CN104262337A

CN104262337A - 作为jak抑制剂的5-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-甲酰胺化合物

Info

Publication number: CN104262337A
Application number: CN201410408911.8A
Authority: CN
Inventors: C·J·M·梅内特; K·K·斯米茨
Original assignee: Galapagos NV
Current assignee: Galapagos NV
Priority date: 2009-06-26
Filing date: 2010-06-25
Publication date: 2015-01-07
Also published as: ES2766573T3; AU2017204744A1; ZA201109386B; ES2626908T3; JP2014221825A; KR20180041262A; US8088764B2; PT2445911T; GB201200457D0; AU2015218544B2; SG177363A1; EP3178819B1; HUE033154T2; SI2445911T1; EP2445911A1; US8563545B2; HUE047478T2; LTC2445911I2; MA33448B1; US20180000831A1

Abstract

本发明涉及作为JAK抑制剂的5-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-A]吡啶-2-甲酰胺化合物，所述化合物可以制备为药物组合物，可以用于预防和治疗包括人在内的哺乳动物的多种病症，所述病症包括但不限于炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病。

Description

作为JAK抑制剂的5-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-A]吡啶-2-甲酰胺化合物

相关申请

本申请为2010年6月25日提交的、发明名称为“作为JAK抑制剂的5-苯基-[1,2,4]三唑并[1,5-A]吡啶-2-甲酰胺化合物”的PCT申请PCT/EP2010/059064的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2011年12月26日，申请号为201080028631.4。

技术领域

本发明涉及JAK抑制剂化合物，JAK属于参与炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新(turnover)受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病的酪氨酸激酶家族。具体而言，本发明化合物抑制JAK1和JAK2。本发明还提供所述化合物、含有所述化合物的药物组合物的生产方法和通过施用本发明化合物预防和/或治疗炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病的方法。

Janus激酶(JAK)是转导细胞因子信号从膜受体到STAT转录因子的细胞质酪氨酸激酶。现有技术已经描述了四种JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。当细胞因子与其受体结合时，JAK家族成员自磷酸化和/或彼此转磷酸化，随后STATs磷酸化，然后迁移至细胞核内以调节转录。JAK-STAT细胞内信号转导适用于干扰素、大多数白细胞介素以及多种细胞因子和内分泌因子，例如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF和PRL(Vainchenker W.等人(2008))。

遗传学模型和小分子JAK抑制剂的组合研究揭示了几种JAKs的治疗潜能。通过小鼠和人遗传学确证JAK3是免疫抑制靶点(O’Shea J.等人(2004))。JAK3抑制剂成功用于临床开发，最初用于器官移植排斥，但后来也用于其它免疫炎性适应证，例如类风湿性关节炎(RA)、银屑病和克隆病(http://clinicaltrials.gov/)。

TYK2是免疫炎性疾病的潜在靶点，已经通过人遗传学和小鼠剔除研究确证(Levy D.和Loomis C.(2007))。

JAK1是免疫炎性疾病领域的新靶点。将JAK1与其它JAKs杂二聚化以转导细胞因子驱动的促炎信号传导。因此，预期抑制JAK1和/或其它JAK对于一系列炎性病症和其它由JAK介导的信号转导驱动的疾病是具有治疗益处的。

背景技术

软骨变性是很多疾病的标志，其中类风湿性关节炎和骨关节炎是最主要的。类风湿性关节炎(RA)是慢性关节变性疾病，其特征在于关节结构的炎症和破坏。当疾病未受抑制时，由于关节功能性的丧失导致实质性的失能和疼痛，甚至过早死亡。因此，RA治疗的目的不仅在于延缓疾病，而且在于获得减轻，从而终止关节破坏。除了疾病结果的严重性，高度普遍的RA(全球～0.8％的成年人受到困扰)意味着很高的社会经济冲击。(关于RA的综述，参见Smolen和Steiner(2003)；Lee和Weinblatt(2001)；Choy和Panayi(2001)；O’Dell(2004)和Firestein(2003))。

骨关节炎(也称为OA，或磨损关节炎)是最常见的关节炎形式，其特征在于关节软骨的损失，通常伴随骨肥大和疼痛。关于骨关节炎的深入综述，参见Wieland等人,2005。

骨关节炎难以治疗。目前，尚无法治愈，治疗集中于缓解疼痛和防止患病关节变形。常用的治疗包括应用非甾体抗炎药(NSAID)。尽管对于骨关节炎的治疗营养保健品例如软骨素和硫酸葡糖胺被确认是安全有效的选择，然而最近的临床试验表明两种治疗不能降低与骨关节炎有关的疼痛(Clegg等人,2006)。

刺激合成代谢过程、阻断分解代谢过程或这两者的组合，可以使软骨稳定，并甚至可能逆转损伤，从而防止疾病的进一步恶化。已发现了矫正骨关节炎疾病期间出现的关节软骨损伤的治疗方法，但目前无一能原位和体内介导软骨再生。总而言之，目前尚没有有效的矫正骨关节炎疾病的药物。

Vandeghinste等人(WO 2005/124342)发现JAK1可以作为靶点，对它的抑制对于数种疾病(包括OA)的治疗可能具有相关性。小鼠中JAK1基因的剔除证实JAK1在发育过程中发挥必要的非冗余作用：JAK1-/-小鼠在出生后24小时内死亡并且淋巴细胞发育严重受损。另外，JAK1-/-细胞不对或很少对应用II类细胞因子受体的细胞因子、应用γ-c亚基用于信号传导的细胞因子受体和应用gp130亚基用于信号传导的细胞因子受体家族反应(Rodig等人,1998)。

多组参与了软骨细胞生物学中JAK-STAT的信号传导。Li等人(2001)指出制癌蛋白M通过活化JAK/STAT和MAPK信号传导途径而诱导初级软骨细胞中MMP和TIMP3基因表达。Osaki等人(2003)指出软骨细胞中干扰素γ介导的胶原II抑制与JAK-STAT信号传导有关。IL1-β通过减少基质组分的表达和通过诱导胶原酶和诱导型一氧化氮合酶(NOS2)(其介导一氧化氮(NO)的产生)的表达而诱导软骨的分解代谢。Otero等人(2005)指出瘦蛋白和IL1-β协同诱导软骨细胞中NO的产生和NOS2mRNA的表达，并且指出这种作用可以被JAK抑制剂阻断。Legendre等人(2003)指出IL6/IL6受体诱导牛关节软骨细胞中软骨特异性基质基因胶原II、软骨聚集蛋白聚糖核心和连接蛋白的下调，并且指出这种作用通过JAK/STAT信号传导介导。因此，这些观察表明JAK激酶活性在软骨体内稳态中起作用以及JAK激酶抑制剂具有治疗潜能。

JAK家族成员还与其它病症有关，包括骨髓增殖性障碍(O’Sullivan等人，2007，Mol Immunol.44(10)：2497-506)，其中在JAK2中鉴定出存在突变。这表明JAK、特别是JAK2的抑制剂还能用于治疗骨髓增殖性障碍。另外，JAK家族、特别是JAK1、JAK2和JAK3，与癌症、特别是白血病例如急性髓性白血病(O’Sullivan等人，2007，Mol Immunol.44(10)：2497-506；Xiang等人，2008，“Identification of somatic JAK1mutations inpatients with acute myeloid leukemia(急性髓性白血病症者中体JAK1突变的鉴定)”Blood第一版文章，在线发表于2007年12月26日；DOI10.1182/blood-2007-05-090308)和急性淋巴细胞白血病(Mullighan等人，2009)或实体瘤例如子宫平滑肌肉瘤(Constantinescu等人，2007，Trends inBiochemical Sciences 33(3)：122-131)、前列腺癌(Tam等人，2007，BritishJournal of Cancer，97，378-383)相关。这些结果表明JAK、特别是JAK1和/或JAK2的抑制剂还可以用于治疗癌症(白血病和实体瘤，例如子宫平滑肌肉瘤、前列腺癌)。

另外，Castleman病、多发性骨髓瘤、系膜增殖性肾小球肾炎、银屑病和卡波西肉瘤可能归因于细胞因子IL-6的分泌过多，IL-6的生物学效应是通过细胞内JAK-STAT信号传导介导的(Tetsuji Naka，NorihiroNishimoto和Tadamitsu Kishimoto，Arthritis Res 2002，4(suppl 3)：S233-S242)。该结果表明，JAK的抑制剂还可以用于治疗所述疾病。

目前的治疗不令人满意，因此仍然需要鉴定出另外的化合物，所述化合物可用于治疗变性关节疾病，例如骨关节炎、风湿性关节炎和骨质疏松，特别是骨关节炎。因此，本发明提供化合物、它的制备方法和包含本发明化合物以及合适药物载体的药物组合物。本发明还提供本发明化合物在制备用于治疗变性关节疾病的药物中的用途。尤其是本发明提供在体内显示显著提高的效能的新JAK抑制剂。

