序列。上面组利用虚线箭头指示编码包含蛋白质的HMG-盒的基因，下面组利用带横条的箭头指示编码包含蛋白质的a-因子的基因An11g10180。

图3是MAT1-2基因座位示意图指示利用表1所列引物产生用于构建质粒pGBmat1-2的两个PCR片段。

图4用于将黑曲霉菌株的交配型从MAT1-1改变到MAT1-2的pGBMAT1-2的质粒图谱。

图5是塔宾曲霉MAT1-2基因座位替代黑曲霉MAT 1-1基因座位的示意图。组1描述包含真菌DNA序列的质粒pGBMAT1-2片段。组2描述真菌菌株中发生基因置换的基因座位，连接组1和组2的线指示发生同源重组的区域。组3显示由“替代片段”替代“被替代片段”后的包含选择性标记amdS的黑曲霉基因组区域。组4显示除去amdS标记后的相同基因座位，amdS标记通过amdS标记两侧两个相同的侧翼同源重组除去。

序列表简述

SEQ ID NO：1显示塔宾曲霉分离菌MAT1-2基因座位的DNA序列。

SEQ ID NO：2显示塔宾曲霉MAT1-2基因座位蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3显示来自塔宾曲霉MAT1-2的HMG-盒的的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4显示来自塔宾曲霉MAT1-2的HMG盒N端部分的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5显示黑曲霉MAT1-1蛋白质的氨基酸序列。在Pel等人2007“交配过程”、“信号转导-有性生殖”和“子囊果(子实体)发育”中的密码，是An11g10180。

发明详述

受体丝状真菌菌株可以来自任意的不具有或者具有一种类型MAT基因座位的丝状真菌种，迄今为止这些菌株尚未发现具有性周期。在一个实施方案中，受体丝状真菌菌株具有一种或者不具有或者未知的MAT基因座位。丝状真菌菌株，包括但不限于，支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、金孢属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium属、镰孢菌属(Fusarium)、腐殖菌属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix属、链孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces属、白腐担子真菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳菌属(Thielavia)、雪状白僵菌属(Tolypocladium)、和木霉属(Trichoderma)的菌株。

合适的不具有性周期和不具有或者具有一种类型MAT基因座位的受体丝状真菌的实例是黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉变种(Aspergillus niger var.awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、Aspergillus vadensis、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)、Aspergillus lacticoffeatus、金黄曲霉(Aspergillus aureus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和Chrysosporium lucknowense。

在一个实施方案中，受体丝状真菌是曲霉属。在一个实施方案中，受体丝状真菌是曲霉种，例如，黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉变种(Aspergillus nigervar.awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、或者米曲霉(Aspergillus oryzae)。

一种或多种交配型基因座位基因和可选的一个或多个性相关基因，优选不来自受体真菌种，可以源自一个或多个供体真菌诸如费希尔曲霉(Aspergillusfischerianus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、Aspergillus lentulus、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、Aspergillusfruticulosus、黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、棕曲霉(Aspergillus ochraceus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)、霉白曲霉(Aspergillus niveus)、Aspergillustetrazonus、或者爪甲曲霉(Aspergillus unguis)或者Renispora flavissima，或者可能从其他方法获得的，例如从另一个供体有机体或者通过基因合成。

供体真菌优选来自与受体真菌相同属的另一个种。在一个实施方案中，对于供体菌株，至少两种不同分离菌是可获得的，一个具有MAT1-1交配型决定基因座位，另一个具有MAT1-2交配型决定基因座位。在另一个实施方案中，MAT1-1和MAT1-2存在于一个供体菌株中。在一个实施方案中，供体丝状真菌是曲霉(Aspergillus)属。在一个实施方案中，供体丝状真菌是塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)。在另一个实施方案中，供体真菌是塔宾曲霉AN205。

在一个实施方案中，受体丝状真菌菌株与分离的多核苷酸发生重组，所述多核苷酸包括：

(a)SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列；或者

(b)与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；或者

(c)如(a)、(b)或者(d)之一定义序列的遗传密码简并的序列；或者

(d)如(a)、(b)或者(c)之一定义序列的反向互补核苷酸序列；或者

(e)编码包含SEQ ID NO：3显示氨基酸序列的多肽或者具有与SEQ ID NO：3序列之一至少70％序列同一性的多肽的核苷酸序列；或者

(f)编码包含SEQ ID NO：4显示氨基酸序列的多肽或者具有与SEQ ID NO：4序列一至少70％序列同一性的多肽的核苷酸序列。

在一个实施方案中，供体真菌和受体真菌是相同的种，但是它们的MAT基因座位和/或编码推定的交配型等位点基因和/或性基因不同；例如，供体真菌可以具有一种MAT基因座位而受体真菌(不具有性周期)可以具有另一种MAT基因座位，其中为了赋予受体真菌性周期供体的供体MAT基因座位与受体真菌的MAT基因座位互补。

Turgeon和Yoder 2000年(Proposed nomenclature for mating type genes offilamentous ascomycetes.Fungal Genetics and Biology 31：1-5)提出了交配型基因的命名法，本文也使用该定义。

根据本发明可以添加交配型基因座位到受体丝状真菌菌株或者替代受体丝状真菌菌株中存在的交配型基因座位。在一个实施方案中，当添加交配型基因座位时，可以添加交配型基因座位MAT1-1到MAT1-2或者反之亦然或者可以添加MAT1-1和MAT1-2到不具有交配型或者存在未知交配型的菌株。在另一个实施方案中，MAT1-2可替代MAT1-1或者MAT1-1可替代MAT1-2。在一个实施方案中，该配对由MAT1-1和MAT1-2组成或者等同于MAT1-1和MAT1-2。

所产生的菌株可以是有性杂交的，其中至少一个MAT1-1和一个MAT1-2形成配对。以下是可能的组合：MAT1-1x MAT1-2、MAT1-2x MAT1-1、MAT1-2+MAT1-1x MAT1-2、MAT1-1+MAT1-2x MAT1-1、MAT1-2+MAT1-1xMAT1-2+MAT1-1。

