CN113373155B - 一种g-四链核酸适配体的综合化学修饰方法、产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用 - Google Patents

一种g-四链核酸适配体的综合化学修饰方法、产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种G‑四链核酸适配体的综合化学修饰方法、产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用。该方法包括对G‑四链核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置的核苷酸替换、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载中的两种以上修饰方法的联合使用。同时，本发明提供了由该修饰方法得到的产品及其在制备抗肿瘤药物，特别是抗多药耐药肿瘤药物、肿瘤检测试剂或作为细胞内分子调控工具中的应用。此修饰方法可广泛应用于各类G‑四链核酸适配体中，为其作为药物、检测试剂及细胞内分子调控工具的开发提供新的技术手段。

Description

一种G-四链核酸适配体的综合化学修饰方法、产品及其在抗 多药耐药肿瘤细胞中的应用
技术领域
本发明涉及一种G-四链核酸适配体的综合化学修饰方法，其中包括对核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置核苷酸替换(A、G、C、T/U)、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载中的两种以上修饰方法的联合使用。同时，本发明还提供了由上述方法获得的产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用。本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
核酸适配体(aptamer)多为长度15-80个核苷酸的单链DNA或RNA序列，自身可折叠形成稳定的三维结构，进而特异性地通过静电相互作用、氢键、范德华力、碱基堆叠作用等实现与靶标分子(包括金属离子、有机小分子化合物、核酸、蛋白质等)的诱导契合，被誉为化学“抗体”。
核酸适配体功能的发挥主要依赖于稳定的三维结构，其经典的三维结构包括茎环结构(stem loops)、内环结构(internal loops)、发卡结构(hairpin)、G-四链体结构(G-quadruplex)、假结结构(pseudoknots)及kissing复合体(kissing complexes)等。其中，G-四链体结构特征为：四个鸟嘌呤碱基通过N1、N7、O6、N2原子间产生的Hoogsteen氢键作用而两两连接形成环状平面，此平面称为G-四分体(G-tetrad)，G-四分体是G-四链体的基本结构单元，两个或多个G-四分体以π-π堆叠的形式构成G-四链体。由于生物体内丰富的内源性G-四链体承担着多种重要的生物学功能，因而可形成G-四链体结构的核酸适配体，作为外源性G-四链体分子工具，或通过与某些内源性G-四链体竞争性或非竞争性结合靶标而达到特定的调控效果，或利用其对靶标的高特异性识别能力而成为非常灵敏的检测手段，在疾病的治疗、诊断及细胞内分子调控工具的开发方面具有十分广阔的应用前景。
部分在研究中的G-四链适配体已表现出一定的抗肿瘤活性，但其对多药耐药肿瘤的作用效果还未得到广泛证实，而多药耐药的产生是导致肿瘤化疗失败进而导致患者死亡的主要原因，约半数以上的肿瘤细胞在治疗过程中产生抗药性，导致患者生存期降低并承受大剂量化疗药物产生的副反应。因而将G-四链适配体运用到多药耐药肿瘤治疗中具有重大意义。将G-四链核酸适配体开发为可在生物体内高效发挥抗多药耐药肿瘤作用的理想药物，应满足以下要求：(1)在体内高度稳定，能抵抗各种核酸酶的降解；(2)可高效跨膜入胞，到达靶标所在区域；(3)对靶标具有高度的特异性和亲和性。因此，合理的SELEX后化学修饰、序列改造及包载递送策略对其开发具有十分重要的意义。目前常用于G-四链核酸适配体的化学修饰手段包括糖环修饰、碱基修饰、磷酸骨架修饰、末端修饰等，并且也有各种序列改造方法被开发出来；另一方面，阳离子聚合物及中性核苷脂材经验证均可用于G-四链核酸适配体的包载递送。然而，单一的优化方法往往不足以彻底解决G-四链核酸适配体在生物体内应用所面对的难题，因此，结合数种优化方法的综合修饰方法更具应用前景。
发明内容