发明内容

发明概述

本发明是基于这样一个发现：本发明化合物能作为JAK抑制剂，用于治疗炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病。在一个具体方面，本发明化合物是JAK1和JAK2的抑制剂。本发明还提供了生产所述化合物的方法、包含所述化合物的药物组合物和通过施用本发明化合物治疗炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病的方法。

因此，在本发明的第一方面，提供式(I)的本发明化合物：

本发明的化合物是新型的JAK抑制剂，与结构类似的化合物相比，其在体内显示显著提高的效能。在一个具体的实施方案中，本发明化合物是JAK1和JAK2抑制剂。具体地讲，与结构类似的化合物相比，其在较低的体内水平即可显示这种效能的增加。预期采用这种效能提高的化合物可使剂量需求降低(并由此使剂量方案得以改进)。

另一方面，本发明提供含有本发明化合物和药物载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。而且，就制备和使用而言，在文中公开的药物组合物和治疗方法中所用的本发明化合物是药学上可接受的。在本发明的该方面，所述药物组合物还可含有适合于与本发明化合物联合应用的其他活性成分。

在本发明的另一方面，本发明提供了治疗易感或感染本文所列的那些病症的哺乳动物的方法，特别是与异常JAK活性相关的病症，例如炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病，该方法包括施用本文描述的治疗有效量的本发明的药物组合物或化合物。在一个具体实施方案中，所述病症是与异常JAK1和JAK2活性相关的。

在另一方面，本发明提供了用于治疗或预防病症的本发明化合物，所述的病症选自本文所列的那些，特别是可能与异常JAK活性相关的那些病症，例如炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病。

还在另一个治疗方法方面，本发明提供了治疗本文所述的易感或感染与异常JAK活性相关的病症的哺乳动物的方法，该方法包括施用有效治疗病症或预防病症的量的本文描述的本发明药物组合物或化合物。在一个具体方面，所述病症在病因上是与异常的JAK1和JAK2活性相关的。

在另一方面，本发明提供用于治疗或预防与异常JAK活性相关的病症的本发明化合物。

在另一方面，本发明提供采用本文后面公开的代表性的合成方案和路线合成本发明化合物的方法。

因此，本发明的主要目的是提供新的化合物，其可以修正JAK的活性，从而预防或治疗任何可能与其相关的疾病。在一个具体的方面，本发明化合物可以调节JAK1和JAK2的活性。

本发明的另一目的是提供可以治疗或缓解疾病或疾病症状的化合物，所述疾病或疾病为例如炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和与IL6分泌过多相关的疾病，这些疾病可能与JAK、特别是JAK1和JAK2活性相关。

本发明的另一目的是提供可用于治疗或预防多种疾病状态的药物组合物，所述的疾病状态包括与JAK活性相关的疾病，例如炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和与IL6分泌过多相关的疾病。在一个具体实施方案中，所述疾病特别是与JAK1和JAK2活性相关的。

考虑到随后的详述，其它目的和优势对于本领域技术人员将是显而易见的。

发明详述

定义

下列术语旨在具有下面给出的含义并且用于理解本文中的描述和本发明的范围。

当描述本发明时，其可以包括化合物、包含此类化合物的药物组合物以及应用此类化合物和组合物的方法，除非另外说明，下列术语，如果存在的话，则具有下列含义。还应当理解的是，本文中描述的任何基团可以被多种取代基取代，并且取代的基团包括在其分别的定义范围内。除非另外说明，术语“取代的”如下文定义。还应当理解的是，本文中应用的术语“基”和“基团”是可以互换的。

不定冠词“一个”和“一种”在本文可以用于表示一个(种)或多于一个(种)(即至少一个(种))冠词的合乎语法的指代对象，例如“一个(种)类似物”表示一个(种)类似物或多于一个(种)类似物。

本文所用的术语“JAK”涉及Janus激酶(JAKs)家族，其是从膜受体向STAT转录因子转导细胞因子信号的细胞质酪氨酸激酶。现有技术描述了四种JAK家族成员：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，术语JAK可表示上下文所示的全体所有JAK家族成员或者一种或多种JAK家族成员。

“药学上可接受的”意指联邦或洲政府的管理机构或美国之外国家的相应机构已经批准的或可批准的，或者美国药典或其它普遍认可的药典中所列的用于动物并且更特别是用于人的。

“药学上可接受的盐”意指本发明化合物的盐，所述的盐是药学上可接受的并且具有母体化合物的所需的药理学活性。特别的是，此类盐是无毒的，可以是无机或有机酸加成盐和碱加成盐。尤其是，此类盐包括：(1)与无机酸形成的酸加成盐，所述的无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或者与有机酸形成的酸加成盐，所述的有机酸例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等；或者(2)当母体化合物中存在酸性质子时，金属离子代替该酸性质子形成的盐，所述的金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子；或者与有机碱配位，所述的有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等。盐进一步包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等的盐；并且当化合物包含碱性官能团时，形成无毒有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。术语“药学上可接受的阳离子”表示酸性官能团的可接受的阳离子抗衡离子。此类阳离子例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵阳离子等。

“药学上可接受的介质(vehicle)”表示与本发明化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。

“溶剂化物”表示通常通过溶剂解反应与溶剂缔合(association)的化合物形式。这种物理的缔合包括氢键。常规的溶剂包括水、乙醇、乙酸等。本发明化合物可以制备成例如结晶形式并且可以溶剂化或水化。适合的溶剂化物包括药学上可接受的溶剂化物，例如水合物，并且还包括化学计量的溶剂化物和非化学计量的溶剂化物。在某些情况中，溶剂化物能够分离，例如当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物。代表性的溶剂化物包括水合物、乙醇化物和甲醇化物。

“个体”包括人。术语“人”、“患者”和“个体”在本文中是可互换应用的。

“治疗有效量”意指当施用于个体用于治疗疾病时化合物的量足以对疾病的治疗有效。“治疗有效量”可根据化合物、疾病及其严重程度、所治疗个体的年龄、体重等变化。

“防止”或“预防”表示降低获得或发展成疾病或病症的风险，即使至少一种疾病的临床症状不在个体中发展，所述的个体可能暴露于致病剂或在疾病发作前易患该疾病。

术语“预防”涉及“防止”，表示措施或方法，其目的在于预防而非治疗或治愈疾病。预防措施的非限制性实例包括施用疫苗；例如由于不运动而给存在血栓形成风险的医院患者施用低分子量肝素；以及在前往疟疾流行或感染疟疾风险很高的地理区域前施用抗疟疾药，例如氯喹。

在一个实施方案中，任何疾病或病症的“治疗”表示改善疾病或病症(即阻止疾病或减轻其至少一种临床症状的表象、程度或严重性)。在另一个实施方案中，“治疗”表示改善至少一种身体指标，该指标可能不是个体可察觉的。在另一个实施方案中，“治疗”表示调节疾病或障碍，身体上(例如稳定可察觉的症状)、生理上(例如稳定身体指标)或两者。在进一步的实施方案中，“治疗”表示减缓疾病的进程。

本文所用的术语“炎症”表示一组病症，包括类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病、过敏性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、炎性肠病(例如克隆病、结肠炎)、内毒素驱动的疾病状态(例如心脏搭桥手术后的并发症或由于例如慢性心力衰竭引起的慢性内毒素状态)以及涉及软骨的相关疾病，例如关节疾病。该术语特别表示类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。

本文所用的术语“自身免疫疾病”表示一组疾病，包括阻塞性气道疾病，包括病症例如COPD、哮喘(例如内源性哮喘、外源性哮喘、粉尘性哮喘、婴儿哮喘)，特别是慢性或长期形成的哮喘(例如晚期哮喘和气道高反应性)、支气管炎(包括支气管哮喘)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化、I型糖尿病及其相关的并发症、特应性湿疹(特应性皮炎)、接触性皮炎，还包括湿疹性皮炎、炎性肠病(例如克隆病和溃疡性结肠炎)、动脉粥样硬化和肌萎缩性侧索硬化。该术语特别表示COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。

本文所用的术语“增殖性疾病”表示病症，例如癌症(例如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、骨髓增殖性障碍(例如真性红细胞增多症、原发性的血小板增多和骨髓纤维化)、白血病(例如急性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病)、多发性骨髓瘤、银屑病、再狭窄、硬化性皮炎或纤维化。该术语特别表示癌症、白血病、多发性骨髓瘤和银屑病。

本文所用的术语“癌症”表示皮肤或机体器官中细胞的恶性或良性生长，所述的器官为例如但不限于乳房、前列腺、肺、肾、胰、胃或肠。癌症易于侵入相邻的组织并且扩散(转移)到较远的器官，例如骨、肝、肺或脑。本文所用的术语癌症包括转移肿瘤细胞型，例如但不限于黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和肥大细胞瘤，以及组织癌类型，例如但不限于结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胶质母细胞瘤、原发性肝癌、卵巢癌、前列腺癌和子宫平滑肌肉瘤。