根据本发明的一个实施方案，受体菌株包含MAT1-1并引入来自供体菌株的MAT1-2。在其一个实施方案中，所产生的菌株中存在MAT1-1和MAT1-2并且引入同宗配合的性周期。或者，MAT1-2可以替代MAT1-1，或者引入MAT1-2并除去MAT1-1，产生一对菌株(这里指受体菌株和由重组产生的菌株)并引入异宗配合的周期。

在本发明的另一个实施方案中，受体菌株不含有MAT，并从供体菌株引入MAT1-1和MAT1-2。在其一个实施方案中，所产生的菌株中存在MAT1-1和MAT1-2并且引入同宗配合的性周期。或者，在一个重组事件中，受体菌株可引入MAT1-1，产生具有MAT1-1交配型的菌株。在另一个重组事件中，受体菌株可引入MAT1-2，产生具有MAT1-2交配型的菌株。两个重组事件的菌株都产生一对菌株并因此引入异宗配合的周期。

在本发明的方法中，对受体丝状真菌进行重组，其中来自不是受体丝状真菌种的(例如源自供体真菌的)另一个种的一种或者多种交配型基因座位基因和可选的性相关基因被引入。

在本发明的上下文中，术语“重组”和“重组体”指任何遗传修饰，不排它性地包括天然发生的过程和/或宿主细胞受到随机诱变引起的遗传修饰，还包括基因破坏和/或缺失和/或具体的诱变，例如。结果，重组体和天然发生的过程和/或经由宿主细胞随机诱变引起的遗传修饰的组合被解释为重组体。

重组包括可由本领域技术人员利用本领域已知的分子生物学技术进行的基因引入和/或替代(参见：Sambrook & Russell，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，3rd Ed.，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)。可在WO199846772、WO199932617、WO2001121779、WO2005095624、EP635574B和WO2005100573中找到基因过表达的表达载体、下调的阻断载体、转化、标记的使用和选择性培养基通用设计的实例。

遗传元件诸如mat基因座位和/或编码推定的交配型等位点(idiomorph)的基因和性基因可以例如利用不同的方法克隆和/或测序，例如：

1)利用基因组序列密切相关种的同源性通过优选在感兴趣的遗传元件基因编码区的侧翼设计引物获得。

2)全基因组测序，随后利用生物信息学鉴定感兴趣的基因可以完成识别所涉及基因的DNA序列

3)基因组文库构建和杂交

4)宏基因组文库构建和测序和生物信息学鉴定

5)宏基因组文库构建和高通量筛选用于(异宗配合的或者同宗配合的)功能性性周期的一对菌株。

修复性周期：

在一个优选的实施方案中，受体菌株适合于获得具有编码交配型等位点基因座位的菌株。在另一个实施方案中，受体菌株适合于获得含交配型MAT1-1菌株和含交配型MAT1-2菌株，两者正常增进(progression)所需的缺陷基因可能通过性周期修复。

本文性-相关基因理解为真菌有性生殖所需的基因。在一个实施方案中，性-相关基因是交配行为、受精、精子发生或者性别决定涉及的基因。在一个实施方案中，这些功能可通过性-相关基因表达的蛋白质完成。这样基因的实例列于Pel等人“交配过程”、“信号转导-有性生殖”和“子囊果(子实体)发育”中的补充表5中，本文显示为表1。

本发明进一步涉及具有性周期的丝状真菌菌株，通过本发明如上所述的方法可以获得。

本发明进一步涉及多核苷酸，包括：

(a)SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列；或者

(b)与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、或者至少99％序列同一性的核苷酸序列；或者

(c)如(a)、(b)或者(d)之一定义序列的遗传密码简并的序列；或者

(d)如(a)、(b)或者(c)定义序列的反向互补核苷酸序列。

本发明进一步涉及包含SEQ ID NO：2显示氨基酸序列的多肽或者与SEQ IDNO：2序列之一具有至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、或者至少99％序列同一性的多肽变体。

本发明进一步涉及包含SEQ ID NO：3显示氨基酸序列的多肽或者与SEQ IDNO：3序列之一具有至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、或者至少99％序列同一性的多肽变体。

本发明进一步涉及包含SEQ ID NO：4显示氨基酸序列的多肽或者与SEQ IDNO：4序列之一具有至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、或者至少99％序列同一性的多肽变体。

序列同一性优选是以多核苷酸分子或者多肽分子全长计算的。

本发明进一步涉及引入了该多核苷酸或者任意编码一个或多个本发明如上述定义多肽的多核苷酸的载体。

编码感兴趣的化合物的感兴趣的多核苷酸，或者包含感兴趣的多核苷酸和如上所述控制序列的DNA构建体可一起参与生产包含一个或多个合适的限制性位点以允许插入或者置换可选的多核苷酸序列的重组体表达载体。

或者，感兴趣的多核苷酸可以通过在适当的表达载体中插入序列或者包含感兴趣的多核苷酸的核酸构建体来表达。在产生的表达载体中，编码序列位于载体中以便编码序列可操作地连接到适当的控制序列用于表达，和可能的分泌。

重组体表达载体可以是任何载体(例如质粒或者病毒)，其可以方便地进行重组体DNA过程并可以完成表达感兴趣的多核苷酸。载体的选择通常取决于载体与载体将被引入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或者封闭环形的质粒。载体可以是自主复制载体，即，以染色体外实体存在且独立于染色体复制的载体，例如，质粒、染色体外因子、微型染色体或者人工染色体。自主维持(autonomously maintained)克隆载体可以包含AMA1序列(参见，例如Aleksenko和Clutterbuck(1997)，Fungal Genet.Biol.21：373-397)。

或者，感兴趣的多核苷酸可以通过在适当的表达载体中插入序列或者包含感兴趣的多核苷酸来表达。在产生的表达载体中，编码序列位于载体中以便编码序列可操作地连接到适当的控制序列用于表达，和可能分泌。