为了克服G-四链核酸适配体在生物体内应用中的诸多不足，本发明提供了一种G-四链核酸适配体综合综合化学修饰方法，包括对核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置核苷酸替换(A、G、C、T/U)、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载中的两种以上修饰方法的联合使用。同时，将该修饰方法应用于具有抗肿瘤效果的G-四链适配体TBA、AS1411，所获得的产品对多药耐药肿瘤具有显著的抑制效果，在多药耐药肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。此修饰方法可广泛应用于各类G-四链核酸适配体中，为其作为药物、检测试剂及细胞内分子调控工具的开发提供新思路。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种G-四链核酸适配体的综合化学修饰方法，其包括对G-四链核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置的核苷酸替换、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载中的两种以上修饰方法的联合使用。
其中，优选的，对G-四链核酸适配体序列的截短或拓展以及loop区不同位置的核苷酸替换，是基于两条或多条可形成G-四链体结构的核酸适配体之间的结构相似性及功能相似性而进行的，例如，AS1411及TBA均具有抗肿瘤活性，AS1411活性更优，且如图15所示，二者结构相似，TBA相当于loop区少一个核苷酸的截短的AS1411，基于此可设计出loop区拓展的TBA类似物，即，在TBA骨架的基础上，参考AS1411 loop区较TBAloop区多出的“T”核苷酸位置及其对称位置，进行核苷酸的加入及随机替换，以期获得抗肿瘤活性更高的、结构相对简单的G-四链核酸适配体。
其中，优选的，对序列进行磷酸骨架硫代修饰，是指对G-四链核酸适配体序列的磷酸骨架进行至少1个位点的如下式所示的硫代修饰：
Figure BDA0003129105510000031
其中，DNAaptamer中的Base为腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C或胸腺嘧啶T；RNAaptamer中的Base为腺嘌呤A、鸟嘌呤G、胞嘧啶C或尿嘧啶U。
其中，优选的，所述的中性核苷脂材为DXBAs系列载体，包括DNTA、DOTA、DNCA、DOCA，结构如下式所示：
Figure BDA0003129105510000032
其中，优选的，所述的综合化学修饰方法还包括与其它化学修饰手段中至少1种的共同使用，所述的其它化学修饰手段包括但不限于2'-氟代(2'-F)修饰、2'-甲氧基(2'-OMe)修饰、锁核酸(LNA)修饰、2'-脱氧肌苷(2'-dI)修饰及序列末端缀合。
其中，优选的，所述的综合修饰方法还包括与其它包载递送材料或辅助包载递送材料中至少1种的共同使用，所述的其它包载递送材料或辅助包载递送材料包括但不限于cRGD、DSPE-PEG、各种阳离子脂材、各种阴离子脂材。
按照以上任一项所述的综合化学修饰方法得到的产品也在本发明的保护范围之内。
其中，优选的，所述的产品为按照以上任一项所述的综合化学修饰方法得到的修饰后的人凝血酶的核酸适配体TBA或其制剂，选自以下任意一种：
(1)对人凝血酶的核酸适配体TBA序列进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰，并利用中性胞苷脂材DNCA作为包载载体，从而得到的TBA硫代修饰序列制剂，其中，人凝血酶的核酸适配体TBA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；优选的，对人凝血酶的核酸适配体TBA序列的第5、7、10位点碱基的磷酸骨架进行硫代修饰，得到TBA的三位点硫代修饰序列TBA-5/7/10S；
(2)基于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411之间的结构相似性及抗肿瘤功能相似性，结合序列截短或拓展和loop区不同位置核苷酸替换的手段，得到ZY序列，并利用中性胞苷脂材DNCA对ZY序列进行包载得到的ZY序列制剂，其中，TBA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，AS1411的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，ZY的核苷酸序列如SEQ ID No.3-9所示；优选的，ZY的核苷酸序列如SEQ ID No.7或8所示；
(3)基于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411之间的结构相似性及抗肿瘤功能相似性，利用序列截短或拓展和loop区不同位置核苷酸替换的手段获得ZY序列，并对ZY序列进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰而得到的ZY硫代修饰序列，其中，TBA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，AS1411的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，ZY的核苷酸序列如SEQ ID No.3-9所示；优选的，ZY的核苷酸序列如SEQ ID No.7或8所示；
