CN104278035B

CN104278035B - 一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104278035B
Application number: CN201310286784.4A
Authority: CN
Inventors: 杨振军; 蔡报彬; 李理宇; 范鑫萌; 武芸; 张礼和
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: CN104278035A

Abstract

本发明公开了一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用，属于生物医药领域。本发明通过在合成的凝血酶核酸适配体中掺入化学式I和/或II所示的异胸苷，从而得到一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体，实验证明经过该方法修饰的人体凝血酶核酸适配体，能够更好地与凝血酶识别，结合力更强，且具有更强的抗凝效果，因此，有希望将此异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体制备成一种高效，高选择性，低毒副作用的抗凝血药物。

Description

一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体(aptamer)及其制备方法和应用，特别涉及一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体（TBA）及其制备方法和应用，所获得的产品能够用于疾病治疗特别是能够应用于制备抗凝药物中。本发明属于生物医药领域。

背景技术

抗凝药物是指一类能够抑制血液凝固的药物总称。根据功能可分为以下三类：(1)阻止纤维蛋白形成的药物如：肝素(UFH)、低分子肝素(LMWH)和华法林(warfarin)；(2)促进纤维蛋白溶解的药物如：尿激酶、链激酶、降纤酶、阿替普酶等；(3)抗血小板药物如：阿司匹林、前列环素、双嘧达莫、氯吡格雷、阿那格雷登等。目前所指的抗凝药物主要是指能够阻止纤维蛋白形成的药物。

抗凝药物被广泛用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗，如脑卒中、房颤(AF)、急性冠脉综合征(ACS)、弥散性血管内凝血、肺栓塞(PE)、风心病换瓣术后、外科手术后静脉血栓栓塞症(VTE)、肿瘤、血液透析等。这些疾病均需要应用抗凝药物来防治血栓栓塞形成和/或复发。

以静脉血栓栓塞(VTE)为例，其包括深静脉血栓(DVT)及肺动脉栓塞(PE)。是临床常见病，严重者可危及生命。据统计，美国每年新发深静脉血栓(DVT)病例约200万人，并发肺动脉栓塞(PE)约60万人，其中致死性肺动脉栓塞(PE)20万人，死亡约5万人，占人口总死亡原因的第三位，仅次于肿瘤及心肌梗死，而发展中国家每年约有3-6千万人发生深静脉血栓(DVT)。静脉血栓栓塞(VTE)发生与血流淤滞、血液高凝状态及血管壁损伤有关，主要见于创伤手术和长期制动或高凝的内科患者。静脉血栓栓塞(VTE)致残率与致死率高，并发大面积PE时可立即致命，约1／3患者遗留静脉炎综合征。

目前常用的抗凝剂包括肝素、低分子肝素和华法林。它们预防和治疗血栓栓塞性疾病的效果已被众多的临床试验所证明而广泛用于临床实践。然而，这些药物或多或少具有明显的缺点，如药效学或药动学存在不可预测性，容易导致出血;需要实验室监测以调整剂量(如肝素、华法林);肝素诱导的血小板减少症及骨质疏松症;非胃肠道给药(如肝素、低分子肝素)等等。

肝素是一种硫酸化的糖胺聚糖混合物，分子量为3-15kD。其被广泛应用于防治血栓栓塞性疾病、弥漫性血管内凝血的早期治疗及体外抗凝。通过增加抗凝血酶III(AT-III)与凝血酶的亲和力而发挥抗凝作用，体内外均有强大的抗凝作用，静推后立即起效，半衰期3-4h。普通肝素有其独特的优点：(1)起效快，可完全被鱼精蛋白中和，目前它仍是体外循环抗凝的首选；(2)通过非肾脏途径代谢，肾功能不全相对安全；(3)肝素可钝化IXa、XIa、XIIa因子，进而阻滞内源性凝血激活通路，故理论上，肝素对导管、支架、瓣膜抗凝效果更佳。肝素的缺点也很明显，由于其分子量不均一，与血浆蛋白的结合，及对x因子选择性差，导致其安全性差，抗凝效果不稳定；其次需依赖AT-III而起作用，在AT-III活性不足或缺乏的情况下作用受影响；另外还会导致肝素相关性血小板减少(HIT)、骨质疏松、嗜酸性粒细胞增多等副作用。