重组体表达载体可以是任何载体(例如质粒或者病毒)，其可以方便地进行重组体DNA过程并可以完成表达感兴趣的多核苷酸。载体的选择通常取决于载体与载体将引入宿主细胞的相容性。载体可以是线性的或者封闭环形的质粒。载体可以是自主复制载体，即，以染色体外实体存在并独立于染色体复制的载体，例如，质粒、染色体外因子、微型染色体或者人工染色体。自主维持(autonomouslymaintained)克隆载体可以包含AMA1序列(参见，例如Aleksenko和Clutterbuck(1997)，Fungal Genet.Biol.21：373-397)。

或者，载体可以是如下载体，当被引入宿主细胞时，其整合入基因组并与其已经整合入的染色体同时复制。优选地，为了实现克隆载体和预定基因座位的整合，整合的克隆载体包含与宿主细胞基因组中预定靶基因座位DNA序列同源的DNA片段。为了促进靶向整合，克隆载体优选在转化宿主细胞前线性化。线性化优选这样完成，靶基因座位同源序列位于克隆载体末端的至少一侧但是优选两侧。靶基因座位侧翼同源序列的长度优选至少30bp，优选至少50bp，优选至少0.1kb，甚至优选至少0.2kb，更优选至少0.5kb，甚至更优选至少1kb，最优选至少2kb。

载体系统可以是单一的载体或质粒或者两个或更多载体或质粒，共同包含将被引入丝状真菌细胞基因组的全部DNA，或者转座子。

载体优选包含一个或多个选择性标记，其允许方便筛选已转化细胞。选择性标记是一种基因，其产物提供杀生物剂或者病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷原养型，等等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记选自，包括但不限于，amdS(乙酸胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、bleA(腐草霉素结合)、hyg(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸苷核-5′磷酸盐脱羧酶)、sC(硫酸盐腺苷酰转移酶)、和trpC(氨茴酸盐合酶)，和其它种属的相当物。供曲霉和青霉属细胞优选使用的是构巢曲霉或者米曲霉的amdS(EP635574B1、WO97/06261)和pyrG基因以及吸水链霉菌的bar基因。更优选使用amdS基因，甚至更优选来自构巢曲霉或者黑曲霉的amdS基因。最优选的选择性标记基因是构巢曲霉amdS编码序列融合到构巢曲霉gpdA启动子(参见EP 635574 B1)。也可使用来自其他有丝真菌的AmdS基因(WO97/06261)。

本发明进一步涉及包含本发明如上述定义的多核苷酸、本发明如上述定义的多肽和/或本发明如上述定义的载体的丝状真菌细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及丝状真菌菌株子代的生产方法，其中，本发明如上述定义的具有两种相反交配型丝状真菌的个体进行杂交并分离子代。

在本发明筛选丝状真菌菌株表型方法的一个实施方案中，其中，生产和筛选根据本发明如上述定义的具有性周期的真菌子代文库，选择具有特定表现型的菌株。

在一个实施方案中，在筛选丝状真菌菌株表现型的方法中，其中，来自一批菌株的两种相反交配型的丝状真菌菌株进行有性杂交，所述一批菌株是垂直或者水平谱系(vertical or horizontal lineage)。以这种方式，可以获得近同基因和引入有限多样性的菌株，没有丢失与高度同基因菌株库中菌株共有的优势特性。

烟草尖镰孢的MAT1-1和MAT1-2交配型基因与曲霉的交配型基因少于50％同一性。

在一个实施方案中，在没有观察到性周期的种中，通过利用来自具有完整性周期的相近种的遗传元件或者基因来进行性周期的恢复。

本发明有助于以有效的办法重组相同种两个菌株的特性，即，通过有性杂交。本发明的准性周期(parasexual)的优势是不同的菌株的突变可以在子代中重组，在不同的菌株之间染色体特性的随机交换可以被重组。另外，在杂交过程中不需要标记。

通过交换被引入的有利性质包括但不限于添加的性质(插入)、缺失的性质(缺失)或者改变的性质(突变)。实例是毒素簇、蛋白酶缺失、调节子缺失的举例，和感兴趣的化合物生产。在下文将更详细地描述性质的实例。

许多宿主细胞，尤其是真菌，用于生产感兴趣的多肽，其具有在编码多种毒素生物合成中涉及酶的基因。例如，环匹阿尼酸(cyclopiazonic acid)、曲酸、3-硝基丙酸和黄曲霉毒素是已知毒素，这些在例如黄曲霉中形成。相似的，单端抱霉烯族毒素(trichothecenes)在许多真菌中形成，例如，在诸如棉状嗜热丝孢菌(Fusarium venenatum)的镰孢菌属和木霉属，赭曲霉毒素可通过曲霉生产。最近，工业化的黑曲霉宿主菌株基因组测序揭示了伏马毒素(Fumonisin)基因簇(Pel等人，″Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus nigerCBS 513.88″.Nat Biotechnol.2007 Feb；25(2)：221-231)。由于这些毒素对操作者、用户和环境存在健康危害，所以在感兴趣的化合物发酵过程中形成的这样的毒素是极不受欢迎的。结果，毒素缺陷宿主细胞能够无毒素生产感兴趣的化合物。由于没有毒素必须从产品中出去，所以易于生产无毒素化合物。而且，用于化合物的行政审批程序(regulatory approval procedure)更容易。

在一个实施方案中，根据本发明的菌株可以包含编码化合物(可例如，可能是酶的多肽)或者生化通路的毒素相关多核苷酸，所述毒素相关多核苷酸包含修饰，其中，在可比较条件下培养时，与其源于的母细胞相比，宿主细胞不能生产所述毒素或者毒素中间体化合物。优选，毒素或者毒素中间体化合物是真菌毒素或者毒素中间体化合物。更优选，毒素或者毒素中间体化合物是来自曲霉的毒素或者毒素中间体化合物。甚至更优选毒素或者毒素中间体化合物是来自黑曲霉的毒素或者毒素中间体化合物。甚至更优选毒素或者毒素中间体化合物是来自黑曲霉CBS513.88的毒素或者毒素中间体化合物。甚至更优选，毒素或者毒素中间体化合物是伏马毒素或者伏马毒素中间体化合物。甚至更优选，毒素或者毒素中间体化合物是赭曲霉毒素或者赭曲霉毒素中间体化合物。最优选，毒素或者毒素中间体化合物是赭曲霉毒素或伏马毒素或者赭曲霉毒素或伏马毒素中间体化合物。