(4)基于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411之间的结构相似性及抗肿瘤功能相似性，利用序列截短或拓展和loop区不同位置核苷酸替换的手段获得ZY序列，并对ZY序列进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰而得到的ZY硫代修饰序列，然后将得到的ZY硫代修饰序列进一步利用中性胞苷脂材DNCA包载而得到的ZY硫代修饰序列制剂，其中，TBA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，AS1411的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，ZY的核苷酸序列如SEQ ID No.3-9任一所示；优选的，ZY的核苷酸序列如SEQ ID No.7或8所示。
其中，优选的，所述的产品为按照以上任一项所述的综合化学修饰方法得到的人核仁素的核酸适配体AS1411硫代修饰制剂，通过以下方法制备得到：对人核仁素的核酸适配体AS1411的序列进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰，并利用中性胞苷脂材DNCA作为包载载体，从而得到的AS1411硫代修饰制剂，其中AS1411的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其中，优选的，对人核仁素的核酸适配体AS1411的序列的第1、3、24位点碱基的磷酸骨架进行硫代修饰得到AS1411的三硫代序列AS1411-1/3/24S，或对人核仁素的核酸适配体AS1411的序列的第1、13-16位点碱基的磷酸骨架进行硫代修饰得到五硫代序列AS1411-1/13-16S。
更进一步的，本发明还提出了所述的产品在制备抗肿瘤药物、肿瘤检测试剂或作为细胞内分子调控工具中的应用，优选的，所述的抗肿瘤药物为抗多药耐药肿瘤药物。
在本发明的具体实施例中，是将综合修饰方法应用于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411而得到的G-四链核酸适配体优化序列及制剂，TBA序列如SEQ ID No.1所示，AS1411序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明的具体实施例中，对TBA进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰，并利用中性胞苷脂材DNCA作为包载载体，从而得到TBA硫代修饰序列制剂。抗肿瘤活性实验中，对于MCF-7/ADR细胞，三位点硫代修饰序列TBA-5/7/10S制剂活性最佳，抑制率达到64％，说明这三个磷酸骨架所在的平面可能在其与效应蛋白的结合过程中发挥了更重要的作用，而对于MCF-7细胞，所有序列制剂均未显示出抑制效果，提示所评价制剂对耐药细胞株MCF-7/ADR具有一定的选择性增殖抑制作用。对于K562/ADR细胞和K562细胞，所有TBA硫代修饰序列制剂的抑制水平均在30-40％之间，活性与TBA制剂相比，变化不大，也没有显示出明显的细胞选择性。
在本发明的具体实施例中，对人核仁素的核酸适配体AS1411进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰，并利用中性胞苷脂材DNCA作为包载载体，从而得到AS1411硫代修饰序列制剂。抗肿瘤活性实验中，对于MCF-7/ADR细胞，5′端和靠近loop区修饰后的序列制剂具有更好的抗肿瘤活性，抑制率约为67％，比AS1411制剂提高约15％，说明5′端和loop区在序列与效应蛋白结合过程中发挥了更加重要的作用，而对于MCF-7细胞，所有序列制剂均未显示出抑制效果，提示所评价制剂对耐药细胞株MCF-7/ADR具有一定的选择性增殖抑制作用。对于K562/ADR细胞及K562细胞，绝大部分AS1411硫代修饰序列制剂的抑制率介于30％-50％之间，活性与AS1411制剂相比没有明显提高，并且未显示出明显的细胞选择性。
在本发明的具体实施例中，得到了3条抗肿瘤活性较高的硫代修饰序列，即AS1411的三硫代序列AS1411-1/3/24S、五硫代序列AS1411-1/13-16S和TBA的三硫代序列TBA-5/7/10S，在DNCA包载下，它们可高效发挥抗肿瘤作用，与未修饰序列相比有显著提升。同时，这些硫代位点的信息提示了其与效应蛋白结合时的关键位点，对后续实施其他类型修饰策略具有一定的指导作用。