低分子肝素是由肝素裂解和纯化后得到的低分子量肝素(相对分子质量2000～10000)组成的混合物。前者和比后者具有更好的药效学和药动学特性。目前绝大多数UFH的适应症可用LMWH取代，一般不需要监测来调整剂量。LMWH的主要不良反应有出血、注射部位淤点和淤斑等，一般不需特殊处理，LMWH减量即可，严重者可用拮抗剂鱼精蛋白中和。此外，LMWH也不能抑制已经与血块结合的凝血酶，仍有引起血小板减少和骨质疏松的危险，胃肠道外给药同样给患者带来不便。

华法林是过去惟一的口服抗凝剂，目前仍是静脉血栓栓塞症(VET)一级和二级预防的标准治疗药物。华法林为香豆类口服抗凝剂，通过干扰肝脏合成依赖于维生素K的凝血因子(II，VII，IX，X)从而抑制血液凝固。华法林主要不良反应是出血，如皮肤出血、鼻衄、牙龈出血、胃肠道出血等，重者可有脑出血。需监测以调整剂量，一般INR(InternationalNormalized Ratio)2～3为宜，治疗窗口狭窄。起效慢，用药后20～30h显效，3～5天后达到最大抗凝效果。消除也慢，停药后抗凝作用可持续4～5天。华法林抗凝作用受食物因素影响，与其他药物有相互作用。

在以上三中主要的抗凝药物中，低分子肝素是常见的治疗试剂，其活性高，特异性强。但由于其是一种大分子混合物，质量不易控制，由此导致其副作用也难以克服。能否开发一种质量可控，特异性强的大分子化合物用作抗凝剂成为一种新的药物研发思路。1992年R.F.Macaya,通过体外的SELLEX技术筛选得到的一个15个碱基长度的DNA单链，它能够特异性地与凝血酶结合抑制凝血酶的活性，因此被命名为凝血酶核酸适配体(thrombinbinding aptamer,TBA)。与传统的小分子药物相比，TBA的特异性性更好，选择性更强。与蛋白药物分子相比，除继承了大分子药物的高特异性外，核酸药物分子的分子量相对蛋白药物分子来说小得多。因此可以通过人工合成的办法合成核酸小分子药物，这样既可以保持其高特异性又可以通过严格的质量控制，控制产品质量，降低副反应发生的概率。核酸分子作为一种新兴的药物分子具有广泛的应用前景。

核酸分子TBA能够高选择性高特异性地与凝血酶结合抑制凝血酶的活性。此外核酸是人体内自身产生的大分子物质，对人体毒副作用小，并可在人体内降解生产核苷核，而核苷酸又可以被人体重复吸收利用合成人体需要的DNA或者RNA。因此将TBA开发成一种新型的高选择性无副作用的药物分子具有远大的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体及其制备方法和应用，本发明通过改变凝血酶进核酸适配体与靶标结合部分碱基的空间构象来增强与靶标的相互作用，从而达到提高核酸适配体与靶标作用的特异性及生物活性目的。

具体的，本发明通过在合成的凝血酶核酸适配体中掺入化学式I和/或II所示的异胸苷，从而得到一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体，实验证明经过该方法修饰的人体凝血酶核酸适配体，能够更好地与凝血酶识别，结合力更强，且具有更强的抗凝效果，因此，有希望将此异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体制备成一种高效，高选择性，低毒副作用的抗凝血药物。

本发明的一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体（TBA），其特征在于是通过在凝血酶核酸适配体正义链的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联得到的；

其中，修饰前的凝血酶核酸适配体正义链的序列为：5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’。

以上所述3位是指TBA正义链:5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’所示核苷酸序列中5’端开始第三个核苷酸，即“T”，其余位置以此类推。

相比于天然核苷化合物，异胸苷的碱基由糖环的1’-位移至糖环的2’-位，化学式I所示的异胸苷为L-构型的异胸苷，化学式II所示的异胸苷为D-构型的异胸苷。

在本发明中，更优选的，是通过在凝血酶核酸适配体正义链的3位、9位、12位掺入式I所示的异胸苷或在凝血酶核酸适配体正义链的7位掺入式II所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的，最优选的是通过在凝血酶核酸适配体正义链的12位掺入化学式I所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的。

其中在12位掺入化学式I所示的异胸苷代替天然核苷得到的核酸适配体TBA-12L具有最优的生物学活性。

进一步的，本发明该提供了一种制备本发明所述的异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体的方法，其特征在于在凝血酶核酸适配体正义链的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联；