毒素相关多核苷酸编码真菌毒素或者毒素中间体化合物生产中涉及的化合物(可例如，可能是酶的多肽)或者生化通路的多核苷酸。更优选，毒素或者毒素中间体化合物来自曲霉。甚至更优选，毒素或者毒素中间体化合物来自黑曲霉。甚至更优选毒素或者毒素中间体化合物来自黑曲霉CBS513.88。甚至更优选，伏马毒素或者伏马毒素中间体化合物。甚至更优选，伏马毒素B或者伏马毒素B中间体化合物。甚至更优选，毒素相关多核苷酸包含来自An01g06820直至An01g06930伏马毒素簇的序列。最优选，毒素相关多核苷酸包含An01g06930序列。

在另一个实施方案中，毒素相关多核苷酸编码赭曲霉毒素或者赭曲霉毒素中间体化合物涉及的化合物(可例如，可能是酶的多肽)或者生化通路。更优选，毒素相关多核苷酸包含来自An15g07880直至An15g07930簇的序列。最优选，毒素相关多核苷酸包含An15g07910序列。最优选，毒素相关多核苷酸包含An15g07920序列。

优选，根据本发明的宿主细胞包含至少一种编码化合物(可例如，可能是酶的多肽)或者生化通路的毒素相关多核苷酸，所述毒素相关多核苷酸包含至少一种修饰，其中，在可比较条件下培养时，与其源于的母细胞相比，宿主细胞不能生产所述毒素或者毒素中间体化合物。

更优选，根据本发明的宿主细胞包含两种毒素相关多核苷酸，所述两种毒素相关多核苷酸各包含至少一种修饰，其中，在可比较条件下培养时，与其源于的母细胞相比，宿主细胞不能生产伏马毒素和赭曲霉毒素。

甚至更优选，根据本发明的宿主细胞包含三种或更多毒素相关多核苷酸，所述三种或更多毒素相关多核苷酸各包含至少一种修饰，其中，在可比较条件下培养时，与其源于的母细胞相比，宿主细胞不能生产伏马毒素、赭曲霉毒素和至少一种附加毒素或毒素中间体化合物。

在一个实施方案中，根据本发明的菌株缺失glaA和至少一种组件选自amyA、amyBI、amyBII、oahA、毒素相关化合物和prtT，借助于在编码glaA和所述组件的多核苷酸具有修饰。更优选，根据本发明的宿主细胞缺失glaA、oahA和至少一种组件选自amyA、amyBI、amyBII、毒素相关化合物和prtT。甚至更优选，根据本发明的宿主细胞缺失glaA、oahA、毒素相关化合物和至少一种组件选自amyA、amyBI、amyBII和prtT。甚至更优选，根据本发明的宿主细胞缺失glaA、oahA、amyA、amyBI、amyBII至少一种组件选自毒素相关化合物和prtT。甚至更优选，根据本发明的宿主细胞缺失glaA、oahA、amyA、amyBI、amyBII、prtT和毒素相关化合物。最优选，根据本发明的宿主细胞包含至少两种基本上同源的适于一个或多个感兴趣的多核苷酸拷贝整合的DNA结构域，其中，与其源于的基本上同源的DNA结构域相比，至少两个基本上同源的DNA结构域中的至少一个对感兴趣的多核苷酸适合于具有增强的整合偏好，缺失glaA、oahA、amyA、amyBI、amyBII、prtT和毒素相关化合物并且进一步缺失NHR组件，优选Ku70或者其同源染色体。

除本文上述描述的缺陷或者修饰的组件之外，根据本发明的宿主细胞可以缺陷其它组件，诸如主要的蛋白酶如pepA。优选，pepA是真菌pepA。更优选，pepA是来自曲霉的pepA。甚至更优选pepA是来自黑曲霉的pepA。甚至更优选pepA是来自黑曲霉CBS 513.88的pepA。最优选，pepA包含An14g04710序列。优选，根据本发明的宿主细胞显示至少5％pepA缺失，更优选至少10％缺失，更优选至少20％缺失，更优选至少30％缺失，更优选至少40％缺失，更优选至少50％缺失，更优选至少60％缺失，更优选至少70％缺失，更优选至少80％缺失，更优选至少90％缺失，更优选至少95％缺失，更优选至少97％缺失，更优选至少99％缺失。最优选，宿主细胞显示100％pepA缺失。

可选地，或者结合本文上述描述的缺失，根据本发明的菌株可以包含与野生型细胞相比提高的解折叠蛋白应答(UPR)以提高感兴趣的多肽的生产能力。UPR可以通过在US2004/0186070A1和/或US2001/0034045A1和/或WO01/72783A2和/或WO2005/123763中描述的技术增加。更具体地说，调整HAC1和/或IRE1和/或PTC2的蛋白水平，和/或工程化SEC61蛋白质以获得具有提高UPR的宿主细胞。优选的SEC61修饰是导致SEC61单向突变(one-waymutant)的修饰；即，突变体中重新合成的蛋白质可以通过SEC61进入ER，但是该蛋白质不能通过SEC61离开ER。这种修饰广泛地描述于WO2005/123763中。最优选，SEC61修饰是S376W突变，其中丝氨酸376被色氨酸取代。

本发明也提供一种用于生产感兴趣的化合物的方法，包括：

a.在有助于生产所述化合物的条件下，培养根据本发明的杂交细胞；和

b.从营养培养基中回收感兴趣的化合物。

本发明的感兴趣的化合物可以是任何的生物学化合物。生物学化合物可以是任何的生物聚合物或者代谢物。生物学化合物可以是通过由构成生物合成或者代谢途径的单一多核苷酸或者系列多核苷酸编码，或者可以是单一多核苷酸产物或系列多核苷酸产物的直接结果。生物学化合物相对于宿主细胞可以是天然的或者异源的。