在本发明的具体实施例中，基于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411之间的结构相似性及抗肿瘤功能相似性，结合序列截短/拓展和loop区不同位置核苷酸替换(A、G、C、T)的手段，得到如SEQ ID No.3-9所示的ZY序列，并利用中性胞苷脂材DNCA对ZY序列进行包载得到ZY序列制剂。选取ZY序列中的ZY16、ZY16′系列共7条序列进行重点考察：CD光谱实验中，7条改造序列均保持了与TBA相似的总体构象，但是290nm的特征吸收峰均有一定程度降低；抗肿瘤活性实验中，7条序列制剂均未显著影响A549细胞的活力，对A549/DDP细胞具有较弱的生长抑制，而对A549/TXL细胞生长抑制作用十分显著，其中序列ZY16和ZY16A对A549/TXL细胞的抑制作用最强，抑制率达到70％左右。进一步对ZY16进行了动物水平评价，结果表明，相同给药浓度下，与裸给的TBA相比，DNCA包载下的TBA和ZY16均有显著的更强的抗肿瘤药效，对比相对瘤体积发现，DNCA包载下，ZY16的抗肿瘤药效优于TBA，此外，由小鼠体重情况可知各组药物均未在小鼠模型中表现出明显毒性，安全性良好。
在本发明的具体实施例中，对如SEQ ID No.3-9所示的ZY序列进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰得到ZY硫代修饰序列，并利用中性胞苷脂材DNCA对ZY硫代修饰序列进行包载得到ZY硫代修饰序列制剂。考察DNCA包载下，TBA、ZY16、ZY16A、TBA-5/7/10S、ZY16-5/7/11S、ZY16-5/8/11S、ZY16-5/9/11S、ZY16A-5/7/11S、ZY16A-5/8/11S、ZY16A-5/9/11S在A549、A549/TXL细胞中的抗肿瘤活性，结果显示，所有序列制剂均表现出对耐药肿瘤具有更强的增殖抑制作用，其中非常有意义的是，在此实验中发现，TBA-5/7/10S及ZY16-5/8/11S不仅非常有效地抑制了耐药细胞A549/TXL的生长，同时还对非耐药细胞A549具有显著的生长抑制作用。进一步，考察DNCA包载下，TBA-5/7/10S、ZY16-5/8/11S、AS1411-1/3/24S、AS1411-1/13-16S在多种肿瘤细胞中的抗肿瘤活性，结果显示，此4条序列制剂在A549、A549/TXL、A375、Hela细胞中均表现出显著的抗肿瘤活性，而对HepG2、MCF-7细胞则没有明显活性，说明它们的抗肿瘤选择性不仅体现在耐药和非耐药细胞中，也体现在不同种类的肿瘤细胞之间。
最后，更进一步的，本发明提出了所述的G-四链核酸适配体优化序列及制剂在制备抗肿瘤药物、肿瘤检测试剂或作为细胞内分子调控工具的应用，结合实验结果及当今临床治疗需求，尤其强调了其作为抗多药耐药肿瘤药物方面的应用，所述的G-四链核酸适配体优化序列及制剂为基于本综合修饰方法得到的所有产品。
相较于现有技术，本发明的优点在于：
1.本发明提供了一种G-四链核酸适配体的综合修饰方法，将序列截短/拓展结合loop区不同位置核苷酸替换(A、G、C、T/U)的改造手段，对序列进行磷酸骨架硫代的修饰方法，以及基于中性核苷脂材的包载递送手段联合使用，从而结合了三种不同优化方法的优势，所获得的G-四链核酸适配体优化制剂可高效进入细胞并在体内外实验中表现出明显的生物学作用效果，为G-四链核酸适配体的应用，尤其是在生物体内的应用奠定了良好的基础。
2.本发明同时提供了本修饰方法相关产品在抗多药耐药肿瘤方面的新用途：G-四链核酸适配体TBA、AS1411通过本修饰方法的使用，获得了新型的G-四链核酸适配体制剂，细胞水平及小鼠体内实验结果表明，此类制剂对多药耐药肿瘤具有显著的抑制效果，推动了G-四链适配体作为抗多药耐药肿瘤药物的开发。
附图说明
图1为DNCA包载下TBA及其硫代修饰序列对MCF-7细胞的增殖抑制实验结果图；
图2为DNCA包载下TBA及其硫代修饰序列对MCF-7/ADR细胞的增殖抑制实验结果图；
图3为DNCA包载下TBA及其硫代修饰序列对K562细胞的增殖抑制实验结果图；
图4为DNCA包载下TBA及其硫代修饰序列对K562/ADR细胞的增殖抑制实验结果图；
图5为DNCA包载下AS1411及其硫代修饰序列对MCF-7细胞的增殖抑制实验结果图；
图6为DNCA包载下AS1411及其硫代修饰序列对MCF-7/ADR细胞的增殖抑制实验结果图；
图7为DNCA包载下AS1411及其硫代修饰序列对K562细胞的增殖抑制实验结果图；
图8为DNCA包载下AS1411及其硫代修饰序列对K562/ADR细胞的增殖抑制实验结果图；
图9为DNCA包载下TBA、AS1411及其硫代修饰序列对MCF-7、MCF-7/ADR细胞的增殖抑制实验结果图；
图10为TBA及ZY16、ZY16′系列改造序列的CD光谱实验结果图；