其中，修饰前的凝血酶核酸适配体正义链的序列为：5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’（SEQ ID NO.1所示）。

在本发明所述的化学修饰方法中，优选的，在对核酸适配体进行化学修饰前，将化学式I和/或化学式II所示的异胸苷化合物分别制备成化学式III和/或化学式IV所示的异胸苷亚磷酰胺单体，所述的异胸苷亚磷酰胺单体及其合成方法可参见文献(HW Yu,LRZhang,JC Zhuo,LT Ma,LH Zhang,Bioorg.Med.Chem.,1996,40,609–614)。

在发明的具体实施例中，使用固相合成，采用亚磷酰胺法，在DNA合成仪上，将一个或几个化学式III和/或化学式IV所述的异胸苷亚磷酰胺单体代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联以掺入到所合成的序列中，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：脱DMT、偶联、封闭、氧化。

每个修饰位点均采用D/L两种不同构型的异胸苷进行修饰，由于D/L构型异胸苷与天然核苷相比具有如下特点：a)碱基从糖环的1’位移到2’位；b)L构型异胸苷的糖环发生翻转，构象变化相比D构型核苷较大。导致采用D/L异胸苷修饰的核酸适配体与天然的核酸适配体相比构象会发生一定的变化。当这种修饰位点处于与靶标结合的区域时，则会起到调节与靶标结合的作用。最终达到提高与靶标的结合力，增强生物活性的目的。

由于异胸苷常规条件下的偶联收率较低，需增加异胸苷亚磷酰胺单体的进样次数和每次进样后的偶联时间以保证合成的收率。在用天然核苷亚磷酰胺单体进行偶联时，每个循环总偶联时间为9分钟，180秒/次，偶联3次；在用异胸苷亚磷酰胺单体进行偶联时，每次进样后的偶联时间增加至300秒/次，偶联3次，每个循环总偶联时间增加至15分钟。

在发明所述的方法中，优选的是在凝血酶核酸适配体正义链的3位、9位、12位掺入式I所示的异胸苷或在凝血酶核酸适配体正义链的7位掺入式II所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联，更优选的是在凝血酶核酸适配体正义链的12位掺入化学式I所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联。

研究证明，本发明提供的异胸苷修饰的TBA，具有理化性质稳定、合成效率高等特点；产物自身具有比天然TBA更好的生物活性。

将异胸苷掺入到TBA中的活性结果应用到人脑血栓及高血压的治疗中，蛋白水平及体外的活性测试结果表明，在TBA正义链的3位（TBA-3L）、9位（TBA-9L）、12位（TBA-12L）掺入式I所示的异胸苷或在TBA正义链7位（TBA-7D）掺入式II所示的异胸苷，代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联的TBA能够显著提高其与凝血酶的结合力及其抗凝血活性。

因此，更进一步的，本发明还提出了所述的异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体在制备抗凝药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1.本发明提供的异胸苷修饰的TBA，具有理化性质稳定、合成效率高等特点；产物自身具有比天然TBA更好的生物活性。

2.通过全面的考察D-，L-异胸苷在不同位点掺入TBA，改善了TBA的血清稳定性增强了TBA与凝血酶的结合力、提高了TBA的体外抗凝活性。为异胸苷修饰的TBA的临床应用提供了一定的指导意义。

3.本发明提供的异胸苷化合物能够显著地提高经过其修饰的TBA的酶稳定性，与靶标的结合力。通过体外实验与人体血浆进行作用发现经过异胸苷修饰的TBA能够显示提高其抗凝效果，这为异胸苷修饰的TBA在以后的临床应用提供了进一步的理论支持。同时发现TBA的3位、9位、12掺入式I所示的异胸苷亚磷酰胺单体或在7位掺入式II所示的异胸苷亚磷酰胺单体，代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联的TBA能够显著提高TBA与凝血酶的结合力及其抗凝血活性。其中在TBA的12位掺入式I所示的异胸苷亚磷酰胺单体代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联得到的TBA具有最佳的体外活性。