本文所用的术语“白血病”表示血液和造血器官的肿瘤疾病。此类疾病可以导致骨髓和免疫系统功能障碍，这使得宿主极易感染和出血。术语白血病特别表示急性髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。

本文所用的术语“移植排斥”表示例如胰岛、干细胞、骨髓、皮肤、肌肉、角膜组织、神经元组织、心脏、肺、心肺联合、肾、肝、肠、胰、气管或食道的细胞、组织或实体器官的同种异体移植物或异种移植物的急性或慢性排斥，或者移植物抗宿主病。

本文所用的术语“涉及软骨更新受损的疾病”包括病症，例如骨关节炎、银屑病关节炎、幼年类风湿性关节炎、痛风性关节炎、脓毒性或感染性关节炎、反应性关节炎、反射交感性营养不良、痛性营养不良、蒂策综合征或肋软骨炎、纤维肌痛、骨软骨炎、神经源性或神经病性关节炎、关节病、地方性形式的关节炎如地方性变形性骨关节炎、Mseleni病和Handigodu病、纤维肌痛引起的变性、系统性红斑狼疮、硬皮病和强直性脊柱炎。

本文所用的术语“先天软骨畸形”包括病症，例如遗传性软骨溶解、软骨发育不良和假性软骨发育不良，特别是但不限于小耳畸形、无耳、干骺端软骨发育不良和相关病症。

本文所用的术语“与IL6分泌过多相关的疾病”包括病症，例如Castleman病、多发性骨髓瘤、银屑病、卡波西肉瘤和/或系膜增殖性肾小球肾炎。

“本发明化合物”和等同表述表示包括文中所述结构式的化合物，该表述包括药学上可接受的盐和溶剂化物，例如水合物，以及药学上可接受的盐的溶剂化物，只要上下文中允许。类似地，提及中间体(无论它们本身是否被要求保护)时包括它们的盐和溶剂化物，只要上下文中允许。

本发明化合物的其它衍生物的酸和酸衍生形式均具有活性，但是酸敏感形式通常可以在哺乳动物生物体内提供更有利的溶解性、组织相容性或延缓释放(参见Bundgard,H.,Design of Prodrugs(前药的设计),第7-9,21-24页,Elsevier,Amsterdam 1985)。

本文所用的术语“同位素变体”表示在组成此类化合物的一个或多个原子上包含非天然比例的同位素的化合物。例如，化合物的“同位素变体”可以包含一个或多个非放射性同位素，例如氘(²H或D)、碳-13(¹³C)、氮-15(¹⁵N)等。应当理解的是，制备同位素取代的化合物时，以下原子(当存在时)可以变化，以便例如任何氢可以是²H/D，任何碳可以是¹³C或任何氮可以是¹⁵N，并且此类原子的存在和布局可以由本领域技术人员决定。同样，本发明可以包括用放射性同位素制备同位素变体，在这种情况下，产生的化合物例如可以用于药物和/或底物组织分布研究。考虑到易于掺入和易于检测，放射性同位素氚即³H和碳-14即¹⁴C特别适用于该目的。此外，可以用正电子发射同位素取代制备化合物，例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N，并且将用于正电子发射体层摄影(PET)研究，以检测底物受体占用。

本文提供的化合物的所有同位素变体，无论具有放射性与否，均包括在本发明范围内。

“互变异构体”指为特别的化合物结构的可互换形式并且氢原子和电子位移变化的化合物。因此，两种结构可以通过π电子和原子(通常是H)的移动处于平衡状态。例如，烯醇和酮是互变异构体，因为它们通过用酸或碱处理而快速互变。互变异构现象的另一个实例是苯基硝基甲烷的酸式和硝基式，这同样是通过用酸或碱处理而形成的。

互变异构形式可能与获得目标化合物的最佳的化学反应性和生物学活性相关。

化合物

本发明是基于这样一个发现：本发明化合物是JAK抑制剂，可以用于治疗炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病。本发明还提供了生产本发明化合物的方法、包含本发明化合物的药物组合物，以及通过施用本发明化合物治疗炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病的方法。在一个具体实施方案中，本发明化合物是JAK1和JAK2抑制剂。

因此，在本发明的第一个方面，公开了具有式I的本发明化合物：

在一个实施方案中，本发明化合物不是同位素变体。

本发明化合物是新的JAK抑制剂。具体地讲，该化合物是有效的JAK1和JAK2抑制剂，然而，该化合物也确实可以以较低效能抑制TYK2和JAK3。

本发明化合物显示显著提高的体内效能。尤其是令人吃惊地发现所述提高甚至超过结构类似的化合物。应用具有所述提高的化合物可以降低剂量需求(并由此产生改进的配量方案)。

药物组合物

当作为药物应用时，本发明化合物通常以药物组合物的形式施用。此类组合物可以以制药领域众所周知的方法制备，并且包含至少一种活性化合物。通常，本发明化合物以药用有效量施用。实际上所施用的化合物的量通常由医师根据相关情况而定，所述的相关情况包括所治疗的病症、所选的施用途径、所施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度等。

本发明的药物组合物可以通过多种途径施用，包括口服、直肠、经皮、皮下、关节内、静脉内、肌内和鼻内。根据预期的递送途径，优选将本发明化合物配制成可注射组合物或口服组合物或者所有用于经皮施用的软膏、洗剂或贴剂。

口服施用的组合物可以采用大量液体溶液剂或混悬剂或大量散剂的形式。但是，更常见的是，组合物是以单位剂型存在的以便于准确给药。术语“单位剂型”表示物理上分离的单位，适合作为人个体和其它哺乳动物的单位给药，每个单位包含预定量的活性物质(经计算能产生所需的治疗效果)以及适合的药物赋形剂、介质或载体。典型的单位剂型包括预填充的、预测定的液体组合物的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况中包括丸剂、片剂、胶囊剂等。在此类组合物中，本发明化合物通常是较少的组分(约0.1重量％至约50重量％，优选约1重量％至约40重量％)，剩余部分是多种介质或载体和加工助剂以有助于形成所需的给药形式。

适用于口服施用的液体形式可以包括含有缓冲剂、助悬剂和分散剂、着色剂、矫味剂等的适合的水性或非水性介质。固体形式可以包括例如任何以下成分或类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或柑橘调味剂。

可注射组合物通常是基于可注射无菌盐水或磷酸盐缓冲盐水或本领域已知的其它可注射载体。如上所述，该组合物中活性化合物通常是较少的组分，通常为约0.05重量％至10重量％，剩余部分是可注射载体等。

经皮组合物通常配制成含有活性成分的局部软膏剂或乳膏剂，活性成分的量的范围通常为约0.01％至约20％重量、优选约0.1％至约20％重量、优选约0.1至约10％重量并且更优选约0.5至约15％重量。当配制为软膏剂时，活性成分通常与石蜡或水可混溶的软膏基质混合。或者，在乳膏剂中活性成分可以与例如水包油型乳膏基质一起配制。此类经皮制剂是本领域众所周知的并且通常包含其它成分以增强活性成分或制剂的表皮穿透稳定性。所有此类已知的经皮制剂和成分包括在本发明的范围内。

本发明化合物还可以通过经皮装置施用。因此，经皮施用可以应用储库或多孔膜类型或固体基质变体的贴剂来实现。

上述口服可施用、可注射或局部可施用的组合物的组分仅是代表性的。其它物质和处理技术等在Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)，第17版，1985，Mack Publishing Company，伊斯顿，宾夕法尼亚州的第8部分有描述，将其引入本文作为参考。

本发明化合物还可以以缓释形式或从缓释药物递送系统中施用。代表性的缓释物质的描述参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)。

以下制剂实施例说明可以根据本发明制备的代表性的药物组合物。但是本发明不限制于以下药物组合物。

制剂1-片剂

可以将本发明化合物作为干粉与干明胶粘合剂以约1:2重量比混合。加入少量硬脂酸镁作为润滑剂。在压片机中将混合物制成240-270mg片剂(每片含有80-90mg的活性酰胺化合物)。

制剂2-胶囊剂

可以将本发明化合物作为干粉与淀粉稀释剂以约1:1重量比混合。将混合物填充入250mg胶囊中(每个胶囊含有125mg的活性酰胺化合物)。

制剂3-液体

可以将本发明化合物(125mg)与蔗糖(1.75g)和黄原胶(4mg)混合，并且可以将产生的混合物混合，通过10号目数的U.S.筛，然后与先前制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠(11:89，50mg)的水溶液混合。将苯甲酸钠(10mg)、矫味剂和着色剂用水稀释并且在搅拌下加入。然后可以在搅拌下加入足量的水。然后加入足量的水以制成总体积为5mL。

制剂4-片剂

可以将本发明化合物作为干粉与干明胶粘合剂以约1:2重量比混合。加入少量硬脂酸镁作为润滑剂。在压片机中将混合物制成450-900mg片剂(150-300mg的活性酰胺化合物)。