术语“异源生物学化合物”在本文定义为相对于细胞不是天然的生物学化合物；或者进行结构修饰的天然生物学化合物以改变天然生物学化合物。

在本文术语“生物聚合物”定义为相同的、相似的或者不同的亚基的链(或者聚合体)。生物聚合物可以是任何的生物聚合物。生物聚合物可以例如是，但不限于，核酸、聚胺、多元醇、多肽(或者聚酰胺)、或者多糖。

生物聚合物可以是多肽。多肽可以是任意的具有感兴趣的生物活性的多肽。术语“多肽”在本文中并不指特定长度的编码产物和，因此，包括肽、寡肽和蛋白质。多肽进一步包括上述提到的多肽和杂种多肽自然发生的等位和工程化变异。相对于宿主细胞多肽可以天然的或者可以是异源的。多肽可以是胶原或者凝胶，或者其变体或杂种。多肽可以是抗体或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白质、报告分子、转运蛋白、分泌过程涉及的蛋白质、折叠过程涉及的蛋白质、蛋白伴侣、肽氨基酸转运蛋白、糖基化因子、转录因子、合成肽或者寡肽、细胞内蛋白质。细胞内蛋白质可以是酶诸如，蛋白酶、酰基鞘氨醇酶、环氧水解酶、氨肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨肽酶、脂肪酶。多肽可以是细胞外分泌的酶。这样的酶可以属于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、联接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、脱氧核糖核酸酶、葡多糖酶、酯酶的组。乳糖内切酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂合酶、果胶酸酯裂合酶、内切多聚半乳糖醛酸酶、外切多聚半乳糖醛酶、聚鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonases)、阿拉伯糖胶酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯糖基木多糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂解酶、或者淀粉分解酶；水解酶、异构酶、或者连接酶、磷酸酶诸如肌醇六磷酸酶、酯酶诸如脂肪酶、蛋白水解酶、氧化还原酶诸如氧化酶、转移酶、或者异构酶。酶可以是肌醇六磷酸酶。酶可以是氨肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸-蛋白酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环化糊精转糖基酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-萄糖苷酶、β-萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、蛋白脱氨基酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、磷脂酶、多聚酚氧化酶、核糖核酸酶、转谷酰胺酶、或者葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。

在本发明的方法中，多肽也可以是融合或者杂种多肽，在该多肽或其片段的N末端或者C末端融合到另一个多肽。融合多肽通过融合编码多肽的核酸序列(或者其部分)到编码另一个多肽的核酸序列(或者其部分)获得。

生产融合多肽的技术是本领域的已知技术，包括，连接编码多肽的编码序列以便使它们在阅读框内并在同一个启动子和终止子的控制下表达融合多肽。杂种多肽可以包含从至少两个不同多肽中获得的部分或者全部多肽序列的组合，其中，一个或多个多肽相对于宿主细胞可以是异源的。

生物聚合物可以是多糖。多糖可以是任何的多糖，包括但不限于，粘多糖(例如，肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如壳多糖)。一个更优选的选择，多糖是透明质酸。

根据本发明的感兴趣的多核苷酸可以编码初级或者次级代谢产物合成中涉及的酶，诸如有机酸、类胡萝卜素、(β-内酰胺)抗菌素、和维生素。认为这样的代谢物可以是根据本发明的生物学化合物。

术语“代谢物”包括初级和次级代谢物；代谢物可以是任何的代谢物。优选代谢物是柠檬酸、葡糖酸和琥珀酸。

代谢物可以是诸如在生物合成或者代谢途径中的一个或多个基因编码的。初级代谢物是细胞初级或者常规代谢作用的产物，其参与能量代谢、生长和结构形成。次级代谢产物是次级代谢的产物(参见，例如R.B.Herbert，TheBiosynthesis of Secondary Metabolites，Chapman and Hall，New York，1981)。

初级代谢物可以是，但不限于，氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、三酸甘油酯、或者维生素。

次级代谢物可以是，但不限于，生物碱、香豆素、黄酮类化合物、聚酮化合物、奎宁、类固醇、肽、或者萜烯。次级代谢物可以是抗菌素、拒食素、引诱剂、杀细菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂、或者灭鼠剂。优选的抗菌素是头孢菌素和β-内酰胺。

生物学化合物也可以是选择性标记的产物。选择性标记是感兴趣的多核苷酸的产物，所述感兴趣的多核苷酸产物提供杀虫剂或者病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型原养型(prototrophy to auxotrophs)等等。选择性标记包括，但不限于，amdS(乙酸胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸苷核-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸盐腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶anthranilatesynthase)、ble(腐草霉素抗性蛋白质)、和其等效物。

根据本发明，根据本发明方法中的感兴趣的化合物优选如本文描述的多肽。

优选地，根据本发明方法中的多肽是如本文描述的酶。

根据本发明，根据本发明方法中的感兴趣的化合物优选代谢物。

根据本发明的生产方法，利用本领域已知方法在适于生产感兴趣的化合物的营养培养基中培养根据本发明的丝状真菌菌株，所述感兴趣的化合物例如多肽或者代谢物。不受限于本发明培养方法的实例是深层发酵、固态浅盘发酵和液体底物浅盘发酵。例如，可以通过实验室摇瓶培养、小规模或者大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵、或者固态发酵)或者工业发酵罐培养细胞，在适当的营养培养基和在允许编码序列表达和/或分离多肽的条件下培养。利用本领域已知方法，在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的营养培养基从商业供应商或者根据公开出版物(例如在美国微生物保藏中心目录)制备获得。如果分泌多肽或者代谢物到营养培养基中，可以直接从培养基中回收多肽或者代谢物。如果不分泌多肽或者代谢物，可以从细胞裂解物中回收。

利用本领域已知的对多肽特异的方法可以检测多肽。这些检测方法可以包括利用特异性抗体、酶产物形成、或者酶底物消失。

通过本领域已知方法可以回收所获得的感兴趣的化合物例如多肽或者代谢物。例如，通过常规方法可以从营养培养基回收多肽或者代谢物，常规方法包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或者沉淀。

可以通过本领域已知的多种方法纯化多肽，包括但不限于，色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳法(例如，制备等电点聚焦)、差别溶解法(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或者提取。(参见，例如Protein Purification、J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，NewYork，1989)。