附图说明

图1为凝血酶核酸适配体作用机理；

图2为不同位点异胸苷修饰的TBA的蛋白水平活性结果；

图3为不同位点异胸苷修饰的TBA的体外抗凝血活性结果；

图4为不同位点异胸苷修饰的TBA的CD光谱测定结果；

图5为不同位点异胸苷修饰的TBA的血清稳定性结果；

图6为在TBA的12位点采用D/L异胸苷修饰的计算机模拟结果。

文公开的本发明使用下列化学命名：

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

异胸苷亚磷酰胺单体掺入TBA序列的固相合成

寡核苷酸的固相合成是从其3’端起始，逐个偶联核苷单体。带有5’-DMTr保护的脱氧核苷，其3’-位与可控玻璃珠(control pore glass,CPG)通过琥珀酸桥连接，得到相应的A,T,C,G合成柱，用于寡核苷酸合成的固相载体。通常附载在CPG上的核苷单体也就是寡核苷酸链3’-末端核苷。TBA单链的特征为3’末端为dG碱基，因此在TBA的合成中使用末端为dG碱基的CPG载体。

寡核苷酸链的固相合成是按照设定好的程序进行的，一般每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：1.三氯乙酸溶液脱除5’-DMTr保护；2.核苷偶联反应,由5-乙巯基-1H-四唑催化以提高反应效率，亚磷酰化单体通常分次进样以提高偶联收率；3.盖帽(capping)反应,用乙酰基封闭未反应的5’-OH，防止短链的形成；4.氧化反应，一般用碘的Py-H₂O-THF溶液快速的将三价磷氧化成五价磷。当5’-末端核苷偶联完成以后，可以选择脱除或保留该核苷上的DMTr保护基，以DMT-On方式进行合成，下一步寡核苷酸链的分离纯化的方法采用阴离子交换柱以及C18反相柱进行寡核苷酸的分离。

异胸苷修饰的DNA寡核苷酸链的固相合成，只需用异胸苷亚磷酰化单体代替天然核苷的亚磷酰化单体在相应的位置进样偶联，但由于异胸苷常规条件下的偶联收率偏低，采用增加异胸苷亚磷酰化单体的进样次数(3次)和每次进样后的偶联时间(300秒/次)以保证整个寡核苷酸链合成的收率。

在合成未经修饰的单链凝血酶核酸适配体核苷酸序列时，每个循环总偶联时间为9分钟(180秒/次x3次)，当用异胸苷单体偶联时，每个循环总偶联时间增加至15分钟(300秒/次x3次)。

根据本发明，合成的天然适配体核苷酸序列及异胸苷修饰的适配体核苷酸序列可以是但不限于针对人的凝血酶。

根据本发明，固相合成的树脂为CPG树脂，也可以是本领域内其它已知的应用于寡核苷酸的合成的树脂。

根据本发明，寡核苷酸固相合成循环包括脱保护，偶联，封闭及氧化4个步骤，使用的有机试剂可以是但不限于二氯乙酸，5-乙巯基1-H四唑，乙酸酐吡啶溶液及单质碘的四氢呋喃溶液，合成仪上使用的有机溶剂为分析纯的无水乙腈溶液及分析纯的无水二氯甲烷。

根据本发明，寡核苷酸从固相上的切割条件可以为但不限甲胺醇溶液或氨水/甲胺水溶液在60℃下在摇床上进行切割，切割时间为60min。

根据本发明，寡核苷酸的色谱柱分离可以是但不限于Dionex-DNAPac-PA200阴离子交换柱洗脱离子可以是但不限于高氯酸根离子及X-bridge OST C18柱，洗脱条件可以是但不限于乙腈和三乙胺碳酸盐。

根据本发明，分离后的寡核苷酸的脱盐处理可以是但不限于使用GE-HiTrap的体积排阻色谱进行分离。

为了更好地理解本发明，通过实施例进行说明。

实施例1.异胸苷掺入的DNA的固相合成

DNA的合成采用Appllied Biosystems model394DNA固相合成仪。正常的脱氧核苷亚磷酰化单体(dT,dG^Ac)从上海吉玛制药技术有限公司购买，CPG(CPG-dG)，CAP-A和CAP-B，氧化I₂液，Cl₃CCOOH从北京奥科生物科技公司购买。5-乙巯基1H-四氮唑溶液从中国医药研究开发中心有限公司(北京)购买。

按照文献(HW Yu,LR Zhang,JC Zhuo,LT Ma,LH Zhang,Bioorg.Med.Chem.,1996,40,609–614)的方法，将化学式I和/或化学式II所示的异胸苷化合物分别制备成化学式III和/或化学式IV所示的异胸苷亚磷酰胺单体。