制剂5-注射剂

可以将本发明化合物溶于或混悬于缓冲的无菌盐水可注射水性介质中至浓度为约5mg/mL。

制剂6-局部

将硬脂醇(250g)和白凡士林(250g)在约75℃下熔化，然后加入溶于水(约370g)中的本发明化合物(50g)、对羟基苯甲酸甲酯(0.25g)、对羟基苯甲酸丙酯(0.15g)、十二烷基硫酸钠(10g)和丙二醇(120g)的混合物，并且将产生的混合物搅拌直至凝结。

治疗方法

本发明化合物可以用作治疗剂用于治疗哺乳动物中与JAK异常活性相关的或由于JAK异常活性引起的病症。具体而言，该类病症与JAK1和/或JAK2异常活性相关。因此，发现本发明化合物和本发明药物组合物用作治疗剂用于预防和/或治疗哺乳动物包括人的炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和与IL6分泌过多相关的疾病。

在另外的治疗方法方面，本发明提供了治疗易感或感染涉及炎症的哺乳动物的方法。该方法包括施用有效治疗病症或预防病症量的一种或多种本文描述的本发明的药物组合物或化合物。在具体的实施方案中，炎症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。

另一方面，本发明提供了本发明化合物，其用于治疗、防止或预防炎症。在特别的实施方案中，炎症选自类风湿性关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。

在另外的治疗方法方面，本发明提供了治疗易感或感染自身免疫疾病的哺乳动物的方法。该方法包括施用有效治疗病症或预防病症量的一种或多种本文描述的本发明的药物组合物或化合物。在具体的实施方案中，自身免疫疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。

另一方面，本发明提供本发明化合物，其用于治疗、防止或预防自身免疫疾病。在特别的实施方案中，自身免疫疾病选自COPD、哮喘、系统性红斑狼疮、I型糖尿病和炎性肠病。

在进一步的治疗方法方面，本发明提供治疗易感或感染增殖性疾病、特别是癌症(例如实体瘤如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如AML或ALL)、多发性骨髓瘤和/或银屑病的哺乳动物的方法。

另一方面，本发明提供本发明化合物，其用于治疗、防止或预防增殖性疾病，特别是癌症(例如实体瘤如子宫平滑肌肉瘤或前列腺癌)、白血病(例如AML或ALL)、多发性骨髓瘤和/或银屑病。

在另外的治疗方法方面，本发明提供了治疗易感或感染移植排斥的哺乳动物的方法。在特别的实施方案中，本发明提供了治疗器官移植排斥的方法。

另一方面，本发明提供本发明化合物，其用于治疗、防止或预防移植排斥。在特别的实施方案中，本发明提供了治疗器官移植排斥的方法。

在治疗方法方面，本发明提供了在易感或感染涉及软骨更新受损的疾病的哺乳动物中治疗、防止或预防的方法，该方法包括施用治疗有效量的本文描述的本发明的化合物或一种或多种本发明药物组合物。

另一方面，本发明提供本发明化合物，其用于治疗、防止或预防涉及软骨更新受损的疾病。

本发明还提供治疗先天软骨畸形的方法，该方法包括施用有效量的本文描述的一种或多种本发明药物组合物或化合物。

另一方面，本发明提供本发明化合物，其用于治疗、防止或预防先天软骨畸形。

在进一步的治疗方法方面，本发明提供了治疗易感或感染与IL6分泌过多相关的疾病，特别是Castleman病或系膜增殖性肾小球肾炎的哺乳动物的方法。

另一方面，本发明提供了本发明化合物，其用于治疗、防止或预防与IL6分泌过多相关的疾病，特别是Castleman病或系膜增殖性肾小球肾炎。

作为本发明进一步的方面，本发明提供了本发明化合物，其用作药物特别用于治疗或预防上述病症和疾病。本文还提供了本发明化合物在制备用于治疗或预防上述病症和疾病之一的药物中的用途。

本方法的一个特别的方案包括给患有涉及炎症的个体施用有效量的本发明化合物一段时间，所述时间足以降低患者的炎症水平，并且优选终止所述炎症的进程。该方法的特别实施方案包括给患有或易感发生类风湿性关节炎的个体患者施用有效量的本发明化合物一段时间，所述时间足以分别降低或预防所述患者的关节炎症，并且优选终止所述炎症的进程。

本方法的另一个特别方案包括给患有以软骨或关节变性为特征的疾病病症(例如风湿性关节炎和/或骨关节炎)的个体施用有效量的本发明化合物一段时间，所述时间足以降低并且优选终止所述退化的自身不断发展的进程。该方法的特别的实施方案包括给患有或易感发生骨关节炎的个体患者施用有效量的本发明化合物一段时间，所述时间足以分别降低或预防所述患者关节的软骨退化，并且优选终止所述退化的自身不断发展的进程。在特别的实施方案中，所述的化合物会表现出软骨合成代谢和/或抗分解代谢性质。

注射剂量水平范围为约0.1mg/kg/小时至至少10mg/kg/小时，全程约1至约120小时，特别是24至96小时。还可以施用约0.1mg/kg至约10mg/kg或更多的预装推注剂，以获得足够的稳态水平。对于40至80kg人患者而言预计最大总剂量不超过约2g/天。

对于预防和/或治疗长期病症，例如变性病症，治疗方案通常延续数月或数年，因此为了患者的方便和耐受，优选口服给药。对于口服给药，代表性的方案是每天1至5个、特别是2至4个、通常是3个口服剂量。采用这些给药方式，每个剂量提供约0.01至约20mg/kg的本发明化合物，对于特别的剂量，每个提供约0.1至约10mg/kg、特别是约1至约5mg/kg。

通常选择经皮给药以提供比用注射给药所获得的类似或更低的血液水平。

当用于预防炎性病症的发作时，通常在医师的告知和监督下将本发明化合物以上述剂量水平施用于处于发生病症风险中的患者。处于发生特别病症风险中的患者通常包括有病症家族史的那些，或者通过基因测定或筛选确定为特别易感发生病症的那些。

本发明化合物可以作为单独的活性剂施用，或者它们可以与其它活性剂组合施用，包括具有相同或相似治疗活性并且对于此类组合施用确定为安全且有效的其它化合物。在特别的实施方案中，两种(或多种)活性剂的共同施用使得可以显著降低所用的每种活性剂的剂量，从而降低所见的副作用。

在一个实施方案中，本发明化合物与另外的治疗剂共同施用用于治疗和/或预防炎症疾病，特别的活性剂包括但不限于免疫调节剂，例如硫唑嘌呤、皮质类固醇(例如泼尼松龙或地塞米松)、环磷酰胺、环孢素A、他克莫司、麦考酚酸吗乙酯、莫罗单抗-CD3(OKT3，例如)、ATG、阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生和吡罗昔康。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防关节炎(例如类风湿性关节炎)，特别的活性剂包括但不限于镇痛药、非甾体抗炎药(NSAIDS)、类固醇、合成的DMARDS(例如但不限于甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、金诺芬、金硫丁二钠、青霉胺、氯喹、羟氯喹、硫唑嘌呤和环孢素)和生物制品DMARDS(例如但不限于英夫利昔单抗、依那西普、阿达木单抗、利妥昔单抗和阿巴他塞)。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防增殖性病症，具体的活性剂包括但不限于：甲氨蝶呤、亚叶酸(leukovorin)、阿霉素、强的松(prenisone)、博来霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、多西他赛、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、多柔比星、他莫昔芬、托瑞米芬、醋酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗-HER2单克隆抗体(例如Herceptin^TM)、卡培他滨、盐酸雷洛昔芬、EGFR抑制剂(例如Tarceva^TM、Erbitux^TM)、VEGF抑制剂(例如Avastin^TM)、蛋白酶体抑制剂(例如Velcade^TM)、或hsp90抑制剂(例如17-AAG)。另外，本发明化合物可以与其它治疗组合施用，所述的其它治疗包括但不限于放射疗法或手术。在特别的实施方案中，增殖性障碍选自癌症、骨髓增殖性疾病或白血病。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防自身免疫疾病，特别的活性剂包括但不限于：糖皮质激素、细胞增殖抑制剂(例如嘌呤类似物)、烷化剂(例如氮芥(环磷酰胺)、亚硝基脲、铂化合物等)、抗代谢药(例如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤和巯嘌呤)、细胞毒抗生素(例如更生霉素蒽环、丝裂霉素C、博来霉素和普卡霉素)、抗体(例如抗-CD20、抗-CD25或抗-CD3(OTK3)单克隆抗体、和环孢素、他克莫司、雷帕霉素(西罗莫司)、干扰素(例如IFN-β)、TNF结合蛋白(例如英夫利昔单抗(Remicade^TM)、依那西普(Enbrel^TM)或阿达木单抗(Humira^TM))、麦考酚酸酯、芬戈莫德(Fingolimod)和多球壳菌素(Myriocin)。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防移植排斥，特别的活性剂包括但不限于：钙神经素抑制剂(例如环孢素或他克莫司(FK506))、mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抗增殖药(例如硫唑嘌呤、麦考酚酸)、皮质类固醇(例如泼尼松龙、氢化可的松)、抗体(例如单克隆抗-IL-2Rα受体抗体、巴利昔单抗、达克珠单抗)、多克隆抗-T-细胞抗体(例如抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、抗淋巴细胞球蛋白(ALG))。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防哮喘和/或鼻炎和/或COPD，特别的活性剂包括但不限于：β₂-肾上腺素受体激动剂(例如沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、特布他林和比托特罗)、肾上腺素(例如吸入或片剂)、抗胆碱能药(例如异丙托溴铵)、糖皮质激素(例如口服或吸入)、长效β₂-激动剂(例如沙美特罗、福莫特罗、班布特罗和缓释口服沙丁胺醇)、吸入的类固醇和长效支气管扩张剂的组合(例如氟替卡松/沙美特罗、布地奈德/福莫特罗)、白三烯拮抗剂和合成抑制剂(例如孟鲁司特、扎鲁司特和齐留通)、介质释放抑制剂(例如色甘酸盐和酮替芬)、IgE响应的生物调节剂(例如奥马珠单抗)、抗组胺药(例如西替利嗪(ceterizine)、桂利嗪、非索非那定)和血管收缩药(例如羟甲唑啉、赛洛唑啉、萘甲唑啉(nafazoline)和曲马唑啉)。