优选地，根据本发明方法中的细胞是如本文前面描述的无选择性标记的宿主细胞。

优选地，根据本发明方法中的宿主细胞是如本文前面描述的丝状真菌宿主细胞。

本发明的感兴趣的化合物可以是任何的生物学化合物。生物学化合物可以是任何的生物聚合物或者代谢物。生物学化合物可以是通过由构成生物合成或者代谢途径的单一多核苷酸或者系列多核苷酸编码，或者可以是单一多核苷酸产物或系列多核苷酸产物的直接结果。生物学化合物相对于宿主细胞可以是天然的或者异源的。

术语“异源生物学化合物”在本文定义为相对于细胞不是天然的生物学化合物；或者进行结构修饰的天然生物学化合物以改变天然生物学化合物。

在本文术语“生物聚合物”定义为相同的、相似的或者不同的亚基的链(或者聚合体)。生物聚合物可以是任何的生物聚合物。生物聚合物可以例如是，但不限于，核酸、聚胺、多元醇、多肽(或者聚酰胺)、或者多糖。

生物聚合物可以是多肽。多肽可以是任意的具有感兴趣的生物活性的多肽。术语“多肽”在本文并不指特定长度的编码产物和，因此，包括肽、寡肽和蛋白质。多肽进一步包括上述提到的多肽和杂种多肽自然发生的等位和工程化变异。相对于宿主细胞多肽可以天然的或者可以是异源的。多肽可以是胶原或者凝胶，或者其变体或杂种。多肽可以是抗体或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白质、报告分子、转运蛋白、分泌过程涉及的蛋白质、折叠过程涉及的蛋白质、蛋白伴侣、肽氨基酸转运蛋白、糖基化因子、转录因子、合成肽或者寡肽、细胞内蛋白质。细胞内蛋白质可以是酶诸如，蛋白酶蛋白酶、酰基鞘氨醇酶、环氧水解酶、氨肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨肽酶、脂肪酶。多肽可以是细胞外分泌的酶。这样的酶可以属于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、联接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、脱氧核糖核酸酶、葡多糖酶、酯酶的组。乳糖内切酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂合酶、果胶酸酯裂合酶、内切多聚半乳糖醛酸酶、外切多聚半乳糖醛酶、聚鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonases)、阿拉伯糖胶酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯糖基木多糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂解酶、或者淀粉分解酶；水解酶、异构酶、或者连接酶、磷酸酶诸如肌醇六磷酸酶、酯酶诸如脂肪酶、蛋白水解酶、氧化还原酶诸如氧化酶、转移酶、或者异构酶。酶可以是肌醇六磷酸酶。酶可以是氨肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸-蛋白酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环化糊精转糖基酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-萄糖苷酶、β-萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、蛋白脱氨基酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、磷脂酶、多聚酚氧化酶、核糖核酸酶、转谷酰胺酶、或者葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。

生物聚合物可以是多糖。多糖可以是任何的多糖，包括但不限于，粘多糖(例如，肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如壳多糖)。一个更优选的选择，多糖是透明质酸。

根据本发明的感兴趣的多核苷酸可以编码初级或者次级代谢产物合成中涉及的酶，诸如有机酸、类胡萝卜素、(β-内酰胺)抗菌素、和维生素。认为这样的代谢物可以是根据本发明的生物学化合物。

术语“代谢物”包括初级和次级代谢物；代谢物可以是任何的代谢物。优选代谢物是柠檬酸、葡糖酸和琥珀酸。

代谢物可以是诸如在生物合成或者代谢途径中的一个或多个基因编码的。初级代谢物是细胞初级或者常规代谢作用的产物，其参与能量代谢、生长和结构形成。次级代谢产物是次级代谢的产物(参见，例如R.B.Herbert，TheBiosynthesis of Secondary Metabolites，Chapman and Hall，New York，1981)。

初级代谢物可以是，但不限于，氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、三酸甘油酯、或者维生素。

次级代谢物可以是，但不限于，生物碱、香豆素、黄酮类化合物、聚酮化合物、奎宁、类固醇、肽、或者萜烯。次级代谢物可以是抗菌素、拒食素、引诱剂、杀细菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂、或者灭鼠剂。优选的抗菌素是头孢菌素和β-内酰胺。

生物学化合物也可以是选择性标记的产物。选择性标记是感兴趣的多核苷酸的产物，所述感兴趣的多核苷酸产物提供杀生物剂或者病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养型(prototrophy to auxotrophs)等等。选择性标记包括，但不限于，amdS(乙酸胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸苷核-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸盐腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶anthranilate synthase)、ble(腐草霉素抗性蛋白质)、和其等效物。

根据本发明，根据本发明方法中的感兴趣的化合物优选如本文描述的多肽。

优选地，根据本发明方法中的多肽是如本文描述的酶。

根据本发明，根据本发明方法中的感兴趣的化合物优选代谢物。

本文提供的序列信息不能被有限地解释成要求包含错误识别的碱基。本文公开的具体序列可以准备用于从各自宿主细胞分离完整的基因，其可以容易地依次进行进一步序列分析从而识别测序错误。

除非另有指示，本文由DNA分子测序确定的所有核苷酸序列都是利用自动DNA序列测定仪确定的，并且所有本文确定的DNA分子编码多肽的氨基酸序列是通过翻译如上所确定的核酸序列来预测的。因此，正如本领域已知的对于利用该自动方法确定的任何DNA序列，本文确定的任何核苷酸序列可能包含一些错误。自动确定的核苷酸序列通常与测序的DNA分子的实际核苷酸序列有至少约90％同一性，更通常至少约95％到至少约99.9％同一性。可以通过包括本领域熟知的人工DNA序列测定方法的其他方法更精确的确定实际序列。正如本领域已知的，与实际序列相比，在确定核苷酸序列中的插入或者缺失将在核苷酸序列翻译中引起阅读框改变，因此，由确定核苷酸序列编码的预测的氨基酸序列将与由测序的DNA分子编码的实际氨基酸序列完全不同，在这样插入或者缺失的点开始。