合成规模：～1.0μmol

核苷亚磷酰化单体溶液的配制:氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.l2M溶液。

1H-四氮唑溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.5M溶液

异胸苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量{5S-[3-O-(4,4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N,N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(胸腺嘧啶基-1-yl)}-四氢呋喃(172mg,0.231mmol)，加入无水乙腈(2.5ml)，配成0.092M溶液；氩气保护下称量{5S-[3-O-(4,4’-二甲氧基三苯基甲基)-甲基]-4R-O-[(2-氰乙基-N,N’-二异丙基)-亚磷酰胺基]-3S-(N6-苯甲酰基-鸟嘌呤基-9’-yl)}-四氢呋喃(112mg,0.130mmol)，加入无水乙腈(1.5ml)，配成0.087M溶液；

采用固相合成的方法合成了TBA的未修饰的序列及异胸苷掺入的TBA序列；修饰前的TBA序列为：

5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’

在以上所述的人的凝血酶核酸适配体(TBA)的3位、4位、7位、9位、12位或13位其中一位或者多位上掺入化学式I或化学式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联。

以上所述3位是指TBA正义链:5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’核苷酸序列中5’端开始第三个核苷酸，即“T”。其余位置以此类推。

合成步骤：每次称量约33mg CPG-dG装入合成柱中，设定合成程序(标准程序)，每个合成共84步。正常核苷单体偶联3次，每次180秒，异胸苷单体偶联3次，每次300秒，共计偶联时间15分钟。

DNA的切割、脱保护：合成结束后，取下CPG，加入浓氨水/甲胺水溶液，恒温60°C,摇床振荡反应60分钟，将寡核苷酸从CPG上切割下来并脱除部分保护基，离心干燥。然后加入适量纯净水溶解，于1万4千转/分钟的离心机上离心十分钟，将上清取出，离心干燥，将产物放置-80℃下保存。

DNA的分离纯化：混合物以DEPC水溶解，HPLC(Sephedax G-25，50%CH₃CN in H₂O)脱盐，离心干燥。而后HPLC方式纯化，采用Dionex-DNAPac-PA200阴离子交换柱梯度洗脱，0-40min，10%A液-30%A液(B液：0.02Mtris-HClO₄缓冲液，pH=8.0，含有10%MeCN；A液：0.4MNaClO₄in B液)，流速1.2ml/min。冷冻干燥所得产物，DEPC水复溶，HPLC(Sephedax G-25)脱盐，冷冻干燥，得到目标单链DNA，-78°C保存。

实施例2.异胸苷修饰的TBA蛋白水平活性测试

TBA-3L：在TBA正义链的3位掺入式I所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-3D：在TBA正义链的3位掺入式II所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-4L：在TBA正义链的4位掺入式I所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-4D：在TBA正义链的4位掺入式II所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-7L：在TBA正义链的7位掺入式I所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-7D：在TBA正义链的7位掺入式II所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-9L：在TBA正义链的9位掺入式I所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-9D：在TBA正义链的9位掺入式II所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-12L：在TBA正义链的12位掺入式I所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-12D：在TBA正义链的12位掺入式II所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-13L：在TBA正义链的13位掺入式I所示的异胸苷代替天然异胸苷

TBA-13D：在TBA正义链的13位掺入式II所示的异胸苷代替天然异胸苷

修饰前的TBA正义链的序列为：

5’-GGT TGG TGT GGT TGG-3’

异胸苷修饰的TBA酶水平的活性测试是通过SPR实验来测定天然的及经过D/L异胸苷修饰的TBA与凝血酶的相互作用结合情况。由于TBA是通过与凝血酶相互结合，才能抑制凝血酶的活性，最终才能实现抗凝血的目的，因此与凝血酶结合能力的强弱直接影响到TBA的生物活性。通过SPR实验结果(见图2)可以发现TBA-3L，TBA-7D，TBA-9L，TBA-12L与蛋白的结合能力明显提高。在蛋白水平上表现出了较强的生物活性。