另外，本发明化合物可以与紧急治疗组合施用用于哮喘和/或COPD，此类治疗包括氧气或氦氧混合气施用、喷雾沙丁胺醇或特布他林(任选与抗胆碱能药(例如异丙托铵)组合)、合成的类固醇(口服或静脉内，例如泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松或氢化可的松)、静脉内沙丁胺醇、非特异性β-激动剂、注射或吸入的(例如肾上腺素、异他林、异丙肾上腺素、奥西那林)、抗胆碱能药(IV或喷雾，例如格隆溴铵、阿托品、异丙托铵)、甲基黄嘌呤(茶碱、氨茶碱、苄胺茶碱)、吸入麻醉药(其具有支气管扩张效果(异氟烷、氟烷、恩氟烷))、氯胺酮和静脉内硫酸镁。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防炎性肠病(IBD)，特别的活性剂包括但不限于：糖皮质激素(例如泼尼松、布地奈德)、合成的缓解疾病的免疫调节剂(例如甲氨蝶呤、来氟米特、柳氮磺吡啶、美沙拉秦、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和环孢素)和生物制品缓解疾病的免疫调节剂(例如英夫利昔单抗、阿达木单抗、利妥昔单抗和阿巴他塞)。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防系统性红斑狼疮(SLE)，特别的活性剂包括但不限于：缓解疾病的抗风湿药(DMARD)例如抗疟疾药(例如羟氯喹(plaquenil)、羟氯喹(hydroxychloroquine))、免疫抑制剂(例如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)、环磷酰胺和麦考酚酸；免疫抑制药物和镇痛药，例如非甾体抗炎药，麻醉剂(例如右丙氧芬和复方可待因扑热息痛(co-codamol))、阿片(例如氢可酮、羟考酮、美施康定(MS Contin)或美沙酮)和芬太尼透皮贴剂。

在一个实施方案中，本发明化合物与其它治疗剂共同施用用于治疗和/或预防银屑病，特别的活性剂包括但不限于：局部疗法例如沐浴溶液剂、润湿剂、含药的乳膏剂和含煤焦油的软膏剂、地蒽酚、皮质类固醇如去羟米松(Topicort^TM)、醋酸氟轻松、维生素D₃类似物(例如卡泊三醇)、Arganoiland类视色素(阿维A酯、阿维A、他扎罗汀)、全身疗法例如甲氨蝶呤、环孢素、类视色素、硫鸟嘌呤、羟基脲、柳氮磺吡啶、麦考酚酸吗乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司、富马酸酯或生物制品例如阿法赛特(Amevive^TM)、依那西普(Enbrel^TM)、阿达木单抗(Humira^TM)、Remicade^TM(英利昔单抗)、瑞体肤(Raptiva^TM)和优特克单抗(ustekinumab^TM)(IL-12和IL-23阻断剂)。另外，本发明化合物可以与其它疗法组合施用，所述的疗法包括但不限于光疗法或光化学疗法(例如补骨脂素和紫外线A光疗法(PUVA))。

共同施用包括给患者递送两种或多种治疗剂的任何方式作为相同治疗方案的部分，这对于技术人员而言是显而易见的。尽管两种或多种活性剂以单个制剂可以同时施用，但这不是必需的。活性剂可以以不同的制剂并且在不同的时间施用。

通用合成方法

通则

应用以下通用方法和操作由易于获得的原料制备本发明化合物和WO2010010190中公开的对比实施例化合物。应该理解当给出典型的或优选的工艺条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)时，除非另外说明，还可以应用其它工艺条件。最佳反应条件可能由于所用的具体反应物或溶剂不同而不同，但是这些条件是本领域技术人员通过常规优化程序可以确定的。

另外，对于本领域技术人员而言显而易见的是，可能需要常规保护基以防止某些官能团进行不希望的反应。选择适合的具体的官能团的保护基以及保护和脱保护的适合条件是本领域众所周知的。例如，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protecting Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护基)，第二版，Wiley，纽约，1991和文中所引的文献中描述了很多保护基及其引入和除去。

以下方法详细描述了制备上文列出的本发明化合物和对比实施例的化合物。本发明化合物和对比实施例的化合物可以通过有机合成领域的技术人员用已知的或市售的原料和试剂制备。

除非另外说明，所有的试剂是商品级的并且收到后未经进一步纯化而使用。市售无水溶剂用于惰性气氛下进行的反应。除非另外说明，试剂级的溶剂用于所有其它情况。柱色谱是在硅胶60(35-70μm)上完成的。薄层色谱是用预涂层的硅胶F-254板(厚度0.25mm)进行的。¹H NMR波谱是在Bruker DPX 400NMR光谱仪(400MHz)上记录的。¹H NMR波谱的化学位移(δ)是以相对于四甲基硅烷(δ0.00)或适合的残留溶剂峰即CHCl₃(δ7.27)作为内标的百万分之几(ppm)报告的。峰裂数是以单峰(s)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)和宽峰(br)给出的。偶合常数(J)是以Hz给出的。电喷雾MS谱是在Micromass平台LC/MS谱仪上获得的。所有LCMS分析所用的柱为：Waters Acquity UPLC BEH C181.7μm，2.1mmID×50mm L(Part No.186002350))。制备HPLC：Waters Xbridge Prep C185μm ODB 19mm ID×100mm L(Part No.186002978)。所有方法应用MeCN/H₂O梯度。H₂O含有0.1％TFA或0.1％NH₃。

下列为试验部分所用的缩略词表：

DCM 二氯甲烷

DiPEA N,N-二异丙基乙基胺

MeCN 乙腈

BOC 叔丁氧基-羰基

DMF N,N-二甲基甲酰胺

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

NMR 核磁共振

DMSO 二甲亚砜

DPPA 二苯基磷酰基叠氮化物

LC-MS 液相色谱-质谱

Ppm 百万分之几

EtOAc 乙酸乙酯

APCI 大气压化学电离

Rt 保留时间

s 单峰

br s 宽的单峰

m 多重峰

d 双峰

PdCl₂dppf [1,1’-二(二苯基膦)二茂铁]二氯钯(II)

TEA 三乙胺

具体实施方式

本发明化合物和对比实施例化合物的合成制备

本发明化合物和对比实施例化合物可以根据以下流程图生产。

通用合成方法

流程图1

其中Ar代表苯基-L1-杂环烷基，其中L1是键、-CH₂-或-–CO-，且杂环烷基是任选取代的。

通则

1.1.1 1-(6-溴-吡啶-2-基)-3-乙酯基-硫脲(2)

在冷却至5℃的2-氨基-6-溴吡啶(1)(253.8g，1.467mol)的DCM(2.5L)溶液中历经15分钟滴加乙氧基羰基异硫氰酸酯(173.0mL，1.467mol)。然后将反应混合物温至室温(20℃)并且搅拌16小时。真空蒸发得到固体，可以将其通过过滤收集，用汽油(3×600mL)彻底洗涤并且空气干燥，得到(2)。该硫脲可以以本身应用于下面的步骤而无需任何纯化。¹H(400MHz,CDCl₃)δ12.03(1H,br s,NH),8.81(1H,d,J 7.8Hz,H-3),8.15(1H,br s,NH),7.60(1H,t,J 8.0Hz,H-4),7.32(1H,dd,J 7.7和0.6Hz,H-5),4.31(2H,q,J 7.1Hz,CH₂),1.35(3H,t,J 7.1Hz,CH₃)。

1.1.2 5-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基胺(3)