图11为DNCA包载下TBA及ZY16、ZY16′系列改造序列对A549、A549/TXL、A549/DDP细胞的增殖抑制实验结果图；
图12为DNCA包载下ZY16的动物水平活性及安全性评价结果图；
图13为DNCA包载下TBA、ZY16、ZY16A及其三硫代序列对A549、A549/TXL细胞的增殖抑制实验结果图；
图14为DNCA包载下TBA-5/7/10S、ZY16-5/8/11S、AS1411-1/3/24S、AS1411-1/13-16S对多种肿瘤细胞的增殖抑制实验结果图；
图15为AS1411及TBA的结构及loop区拓展示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1G-四链核酸适配体优化序列的固相合成
DNA的合成采用Appllied Biosystems model 394DNA固相合成仪。
脱氧核苷亚磷酰化单体(dT,dGiBu,dABz,dCAc)从芜湖华仁科技有限公司购买；CPG合成柱、无水乙腈、CAP-A、CAP-B、氧化I2液、二硫化二苯乙酰、Cl3CCOOH及催化剂从北京迪纳兴科生物科技公司购买。
合成规模：～1.0μmol。
核苷亚磷酰化单体溶液的配制：氩气保护下称量，加无水乙腈，配成0.12M溶液。
采用固相合成的方法合成了TBA及其单/双/多硫代修饰序列、AS1411及其单/双/多硫代修饰序列、ZY16系列改造序列、ZY16′系列改造序列、ZY16的三硫代修饰序列和ZY16A的三硫代修饰序列，ZY16及ZY16′系列改造序列见表1。在DNA合成仪上，序列从3′端至5′端进行合成，每偶联一个核苷为一个循环，每个循环包括四个反应：脱DMT、偶联、封闭、氧化。
表1.ZY16、ZY16′系列改造序列
Figure BDA0003129105510000091
以合成ZY16A-5/8/11S为例，ZY16A-5/8/11S即表1中ZY16A的5、8、11三个位点的碱基与各自相邻位点的碱基之间的磷酸二酯键骨架上的O被S替换修饰(简称硫代修饰)后的序列。
合成步骤：取1.0μmol CPG合成柱，按照ABI394核酸合成仪的标准步骤，每次合成共84步。核苷单体偶联2次，每次90秒。硫代位点合成过程中，将常规合成中使用的碘液替换为硫代试剂(0.2M二硫化二苯乙酰溶液)即可。
DNA的切割、脱保护：合成结束后，从反应柱中取出CPG，加入2mL质量分数为30％的浓氨水溶液，恒温65℃，摇床振荡反应4小时，将寡核苷酸从CPG上切割下来溶于浓氨水中，冻干后将产物置于-80℃保存。
DNA的分离纯化：冻干的样品加适量超纯水复溶，采用HPLC方式纯化，即VenusilXBP C18柱，流速4mL/min，0％-35％B液(B液:乙腈,A液:0.05M TEAB缓冲液)，维持35％的乙腈比例洗脱20分钟。HPLC分离产物冻干后加入0.5mL超纯水，定量后加3.2倍当量的80％乙酸水溶液，冰浴混匀，3200rpm离心2分钟，加入6.2倍当量三乙胺，冰浴混匀后以葡聚糖凝胶柱脱盐，纯水为流动相，流速1.5mL/min，收集馏分，冻干得到目标单链DNA，-80℃保存。
实施例2在中性胞苷脂材DNCA包载下TBA的单/双/三硫代修饰序列对人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药株MCF-7/ADR(耐药指数72)、人髓性白血病细胞株K562及其阿霉素耐药株K562/ADR(耐药指数139)的细胞增殖抑制活性测定
1.样品
样品信息见表2，所有样品按照实施例1方法制备。
表2.TBA及其单/双/三硫代修饰序列
Figure BDA0003129105510000101
*表示相邻两个碱基之间的磷酸二酯键骨架上的O被S替换修饰(简称硫代修饰)。
2.方法
(1)细胞铺板：将对数生长期的肿瘤细胞制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度，以每孔3000-5000个细胞的密度接种于96孔培养板，培养18-24小时后进行转染。
(2)制剂、转染：取适量适配体母液加入到EP管中，加入总体积一半体积的溶剂(GenOpti)混匀，随后将对应体积的中性胞苷脂材DNCA母液加入到溶剂液面下，补加剩余溶剂，盖好管盖，将EP管放至PCR仪中完成退火程序(快速升温至90℃,随后每5min降5℃,直至温度降低至25℃)，即得制剂。96孔板中每孔加20μL制剂，十字形晃匀，继续培养48小时后进行检测。
(3)CCK-8法检测：吸弃孔内原有液体，每孔加入100μL含10％CCK-8底物的培养液，37℃避光孵育1.5小时。利用Microplate Reader(Molecular Devices，California，USA)检测450nm处的吸光度，按照如下公式计算细胞生存率(V)：
V＝[(RA–RE)/(RB-RE)]×100％
注：RA、RB、RE分别代表实验组、空白对照组以及培养液底色组的吸光度。
3.实验结果