实施例3.异胸苷修饰的TBA体外抗凝活性测试

异胸苷修饰的TBA体外抗凝活性是通过PUN-2048B双通道凝血仪(北京普朗医疗科技有限公司)测定。参考相关文献实验的要求，选取凝血酶核酸适配体的浓度为0.33μM。其结果见图3。通过实验可以发现TBA-3L，TBA-7D，TBA-9L，TBA-12L与人血浆作用后，其抗凝效果明显得到提高，这与之前的酶水平的相关实验结果一致，验证了实验结果的可靠性。在相同的实验浓度下TBA-12L的抗凝时间大约是天然TBA的两倍，其能够极大地抑制凝血酶的活性。体外实验表明TBA-12L是一种很有前景的新型高特异性抗凝剂，通过进一步的开发利用可以将其开发成一种治疗试剂，用于治疗与心血管相关的疾病。

实施例4不同位点异胸苷修饰的TBA的CD光谱测定结果

结果如图4所示，A图为TBA-3L/D以及TBA-4L/D的CD光谱测定结果，B图为TBA-7L/D以及TBA-9L/D的CD光谱测定结果，C图为TBA-12L/D以及TBA-13L/D的CD光谱测定结果。

实施例5不同位点异胸苷修饰的TBA的血清稳定性结果

图5所示为天然TBA及TBA的7位及9位采用D/L异胸苷修饰后的血清稳定性结果，从该结果可以看出TBA的9位掺入式I所示的异胸苷亚磷酰胺单体或在7位掺入式II所示的异胸苷亚磷酰胺单体，代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联的TBA能够显著提高TBA的血清稳定性。

实施例6在TBA的12位点采用D/L异胸苷修饰（TBA-12D/L）的计算机模拟结果

结果如图6所示。

本文显示并详细描述的信息足以实现本发明的上述目的，因此本发明的优选实施方案代表本发明的主题，该主题为本发明所广泛涵盖。本发明的范围完全涵盖其它对本领域技术人员来说显而易见的实施方案，因此，本发明的范围不被除所附权利要求之外的任何内容所限制，其中除了明确说明外，所用元素的单数形式并不是指“一个和唯一”，而是指“一个或更多”。对本领域一般技术人员来说，所有公知的上述优选的实施方案和附加实施方案部分的结构、组成和功能上的等价物因此引入本文作参考，而且试图被本发明的权利要求所涵盖。

此外，不需要某种设备或方法来表达本发明所解决的每个问题，因为它们都已包括在本发明的权利要求之内。另外，无论本发明公开事实中的所有部分、成分，或者方法步骤是否在权利要求中被明确叙述，它们都没有贡献给公众。但是，对本领域普通技术人员来说，很明显在不背离如所附权利要求中所阐明的本发明的实质和范围的前提下，可以在形式、试剂和合成细节上做出各种改变和修饰。

Claims

1.一种异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体(TBA)，其特征在于是通过在凝血酶核酸适配体正义链的3位、9位、12位掺入式I所示的异胸苷或在凝血酶核酸适配体正义链的7位掺入式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的；

2.根据权利要求1所述的异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体，其特征在于是通过在凝血酶核酸适配体正义链的12位掺入化学式I所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联而得到的。

3.一种制备权利要求1或2所述的异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体的方法，其特征在于在凝血酶核酸适配体正义链的3位、9位、12位掺入式I所示的异胸苷或在凝血酶核酸适配体正义链的7位掺入式II所示的异胸苷，代替天然核苷在相应位置进行偶联；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在对凝血酶核酸适配体进行化学修饰前，将化学式I和/或II所示的异胸苷分别制备成化学式III和/或化学式IV所示的异胸苷亚磷酰胺单体：

5.根据权利要求4所述的方法，使用固相合成技术，采用亚磷酰胺法，在DNA合成仪上，将一个或几个权利要求4所述的异胸苷亚磷酰胺单体代替天然核苷亚磷酰胺单体在相应位置进行偶联以掺入到所合成的凝血酶核酸适配体正义链序列中，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：脱DMT、偶联、封闭、氧化。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于在用天然核苷亚磷酰胺单体进行偶联时，每个循环总偶联时间为9分钟，180秒/次，偶联3次；在用异胸苷亚磷酰胺单体进行偶联时，每次进样后的偶联时间增加至300秒/次，偶联3次，每个循环总偶联时间增加至15分钟。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于在凝血酶核酸适配体正义链的12位掺入化学式I所示的异胸苷代替天然核苷在相应位置进行偶联。

8.权利要求1或2所述的异胸苷修饰的凝血酶核酸适配体在制备抗凝药物中的应用。