在盐酸羟胺(101.8g，1.465mol)的EtOH/MeOH(1:1，900mL)悬浮液中加入N,N-二异丙基乙基胺(145.3mL，0.879mol)，将混合物在室温(20℃)下搅拌1小时。然后加入1-(6-溴-吡啶-2-基)-3-乙酯基-硫脲(2)(89.0g，0.293mol)，将混合物缓慢加热至回流(注意：需要用漂白剂洗涤器(bleachscrubber)猝灭放出的H₂S)。回流3小时后，将混合物冷却并且过滤以收集沉淀的固体物。通过真空蒸发滤液、加入H₂O(250mL)并且过滤收集另外的产物。将合并的固体物依次用H₂O(250mL)、EtOH/MeOH(1:1，250mL)和Et₂O(250mL)洗涤，然后真空干燥，得到固体状的三唑并吡啶衍生物(3)。该化合物可以以本身应用于下面的步骤而无需任何纯化。¹H(400MHz,DMSO-d₆)δ7.43-7.34(2H,m,2×芳族-H),7.24(1H,dd,J 6.8和1.8Hz,芳族-H),6.30(2H,br,NH₂)；m/z 213/215(1:1，M+H⁺，100％)。

1.1.3 单酰化的通用方法，得到中间体(4)：

在5℃，向2-氨基-三唑并吡啶(3)(7.10g，33.3mmol)的干燥CH₃CN(150mL)溶液中加入Et₃N(11.6mL，83.3mmol)，随后加入环丙烷羰基氯(83.3mmol)。然后将反应混合物升至室温并且搅拌，直至所有原料(3)耗尽。如果需要，再加入Et₃N(4.64mL，33.3mmol)和环丙烷羰基氯(33.3mmol)，以确保完全反应。将溶剂真空蒸发后，将产生的残留物用7N甲醇氨溶液(50mL)处理，并且在室温搅拌(持续1-16小时)，以水解任何双-酰化的产物。产物分离是通过真空除去挥发物，随后用Et₂O(50mL)研磨来完成的。将固体物经过滤收集，用H₂O(2×50mL)、丙酮(50mL)和Et₂O(50mL)洗涤，然后真空干燥，以得到所需的溴代中间体(4)。

方法A

通过Suzuki偶联制备本发明化合物(5)：

将适合的硼酸(2当量)加入至溴中间体(4)的1,4-二烷/水(5:1)溶液中。向该溶液中加入K₂CO₃(2当量)和PdCl₂dppf(5％)。然后将产生的混合物在微波中于140℃下加热30分钟(该反应还可以通过在90℃的油浴中、在N₂下常规加热16小时来进行)。加入水并且将溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层经MgSO₄干燥并且真空蒸发。通过快速色谱和制备型HPLC纯化后获得最终的化合物。HPLC：Waters XBridge Prep C185μm ODB 19mmID×100mm L(Part No.186002978)。所有的方法利用MeCN/H₂O梯度。H₂O含有0.1％TFA或0.1％NH₃。

方法B

B1.4 4-[2-(环丙烷羰基-氨基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-5-基]-苯甲酰氯

在N₂气氛下，将2滴DMF加入通过方法A利用4-羧基苯基硼酸得到的4-[2-(环丙烷羰基-氨基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-5-基]-苯甲酸(1当量)的DCM溶液中。然后，将草酰氯(2当量)滴加到得到的溶液(气体释放)中。将该混合物在室温搅拌2小时。经LCMS检测反应完成后，除去溶剂。粗酰氯不经进一步纯化而直接用于下一个步骤。

B2.酰胺形成(通用方法)

在N₂气氛下，将适当的胺(1.1当量)和Et₃N(5当量)溶解在DCM中并在0℃冷却。将溶解在DCM中的酰氯(B1，1当量)滴加到所述溶液中。反应物在室温搅拌16h。16h后，反应完成。将化合物用EtOAc和水萃取、盐水洗涤并经无水MgSO₄干燥。过滤有机层并蒸发。经制备型HPLC分离最终化合物。制备型HPLC：Waters XBridge Prep C185μm ODB 19mmID×100mm L(Part No.186002978)。所有的方法利用MeCN/H₂O梯度。H₂O含有0.1％TFA或0.1％NH₃。

方法C

其中R^3a或R^3b与它们所连接的氮原子一起可形成环烷基。

还原烷基化(通用方法)

将适当的胺(2当量)、通过方法A制备的环丙烷甲酸(例如环丙烷甲酸5-(4-甲酰基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-酰胺)(1当量)和Ti(OPr)₄混合并在室温搅拌3小时。将混合物在乙醇中稀释并加入Na(CN)BH₃(1当量)。将产生的溶液在室温搅拌16小时。将混合物用水稀释并过滤。用乙醇洗涤滤液。真空蒸发合并的溶剂相。通过制备HPLC分离最终的化合物。

方法D

其中R¹和R²与它们所连接的氮原子一起可形成杂环烷基。

烷基化反应

在N₂气氛下，将2-(4-溴甲基-苯基)-4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂环戊硼烷(1当量)和Et₃N(2当量)(或AgCO₃)溶解于DCM/MeOH(4:1v:v)中，并滴加胺(2当量)。将产生的溶液在室温搅拌16h。然后，反应完成。蒸发溶剂，将化合物用EtOAc和水萃取、盐水洗涤并经无水MgSO₄干燥。将有机层过滤并蒸发。经快速色谱分离最终化合物。

Suzuki偶联

将得到的硼酸(2当量)加入至环丙烷甲酸(5-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-酰胺的1,4-二烷/水(5:1)溶液中。在溶液中加入K₂CO₃(2当量)和Pd(dppf)Cl₂(5％)。然后将产生的混合物在微波中于140℃下加热30分钟(还可经传统加热在N₂气氛下在90℃的油浴中加热16h来完成所述反应)。加入水并且将溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层经无水MgSO₄干燥并且真空蒸发。通过快速色谱或者制备HPLC纯化后获得最终化合物。HPLC：Waters XBridge Prep C18 5μm ODB 19mm ID×100mm L(PartNo.186002978)。所有方法应用MeCN/H₂O梯度。H₂O含有0.1％TFA或0.1％NH₃。

本发明化合物和对比实施例化合物的合成

化合物1(本发明化合物)

步骤1：

在N₂气氛下，将2-(4-溴甲基-苯基)-4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂环戊硼烷(1当量)和DIPEA(2当量)溶解于DCM/MeOH(5:1v:v)中，分批加入硫吗啉1,1-二氧化物(2当量)。将产生的溶液在室温搅拌16h。然后，反应完成。蒸发溶剂，将化合物用EtOAc和水萃取、盐水洗涤并经无水MgSO₄干燥。将有机层过滤并蒸发。未经进一步纯化而分离最终化合物。

步骤2：Suzuki偶联

将4-[4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂环戊硼烷-2-基)-苯基]-硫吗啉-1,1-二氧化物(1.1当量)加入到环丙烷甲酸(5-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-酰胺的1,4-二烷/水(4:1)溶液中。向该溶液中加入K₂CO₃(2当量)和PdCl₂dppf(0.03当量)。将产生的混合物在N₂气氛下在90℃的油浴中加热16h。加入水，将溶液用乙酸乙酯萃取。有机层经无水MgSO₄干燥，真空蒸发。经快速色谱纯化后得到最终化合物。

或者，反应完成后，加入钯清除剂如1,2-二(二苯基膦)乙烷，将反应混合物冷却，过滤。将滤饼再在适当的溶剂(如丙酮)中制成浆状物，经过滤分离固体物，用更多的丙酮洗涤，干燥。并将得到的固体物再悬浮于水中，加入HCl水溶液，并在RT搅拌后，将产生的溶液在硅藻土(Celpure P300)上过滤。然后，向滤液中加入NaOH水溶液，并将产生的混悬液在RT搅拌，将固体物经过滤分离，用水洗涤，并经抽吸干燥。最后，将滤饼再溶解于THF/H₂O的混合物中，用钯清除剂(例如SMOPEX 234)在50℃处理，过滤混悬液，真空除去有机溶剂，将产生的浆状物用水和甲醇洗涤，干燥和过筛，以得到标题化合物的游离碱。

化合物1的替代途径(本发明化合物):

步骤1：

将4-(羟甲基)苯基硼酸(1.1当量)加入到环丙烷甲酸(5-溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基)-酰胺的1,4-二氧杂环己烷/水(4:1)溶液中。向该溶液中加入K₂CO₃(2当量)和PdCl₂dppf(0.03当量)。然后将得到的混合物在N₂气氛下于90℃油浴中加热16h。加入水，将溶液用乙酸乙酯萃取。将有机层经无水MgSO₄干燥，真空蒸发。未经进一步纯化而使用得到的混合物。

步骤2：

向环丙烷甲酸[5-(4-羟基甲基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-酰胺的氯仿溶液中缓慢加入三溴化磷(1.0当量)。将反应混合物在室温搅拌20小时，用冰和水(20mL)淬灭，用二氯甲烷萃取。将有机层经无水MgSO₄干燥、过滤并浓缩至干。将产生的白色残留物在二氯甲烷/乙醚2:1中研磨，以得到白色固体状的目标产物。