在200nM浓度，DNCA(26μM)为转染试剂，作用48小时的条件下，考察了TBA的单/双/三硫代修饰序列的抗肿瘤活性。
对于MCF-7/ADR细胞，实验结果显示，在评价浓度下，三位点硫代修饰序列TBA-5/7/10S活性最佳，抑制率达到64％(图2)，说明这三个磷酸骨架所在的平面可能在其与效应蛋白的结合过程中发挥了更重要的作用。所有序列对MCF-7均未显示出抑制效果(图1)，也即所评价的序列对MCF-7/ADR细胞具有选择性的抑制作用。
对于K562/ADR细胞和K562细胞，所有硫代序列的抑制水平均在30-40％之间，活性与TBA相比，变化不大，也没有显示出明显的细胞选择性(图3,图4)。
实施例3在中性胞苷脂材DNCA包载下AS1411的单/双/三硫代修饰序列对人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药株MCF-7/ADR(耐药指数72)、人髓性白血病细胞株K562及其阿霉素耐药株K562/ADR(耐药指数139)的细胞增殖抑制活性测定
1.样品
样品信息见表3，所有样品按照实施例1方法制备。
表3.AS1411及其单/双/三硫代修饰序列
Figure BDA0003129105510000111
/>
Figure BDA0003129105510000121
*表示相邻两个碱基之间的磷酸二酯键骨架上的O被S替换修饰(简称硫代修饰)。
2.方法
同实施例2中操作。
3.实验结果
在200nM浓度，DNCA(26μM)为转染试剂，作用48小时的条件下，考察了AS1411的单/双/三硫代修饰序列的抗肿瘤活性。
对于MCF-7/ADR细胞，实验结果表明，5′端和靠近loop区修饰后的序列具有更好的抗肿瘤活性，抑制率约为67％，比AS1411提高约15％，这说明5′端和loop区在序列与效应蛋白结合过程中发挥了更加重要的作用(图6)。而对于非耐药株MCF-7来说，所有序列均未表现出显著的抗肿瘤效果，即所评价的AS1411硫代序列对MCF-7/ADR细胞具有选择性的抑制作用(图5)。
对于K562/ADR细胞及K562细胞，绝大部分AS1411硫代修饰序列的抑制率介于30％-50％之间，活性与AS1411相比没有明显提高，并且未显示出明显的肿瘤细胞选择性(图7,图8)。
实施例4在中性胞苷脂材DNCA包载下TBA的单/双/多硫代修饰序列及AS1411的单/双/多硫代修饰序列对人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药株MCF-7/ADR(耐药指数72)的细胞增殖抑制活性测定
1.样品
样品信息见表4，所有样品按照实施例1方法制备。
表4.TBA、AS1411及其单/双/多硫代修饰序列
Figure BDA0003129105510000131
/>
Figure BDA0003129105510000141
*表示相邻两个碱基之间的磷酸二酯键骨架上的O被S替换修饰(简称硫代修饰)。
2.方法
同实施例2中操作。
3.实验结果
适配体给药浓度均为200nM,DNCA使用浓度统一为15μM，药物作用时间为48小时，在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中考察抗肿瘤活性。结果表明，对于AS1411来说，三硫代修饰序列AS1411-1/3/24S和五硫代序列AS1411-1/13-16S的抗肿瘤活性较好，与AS1411相比有显著提升；对于TBA来说，三硫代修饰序列TBA-5/7/10S的抗肿瘤活性较好，与TBA相比有显著提升(图9)。
总体来说，一方面，得到了3条抗肿瘤活性有一定提升的硫代修饰序列，在DNCA包载下，它们可高效发挥抗肿瘤作用；另一方面，这些硫代位点的信息提示了其与效应蛋白结合时的关键位点，对后续实施其他类型修饰策略具有一定的指导作用。
实施例5ZY16、ZY16′系列改造序列的基本性质研究
1.样品
TBA及ZY16、ZY16′系列改造序列(表1)，所有样品按照实施例1方法制备。
2.方法
CD光谱分析
人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411均具有抗肿瘤活性，并且，对比二者结构可发现AS1411的双链反平行二级结构中端基部分与TBA相比仅有一个T碱基的差别，因而结合序列截短/拓展和loop区不同位置核苷酸替换(A、G、C、T)的手段，得到ZY序列如SEQ ID No.3所示，选取其中的ZY16、ZY16′系列共7条序列进行CD光谱分析。
首先用高纯氮气吹扫Jasco J610光谱仪5分钟，再将1nmol适配体退火后溶于0.2mL PBS当中。利用光谱仪检测溶液再不同波长下的椭圆度变化。波长范围200-400nm，每0.5nm检测数值。数据用Origin 6.0进行平滑处理作图。
3.实验结果
结果如图10所示，ZY16、ZY16′系列改造序列均保持了与TBA相似的总体构象，但是290nm的特征吸收峰均有一定程度降低。