本技术领域技术人员能够识别这样的错误识别的碱基并知道如何校正这样的错误。

此处本发明描述和要求保护的不能受限于本文所附的具体实施方案，因为这些具体实施方案意指作为本发明几个方面的示例。任何等效的实施方案都在本发明的范围内。实际上，除本文显示和描述的内容外，从上文的描述中，本发明的多种改变对于本领域技术人员来说是显而易见的。这样的改变也将落入附加权利要求的范围中。在冲突的情况下，本公开包括定义将作为指导。

本发明将做如下举例说明。

实施例

实施例I

构建具有异宗配合性周期的黑曲霉菌株

根据已知原理设计，按照常规克隆方法构建下列描述和使用的所有基因置换载体。实质上，这些载体包含大约1-2kb各自ORF序列的侧翼区域，以在预先指定的基因组基因座位为同源重组设定靶向。另外，它们包含构巢曲霉双向amdS选择性标记用于转化，在直接重复序列之间。本文所有实例中应用于基因缺失的方法都使用线性DNA，其通过双杂交在侧翼序列的同源基因座位整合入基因组，因此，通过amdS基因置换将被缺失的基因。转化后，通过一次(第二次)同源重组事件，直接重复序列允许除去选择性标记。通过涂布在荧光乙酰胺培养基上可以实现除去amdS标记，导致筛选无标记基因菌株。利用这种转化策略和随后的反选择(在EP0635574中也被称为″MARKER-GENE FREE″方法)，可以在菌株修饰程序中无限使用amdS标记。在图1中描述了用于基因阻断的通用方法。在EP635574B和WO98/46772中已描述了这些缺失载体的通用设计，在WO06/040312中尤其描述了利用常规克隆载体pGBDEL用于构建缺失载体和反选择方法。

菌株

WT1：该黑曲霉菌株用作野生型菌株。该菌株保藏于CBS保藏中心保藏编号为CBS 513.88。

WT2：该黑曲霉菌株是包含编码葡糖淀粉酶(glaA)基因缺失的WT1菌株。WT2是利用如在EP0635574B1中描述的″MARKER-GENE FREE″方法构建的。在该专利中广泛描述了如何在CBS513.88基因组中缺失glaA特定的DNA序列。该方法产生了黑曲霉CBS513.88菌株无标记基因ΔglaA重组体，最后根本不具有外源DNA序列。

为了破坏WT2中编码主要胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因，缺失WT2基因组中pepA特异性DNA序列，如van den Hombergh等人描述的(van denHombergh JP，Sollewijn Gelpke MD，van de Vondervoort PJ，Buxton FP，Visser J.(1997)-Disruption of three acid proteases in Aspergillus niger-effects on proteasespectrum，intracellular proteolysis，and degradation of target proteins-Eur J Biochem.247(2)：605-13)。该方法产生了无标记基因GBA401菌株，具有在WT2菌株本底下的pepA基因失活。

oacA基因在Pel等人(2007 Genome sequencing and analysis of the versatile cellfactory Aspergillus niger CBS 513.88.Nature Biotech 25：221-231)在GBA401中注解为An14g06860，为了缺失oacA基因，利用如先前在WO05/095624中详细描述的方法来产生黑曲霉GBA405(ΔglaA、ΔpepA、ΔoacA)。

amdR基因在Pel等人(2007 Genome sequencing and analysis of the versatilecell factory Aspergillus niger CBS 513.88.Nature Biotech 25：221-231)在GBA405中注解为An14g04000，在GBA 405中编码乙酸胺酶调节子，为了缺失amdR基因，利用如先前在WO05/095624中详细描述的方法来产生黑曲霉GBA 406(ΔglaA、ΔpepA、ΔoacA、ΔamdR)。

塔宾曲霉AN205是C.M.O′Gorman和P.S.Dyer友情提供的。通过利用如表3中描述的引物1和2在含有MAT1-2的塔宾曲霉分离菌AN 205中按如下所述的进行克隆。塔宾曲霉MAT1-2基因座位与如表2所示的曲霉中其他的MAT1-2基因座位类似。

表2：来自不同曲霉属MAT基因座位蛋白质的对比(分别为塔宾曲霉、寄生曲霉、黄曲霉、烟曲霉、费希新萨托菌、构巢曲霉)

表3：用于PCR扩增塔宾曲霉AN205 WT1-MAT1-2的DNA片段的引物

用于PCR片段的引物是如表3中所示的引物对1+2和3+4。将它们克隆入载体pGBDel产生了如图4所述的质粒pGBMAT1-2。利用amdS基因作为选择性标记将该构建体转化入黑曲霉菌株CBS513.88。这样产生了包含MAT1-2基因座位代替MAT1-1基因座位的黑曲霉转化子，命名为WT1-MAT1-2。

有性杂交

利用常规技术进行黑曲霉菌株的有性杂交。其在琼脂平板上进行。使用几个包含合适类型培养基的琼脂平板：如Kwon-Chung K.J和Sugui J.A.2009年(Sexual reproduction in Aspergillus species of medical or economical importance.Trends in Microbiology 17：481-487)中描述的玉米粉琼脂、V-8蔬菜汁琼脂、麦芽提取物琼脂饴糖、alphacell琼脂、燕麦琼脂和泥土浸汁琼脂。也使用如Witteveen等人(1985)中描述的基本培养基(minimal medium)。该培养基补充有0.1％-5％的葡萄糖和1-20g/l的CaCO₃或者Na₂CO₃或者K₂CO₃。在琼脂平板上孵育菌株GBA406和WT1-MAT1-2，两者彼此间隔，在琼脂平板间隔5cm距离，以便进行杂交。盖好平板并置于具有增大的pCO₂的容器中。在黑暗中孵育1至12月后，检查平板的性结构形成。从平板中取出性结构并在无菌水中洗涤。此后，用解剖刀剖开性结构，稀释由此从性结构释放的子囊孢子并接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。对于出现的菌落，20个菌落进行不同于两个亲代菌株的特性检查。利用PCR方法确定它们的基因型。检查如表4所列的重组交配型基因和突变。