步骤3：

在N₂气氛下将环丙烷甲酸[5-(4-羟基甲基-苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-2-基]-酰胺(1当量)和DIPEA(2当量)溶解于DCM/MeOH(5:1v:v)中，分批加入硫吗啉1,1-二氧化物(1.1当量)。将产生的溶液在室温搅拌16h。然后，反应完成。蒸发溶剂，将化合物溶解于DCM中，用水洗涤并经无水MgSO₄干燥。将有机层过滤并蒸发。经利用EtOAc的柱色谱分离最终化合物，以得到目标产物。

对比实施例

化合物2

利用通用方法A和4-[4-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]-吗啉制备所述化合物。

化合物3

利用通用方法A和3-(4-吗啉甲基-苯基硼酸频哪醇酯盐酸盐制备所述化合物。

化合物4

利用通用方法A和3-(4-吗啉)吡啶-硼酸频哪醇酯制备所述化合物。

化合物5

利用通用方法A和4-[4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯基]-吗啉制备所述化合物。

化合物6

利用通用方法C和N-甲基-哌嗪制备所述化合物。

化合物7

利用通用方法C和哌啶制备所述化合物。

化合物8

利用通用方法C和哌啶-4-甲酸酰胺制备所述化合物。

化合物9

利用通用方法C和1-哌嗪-1-基-乙酮制备所述化合物。

化合物10

利用通用方法B和硫吗啉1,1-二氧化物制备所述化合物。

化合物11

利用通用方法D和4,4-二氟哌啶制备所述化合物。

下表I中列出了根据本文描述的合成方法已经制备的本发明化合物和对比实施例化合物。表II中给出了本发明化合物和一些对比实施例化合物的NMR光谱数据。

表I

表II：本发明代表性化合物的NMR数据

生物学实施例

实施例1-体外测定

实施例1.1：JAK1抑制测定

重组人JAK1催化域(氨基酸866-1154；目录号08-144)购自CarnaBiosciences。将10ng的JAK1与12.5μg polyGT底物(Sigma目录号P0275)在含有或不含有5μL含受试化合物或介质(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(15mM Tris-HCl pH 7.5、1mM DTT、0.01％Tween-20、10mMMgCl₂、2μM非放射ATP、0.25μCi ³³P-γ-ATP(GE Healthcare，目录号AH9968)终浓度)中，总体积25μL，在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下45分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。应用细胞收集器(Perkin Elmer)将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的(75mM磷酸)96孔滤板(Perkin Elmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，并且将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(Perkin Elmer)进行读数。激酶活性是通过在介质的存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)的存在下获得的cpm而计算的。试验化合物抑制该活性的能力是按如下测定的：

抑制百分数＝((在受试化合物存在下样品测得的cpm－含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm)/(在介质存在下测得的cpm－含有阳性对照抑制剂的样品测得的cpm))*100。

制备化合物的剂量稀释系列，能够测定JAK1分析中剂量－响应反应，计算每种化合物的IC₅₀。每种化合物通常在终浓度为1％的DMSO中在浓度为20μM、随后以1/3系列稀释，以8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行试验。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。

已测定了下述化合物对JAK1的活性，并在下面的表IIIA中列出了IC₅₀值，所述IC₅₀值是利用文中所述的分析测定的。

表IIIA：化合物的JAK1IC₅₀值

化合物编号	JAK1 IC₅₀(nM)
		1	47.07、55.66、50.1、48.29
2	50.91、52.11
		3	291
4	1032
		5	1450
6	3448
		7	504.1
8	435
		9	334.3
10	18.16
		11	7.69

实施例1.2 JAK1 Ki测定分析

为了测定Ki，将不同量的化合物与酶混合，酶反应是ATP浓度的函数。利用Km对化合物浓度的双倒数图(米氏方程与双倒数作图法)测定Ki。该分析中所用的是1ng的JAK1(Invitrogen，PV4774)。底物是50nM的Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(Perkin Elmer，TRF0121)。在含有不同浓度的ATP和化合物的25mM MOPS pH 6.8、0.01％2mM DTT、5mM MgCl₂Brij-35中完成反应。利用Eu-标记的抗磷酸酪氨酸抗体PT66(PerkinElmer，AD0068)测定磷酸化的底物。通过320nm的激发以及随后615nm和665nm的发射在易美逊(envision，Perkin Elmer)上完成读数。

在该分析中测定化合物1时，测得了39nM的Ki值。

实施例1.3 JAK2抑制分析

重组人JAK2催化域(氨基酸808-1132；目录号PV4210)购自Invitrogen。将0.025mU的JAK2与2.5μg polyGT底物(Sigma目录号P0275)在含有或不含有5μL含受试化合物或介质(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(5mM MOPS pH 7.5、9mM MgAc、0.3mM EDTA、0.06％Brij和0.6mM DTT、1μM非放射性ATP、0.25μCi³³P-γ-ATP(GEHealthcare，目录号AH9968)终浓度)中，总体积25μL，在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下90分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。应用细胞收集器(Perkin Elmer)将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的(75mM磷酸)96孔滤板(Perkin Elmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(PerkinElmer)进行读数。激酶活性是通过在介质的存在下获得的cpm减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)的存在下获得的每分钟计数(cpm)而计算的。受试化合物抑制该活性的能力是按如下测定的：

制备化合物的剂量稀释系列，能够测定JAK2分析中剂量－响应反应，计算每种化合物的IC₅₀。每种化合物通常在终浓度为1％的DMSO中在浓度为20μM、随后1/3系列稀释，以8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行试验。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。

已测定了下述化合物对JAK2的活性，在下面的表IIIB中列出了IC₅₀值，所述IC₅₀值是利用文中所述的分析测定的。

表IIIB：化合物的JAK2 IC₅₀值

实施例1.4 JAK2Kd测定分析

以5nM的终浓度使用JAK2(Invitrogen，PV4210)。利用25nM激酶示踪剂236(Invitrogen，PV5592)和2nM Eu-anti-GST(Invitrogen，PV5594)在含有不同浓度的化合物的50mM Hepes pH 7.5、0.01％Brij-35、10mMMgCl₂、1mM EGTA中完成结合试验。根据生产商的方法进行示踪剂检测。

例如，当在该分析中测定化合物1时，测得了205nM的Kd值。

实施例1.5 JAK3抑制测定

重组人JAK3催化域(氨基酸781-1124；目录号PV3855)购自Invitrogen。将0.025mU的JAK3与2.5μg polyGT底物(Sigma，目录号P0275)在含有或不含有5μL含受试化合物或介质(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM Tris pH 7.5、0.5mM EGTA、0.5mM Na₃VO₄、5mMb-磷酸甘油酯、0.01％Triton X-100、1μM非放射性ATP、0.25μCi³³P-γ-ATP(GE Healthcare，目录号AH9968)终浓度)中，总体积25μL，在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下105分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。采用细胞收集器(Perkin Elmer)将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的(75mM磷酸)96孔滤板(PerkinElmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(Perkin Elmer)进行读数。激酶活性是通过在介质的存在下获得的cpm减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)的存在下获得的每分钟计数(cpm)而计算的。受试化合物抑制该活性的能力是按如下测定的：

制备化合物的剂量稀释系列，能够测定JAK3分析中剂量－响应反应，并且计算每种化合物的IC₅₀。每种化合物通常在终浓度为1％的DMSO中在浓度为20μM，随后1/3系列稀释，8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行试验。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。

已测定了下述化合物对JAK3的活性，在下面的表IIIC中列出了IC₅₀值，所述IC₅₀值是利用文中所述的分析测定的。

表VIII：化合物的JAK3 IC₅₀值

实施例1.6 JAK3Ki测定分析

为了测定Ki，将不同量的抑制剂与酶混合，酶反应是ATP浓度的函数。利用Km对化合物浓度的双倒数图(米氏方程与双倒数作图法)测定Ki。以10ng/ml的终浓度使用JAK3(Carna Biosciences，09CBS-0625B)。底物是Poly(Glu,Tyr)钠盐(4:1)，MW 20 000-50 000(Sigma，P0275)。在含有不同浓度的ATP和化合物的25mM Tris pH 7.5、0.01％Triton X-100、0.5mM EGTA、2.5mM DTT、0.5mM Na₃VO₄、5mM b-磷酸甘油酯、10mMMgCl₂中完成反应，加入150mM磷酸终止反应。通过将样品装载到滤板上(利用收集器，Perkin Elmer)并随后洗涤来测定掺入底物polyGT中的磷酸盐。向滤板(Perkin Elmer)加入闪烁液体后，在Topcount闪烁计数器中测定polyGT中掺入的³³P。