实施例6在中性胞苷脂材DNCA包载下ZY16、ZY16′系列改造序列对人肺腺癌细胞株A549及其紫杉醇耐药株A549/TXL(耐药指数103.5)、顺铂耐药株A549/DDP(耐药指数5)的细胞增殖抑制活性测定
1.样品
TBA及ZY16、ZY16′系列改造序列(表1)，所有样品按照实施例1方法制备。
2.方法
同实施例2中操作。
3.实验结果
适配体给药浓度均为100nM,DNCA使用浓度均为7.5μM，药物作用时间为48小时，在A549、A549/TXL和A549/DDP细胞中考察抗肿瘤活性。结果显示，在此给药浓度条件下，所有序列均未显著影响A549细胞的活力，对A549/DDP细胞具有较弱的生长抑制，而对A549/TXL细胞生长抑制作用十分显著，其中序列ZY16和ZY16A对A549/TXL细胞的抑制率达到70％左右(图11)。
实施例7中性胞苷脂材DNCA包载下ZY16在小鼠模型中的药效及安全性考察实验
1.样品
TBA、ZY16，所有样品按照实施例1方法制备。
2.方法
选取4-5周龄雄性BALB/c裸鼠，腋下接种A549/TXL细胞(200-300万细胞/只)，待瘤体积达到50-100mm3后,将小鼠随机分组并开始给药，分别在第1、2、3、5、8、10天给药(适配体:1mg/kg；DNCA:7.5mg/kg)，共给药6次，并分别在第1、3、5、8、10、12天称量小鼠体重、测量瘤体的长和宽，按照如下公式对肿瘤体积、相对瘤体积进行计算。
肿瘤体积(mm3)＝0.5×长×宽2
相对瘤体积＝肿瘤体积(mm3)/初始肿瘤体积(mm3)
实验终点时，颈椎脱臼法处死小鼠，剥离瘤体，称重，并将全部瘤体按大小从左至右排列，拍照。
3.实验结果
相同给药浓度下，与裸给的TBA相比，DNCA包载下的TBA和ZY16均有显著的更强的抗肿瘤药效(图12A和D)，对比相对瘤体积发现，DNCA包载下，ZY16的抗肿瘤药效优于TBA(图12B)。此外，由小鼠体重情况(图12E)可知各组药物均未在小鼠模型中表现出明显毒性，安全性良好。
实施例8在中性胞苷脂材DNCA包载下TBA、ZY16、ZY16A及其三硫代序列对人肺腺癌细胞株A549及其紫杉醇耐药株A549/TXL(耐药指数103.5)的细胞增殖抑制活性测定
1.样品
TBA、ZY16、ZY16A、TBA-5/7/10S、ZY16-5/7/11S、ZY16-5/8/11S、ZY16-5/9/11S、ZY16A-5/7/11S、ZY16A-5/8/11S、ZY16A-5/9/11S，所有样品按照实施例1方法制备。
2.方法
同实施例2中操作。
3.实验结果
适配体给药浓度均为100nM，DNCA使用浓度均为7.5μM，药物作用时间为48小时，在A549、A549/TXL细胞中考察抗肿瘤活性。结果显示，所有序列均表现出对耐药肿瘤具有更强的增殖抑制作用，其中非常有意义的是，在此实验中发现，TBA-5/7/10S及ZY16-5/8/11S不仅非常有效地抑制了耐药细胞A549/TXL的生长，同时还对非耐药细胞A549具有显著的生长抑制作用(图13)。
实施例9在中性胞苷脂材DNCA包载下TBA-5/7/10S、ZY16-5/8/11S、AS1411-1/3/24S、AS1411-1/13-16S对人肺腺癌细胞株A549及其紫杉醇耐药株A549/TXL(耐药指数103.5)、人乳腺癌细胞株MCF-7、人黑色素瘤细胞株A375、人宫颈癌细胞株Hela及人肝癌细胞株HepG2的细胞增殖抑制活性测定
1.样品
TBA-5/7/10S、ZY16-5/8/11S、AS1411-1/3/24S、AS1411-1/13-16S，所有样品按照实施例1方法制备。
2.方法
同实施例2中操作。
3.实验结果
适配体给药浓度均为100nM，DNCA使用浓度均为7.5μM，药物作用时间为48小时，在多种肿瘤细胞中考察抗肿瘤活性。结果显示，TBA-5/7/10S、ZY16-5/8/11S、AS1411-1/3/24S、AS1411-1/13-16S在A549、A549/TXL、A375、Hela细胞中均表现出显著的抗肿瘤活性，而对HepG2、MCF-7细胞则没有明显活性(图14)，说明它们的抗肿瘤选择性不仅体现在耐药和非耐药细胞中，也体现在不同种类的肿瘤细胞之间。
序列表
<110> 北京大学
<120> 一种G-四链核酸适配体的综合化学修饰方法、产品及其在抗多药耐药肿瘤细胞中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
ggttggtgtg gttgg 15
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
ggttggtgtt ggttgg 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 4
ggttggtgat ggttgg 16