在表4中给出了20个重组子的基因型。特性的重组举例表明了生效的有性杂交。

表4：实施例I中杂交的亲代和子代的基因型

从WT1-MAT1-2与GBA406有性杂交的20个分离菌中发现的基因型。

申请人或代理人文件参考编号27596-WO-PCT

国际申请号：

与被保藏的微生物相关的说明

(PCT Rule 13bis)

Form PCT/RO/134(1992年7月)

Claims (32)

1.制备具有性周期丝状真菌菌株的方法，其中对不具有或具有一种类型MAT基因座位的受体丝状真菌菌株进行重组，其中来自与受体丝状真菌菌株相同属的另一个种的一种或者多种交配型基因座位基因和可选的性相关基因被引入受体丝状真菌菌株以产生具有性周期的丝状真菌菌株。

2.根据权利要求1的方法，其中一种或多种交配型基因座位基因和可选的性相关基因源自一种或多种供体丝状真菌。

3.根据权利要求1或者2的方法，其中受体丝状真菌菌株是黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉变种(Aspergillus niger var.awamori)、土曲霉(Aspergillusterreus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、Aspergillus vadensis、巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)、炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)、Aspergilluslacticoffeatus、金黄曲霉(Aspergillus aureus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或者Chrysosporium lucknowense。

4.根据权利要求3的方法，其中受体丝状真菌菌株是黑曲霉(Aspergillusniger)。

5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中受体丝状真菌菌株具有MAT1-1基因座位，并被引入MAT1-2基因座位。

6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中MAT1-2基因座位替代MAT1-1基因座位。

7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中供体丝状真菌菌株是支顶孢属(Acremonium)、青霉属(Penicillium)、泡波曲霉属(Emericella)、木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)或者曲霉属(Aspergillus)，而不是黑曲霉(Aspergillus niger)。

8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中供体丝状真菌菌株是曲霉属(Aspergillus)但不是黑曲霉(Aspergillus niger)。

9.根据权利要求1-8任一项的方法，其中受体丝状真菌菌株是曲霉属(Aspergillus)并且交配型基因座位衍生自属于曲霉属的供体丝状真菌菌株。

10.根据权利要求1至9任一项的方法，其中供体丝状真菌菌株是塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。

11.根据权利要求10的方法，其中供体丝状真菌菌株是塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)AN205。

12.根据权利要求10或者11的方法，其中受体丝状真菌菌株与分离的多核苷酸发生重组，所述多核苷酸包括：

(a)SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列；或者

(b)与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；或者

(c)如(a)、(b)或者(d)之一所定义序列的遗传密码简并的序列；或者

(d)如(a)、(b)或者(c)定义核苷酸序列的反向互补核苷酸序列；或者

(e)编码包含SEQ ID NO：3显示氨基酸序列多肽或者与SEQ ID NO：3序列之一具有至少70％序列同一性多肽的核苷酸序列；或者

(f)编码包含SEQ ID NO：4显示氨基酸序列或者与SEQ ID NO：4序列之一具有至少70％序列同一性多肽的核苷酸序列。

13.根据权利要求1-12任一项的方法，其中性相关基因是交配行为、受精、精子发生或者性别决定涉及的基因。

14.通过权利要求1-13任一项的方法能获得的丝状真菌菌株。

15.根据权利要求14的丝状真菌菌株，其中所述菌株是黑曲霉种(Aspergillus niger)或者米曲霉种(Aspergillus oryzae)。

16.根据权利要求14或者15的丝状真菌菌株，其具有异宗配合的性周期。

17.分离的多核苷酸，包括：

(a)SEQ ID NO：1显示的核苷酸序列；或者

(b)与SEQ ID NO：1的核苷酸序列具有至少70％序列同一性的核苷酸序列；或者

(c)如(a)、(b)或者(d)之一定义序列的遗传密码简并的序列；或者

(d)如(a)、(b)或者(c)定义核苷酸序列的反向互补核苷酸序列。

18.分离的多肽，包括SEQ ID NO：3显示的氨基酸序列或者权利要求16核苷酸序列编码多肽或者其变体多肽的氨基酸序列，所述变体多肽与SEQ IDNO：3序列之一具有至少80％序列同一性。

19.分离的多肽，包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列显示或者权利要求16核苷酸序列编码多肽或者其变体多肽的氨基酸序列，所述变体多肽与SEQ IDNO：4序列之一具有至少80％序列同一性。

20.包含权利要求17多核苷酸的载体。

21.包含权利要求17多核苷酸、权利要求18或者权利要求19多肽和/或权利要求20载体的丝状真菌菌株。

22.生产丝状真菌菌株子代的方法，其中具有两种相反交配型的根据权利要求14-16任一项或者权利要求21的丝状真菌菌株个体进行有性杂交并分离子代。

23.根据权利要求22的方法，其中该方法没有使用标记。

24.根据权利要求23的方法，其中进行有性杂交的两种相反交配型的丝状真菌菌株来自一批菌株，是垂直或者水平谱系。

25.选择具有所需表型丝状真菌菌株的方法，其中在根据权利要求22-24任一项产生的子代文库中进行筛选，并筛选和/或选择具有所需表型的一个或者多个菌株。

26.根据权利要求22-25任一项的方法，其中不同性别的两个菌株彼此保持一定距离涂布在琼脂平板上。

27.根据权利要求26的方法，其中该距离是至少1cm，优选至少3cm，更优选约5cm。

28.通过权利要求22-27任一项方法能获得的具有异宗配合性周期的丝状真菌菌株。

29.通过权利要求22-27任一项方法能获得的丝状真菌菌株，其MAT基因座位被去除和/或被重组到受体真菌物种类型的MAT基因座位。

30.通过权利要求22-27任一项方法能获得的丝状真菌菌株，具有引入的感兴趣的附加基因用于生产感兴趣的产物，诸如酶、蛋白质或者代谢物。

31.制备一种或多种感兴趣的化合物的方法，包括：

a.在有助于产生所述化合物的条件下培养根据权利要求30的丝状真菌菌株；和

b.从培养培养基中回收感兴趣的化合物。

32.根据权利要求31的方法，其中感兴趣的化合物是多肽。

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