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 5
ggttggtgct ggttgg 16
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 6
ggttggtggt ggttgg 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 7
ggttggttgt ggttgg 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 8
ggttggtagt ggttgg 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 9
ggttggtcgt ggttgg 16

Claims (3)

1.修饰后的人凝血酶的核酸适配体TBA或其制剂，其特征在于，所述的修饰包括对G-四链核酸适配体序列的截短或拓展、loop区不同位置的核苷酸替换、磷酸骨架硫代，以及中性核苷脂材包载修饰物的联合使用；
对G-四链核酸适配体序列的截短或拓展以及loop区不同位置的核苷酸替换，是基于两条或多条可形成G-四链体结构的核酸适配体之间的结构相似性及功能相似性而进行的；
所述的修饰后的人凝血酶的核酸适配体TBA或其制剂选自以下任意一种：
（1）基于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411之间的结构相似性及抗肿瘤功能相似性，结合序列截短或拓展和loop区不同位置核苷酸替换的手段，得到ZY序列，并利用中性胞苷脂材DNCA对ZY序列进行包载得到的ZY序列制剂，其中，TBA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，AS1411的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，ZY的核苷酸序列如SEQ ID No.3-9所示；
（2）基于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411之间的结构相似性及抗肿瘤功能相似性，利用序列截短或拓展和loop区不同位置核苷酸替换的手段获得ZY16以及ZY16A，并对ZY16以及ZY16A进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰而得到的ZY硫代修饰序列：ZY16-5/7/11S、ZY16-5/8/11S、ZY16-5/9/11S、ZY16A-5/7/11S、ZY16A-5/8/11S以及ZY16A-5/9/11S；以合成ZY16A-5/8/11S为例，ZY16A-5/8/11S即将ZY16A的5、8、11三个位点的碱基与各自相邻位点的碱基之间的磷酸二酯键骨架上的O被S替换后的序列，以此类推；其中，TBA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，AS1411的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，ZY16以及ZY16A的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7或8所示；
（3）基于人凝血酶的核酸适配体TBA及人核仁素的核酸适配体AS1411之间的结构相似性及抗肿瘤功能相似性，利用序列截短或拓展和loop区不同位置核苷酸替换的手段获得ZY16以及ZY16A，并对ZY16以及ZY16A进行至少1个位点的磷酸骨架硫代修饰而得到的ZY硫代修饰序列：ZY16-5/7/11S、ZY16-5/8/11S、ZY16-5/9/11S、ZY16A-5/7/11S、ZY16A-5/8/11S以及ZY16A-5/9/11S；以合成ZY16A-5/8/11S为例，ZY16A-5/8/11S即将ZY16A的5、8、11三个位点的碱基与各自相邻位点的碱基之间的磷酸二酯键骨架上的O被S替换后的序列，以此类推；然后将得到的ZY硫代修饰序列进一步利用中性胞苷脂材DNCA包载而得到的ZY硫代修饰序列制剂，其中，TBA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，AS1411的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，ZY16以及ZY16A的核苷酸序列如SEQ ID No.7或8所示。
2.权利要求1所述的修饰后的人凝血酶的核酸适配体TBA或其制剂在制备抗肿瘤药物、肿瘤检测试剂或制备细胞内分子调控药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗多药耐药肿瘤药物。
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