例如，当在该分析中测定化合物1时，测得了353nM的Ki值。

实施例1.7 TYK2抑制测定

重组人TYK2催化域(氨基酸871-1187；目录号08-147)购自Carnabiosciences。将5ng的TYK2与12.5μg polyGT底物(Sigma，目录号P0275)在含有或不含有5μL含受试化合物或介质(DMSO，1％终浓度)的激酶反应缓冲液(25mM Hepes pH 7.5、100mM NaCl、0.2mM Na₃VO₄、0.1％NP-40、0.1μM非放射性ATP、0.125μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目录号AH9968)终浓度)中，总体积25μL，在聚丙烯96-孔板(Greiner，V-底)中温育。在30℃下90分钟后，通过加入25μL/孔的150mM磷酸终止反应。应用细胞收集器(Perkin Elmer)将所有终止的激酶反应物转移至预先洗涤的(75mM磷酸)96孔滤板(Perkin Elmer，目录号6005177)中。将板用300μL/孔的75mM磷酸溶液洗涤6次，将板的底部密封。加入40μL/孔的Microscint-20，将板的上部密封，采用Topcount(Perkin Elmer)进行读数。激酶活性是通过在介质存在下获得的每分钟计数(cpm)减去在阳性对照抑制剂(10μM星形孢菌素)存在下获得的cpm而计算的。受试化合物抑制该活性的能力是按如下测定的：

制备化合物的剂量稀释系列，能够测定TYK2分析中剂量－响应反应，计算每种化合物的IC₅₀。每种化合物通常在终浓度为1％的DMSO中在浓度为20μM，随后1/3系列稀释，8个点(20μM-6.67μM-2.22μM-740nM-247nM-82nM-27nM-9nM)进行试验。当化合物系列的效能增加时，制备更多的稀释液和/或降低最高浓度(例如5μM、1μM)。

已测定了下述化合物对TYK2的活性，在下面的表IIID中列出了IC₅₀值，所述IC₅₀值是利用文中所述的分析测定的。

表IIID：化合物的TYK2IC50值

实施例1.8 TYK2Kd测定分析

以5nM的终浓度使用TYK2(Carna Biosciences，09CBS-0983D)。利用50nM激酶示踪剂236(Invitrogen，PV5592)和2nM Eu-anti-GST(Invitrogen，PV5594)在含有不同浓度的化合物的50mM Hepes pH 7.5、0.01％Brij-35、10mM MgCl₂、1mM EGTA中完成结合试验。根据生产商的方法进行示踪剂检测。

例如，当在该分析中测定化合物1时，测得了376nM的Kd值。

实施例2：细胞分析

实施例2.1：JAK-STAT信号传导分析：

1)将HeLa细胞维持在含有10％热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。将Hela细胞在70％汇合时用于转染。在96-孔板中将87μL细胞培养基中20,000个细胞每孔用40ng pSTAT1(2)-荧光素酶报道分子(Panomics)、8ng的LacZ报道分子(作为内对照报道分子)和52ng的pBSK，应用0.32μLJet-PEI(Polyplus)作为转染试剂进行瞬时转染。在37℃、10％CO₂下温育过夜后，除去转染培养基。加入75μL的DMEM+1.5％热灭活胎牛血清。加入15μL 6.7×浓度的化合物达60分钟，然后加入10μL 33ng/mL终浓度的人OSM(Peprotech)。

所有化合物一式两份进行试验，在终浓度0.2％DMSO中，起始20μM，随后1/3系列稀释，总共8个剂量(20μM-6.6μM-2.2μM-740nM-250nM-82nM-27nM-9nM)。

2)在37℃、10％CO₂下温育过夜后，将细胞在100μL裂解缓冲液/孔(PBS、0.9mM CaCl₂、0.5mM MgCl₂、5％海藻糖、0.025％Tergitol NP9、0.15％BSA)中裂解。

通过加入180μLβGal溶液(30μL ONPG 4mg/mL+150μLβ-半乳糖苷酶缓冲液(0.06M Na₂HPO₄、0.04M NaH₂PO₄、1mM MgCl₂))，20分钟后读取40μL细胞裂解液的β-半乳糖苷酶活性。通过加入50μL Na₂CO₃1M终止反应。在405nm处读取吸光度。

根据厂商(Perkin Elmer)说明，采用40μL细胞裂解液加40μL在Envision(Perkin Elmer)上测定荧光素酶活性。

将10μM的全-JAK抑制剂用作阳性对照(100％抑制)。0.5％DMSO用作阴性对照(0％抑制)。阳性和阴性对照用于计算z’和“抑制百分数”(PIN)值。

抑制百分数＝((在介质的存在下测得的荧光－在受试化合物的存在下样品测得的荧光)/(在介质的存在下测得的荧光－不含触发物样品测得的荧光))*100。

将PIN值在剂量-响应曲线中对受试化合物作图，获得EC₅₀值。

表IV

实施例2.2：OSM/IL-1β信号传导分析

3)OSM和IL-1β表现出协同上调人软骨肉瘤细胞系SW1353中的MMP13水平。将细胞以15,000个细胞/孔接种在体积为120μL的含有10％(v/v)FBS和1％青霉素/链霉素(InVitrogen)的DMEM(Invitrogen)的96-孔板中，在37℃、5％CO2下温育。在用15μL OSM和IL-1β浓度达25ng/mL OSM和1ng/mL IL-1β触发前，将细胞与15μL在含有2％DMSO的M199培养基中的化合物预温育1小时，并且触发48小时后在条件培养基中测定MMP13水平。MMP13活性是采用抗体捕获活性分析来测定的。为此目的，将384-孔板(NUNC，460518，MaxiSorb黑色)用35μL的1.5μg/mL抗人MMP13抗体(R&D Systems，MAB511)溶液在4℃下包被24小时。用PBS+0.05％吐温洗涤孔2次后，将剩余的结合位点用100μL在PBS中的5％脱脂奶粉(Santa Cruz,sc-2325,Blotto)在4℃下封闭24小时。接着，将孔用PBS+0.05％吐温洗涤2次，并且加入在100-倍稀释的封闭缓冲液中的35μL 1/10稀释的含MMP13的培养上清液，在室温下温育4小时。接着，将孔用PBS+0.05％吐温洗涤2次，随后通过加入35μL 1.5mM4-氨基苯基醋酸汞(APMA)(Sigma，A9563)溶液并且在37℃下温育1小时进行MMP13活化。将孔再次用PBS+0.05％吐温洗涤，随后加入35μLMMP13底物(Biomol，P-126，OmniMMP荧光底物)。在37℃下温育24小时后，在Perkin Elmer Wallac EnVision 2102多标记读数器(激发波长：320nm，发射波长：405nm)中测定转化底物的荧光。

抑制百分数＝((在介质存在下测得的荧光－在受试化合物存在下样品测得的荧光)/(在介质存在下测得的荧光－不含触发物样品测得的荧光))*100。

例如，当在该分析中测定化合物1时，测得了2242.5(±1098.5)nM的EC₅₀值。

实施例2.3：PBL增殖分析

将人外周血淋巴细胞(PBL)用IL-2刺激并且采用BrdU掺入分析测定增殖。首先，将PBL用PHA刺激72小时以诱导IL-2受体，禁食(fasted)24小时以终止细胞增殖，随后用IL-2再刺激72小时(包括24小时BrdU标记)。将细胞与受试化合物预温育1小时，然后加入IL-2。将细胞在含10％(v/v)FBS的RPMI 1640中培养。

实施例2.4 全血分析(WBA)

2.4.1 IFN 　刺激的实验设计

为了预测受试化合物抑制JAK1或JAK2相关的体内信号传导通路，利用人全血形成了生理学相关的体外模型。在WBA分析中，将从知情同意的人类志愿者抽取的血液离体用化合物处理(1h)，随后用干扰素α(IFNα，JAK1依赖通路)刺激30分钟或者用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，JAK2依赖通路)刺激2h。

2.4.1.1 磷光体–STAT1分析

对于IFNα而言，利用pSTAT1ELISA分析测定白血细胞提取物中经IFNα的信号转导与转录激活子-1的磷酸化(pSTAT1)增加。干扰素α(IFNα)触发后的信号转导与转录激活子-1的磷酸化是JAK1-介导的事件。研发了用于测定细胞提取物中磷酸化-STAT1水平的磷酸化-STAT1分析，以评价抑制JAK1-依赖信号传导通路的化合物的能力。

从知情同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理(1h)，随后用IFNα刺激30分钟。利用磷酸化-STAT1ELISA测定白血细胞提取物中经IFNα的STAT1的磷酸化增加。

ACK裂解缓冲液由0.15M NH₄Cl、10mM KHCO₃、0.1mM EDTA构成。缓冲液的pH是7.3。

将10×细胞裂解缓冲液浓缩物(购自Cell Signaling的部分PathScanPhospho-STAT1(Tyr701)夹心ELISA试剂盒)用水稀释10倍。使用前向缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。

将20μg IFNα溶解在40μL H₂O中，以获得500μg/mL储备液。将储备液于-20℃贮存。

在DMSO中制备化合物的3倍系列稀释液(最高浓度：10mM)。随后，将化合物再在培养基中稀释(稀释倍数取决于所需的化合物终浓度)。

2.4.1.1.1 含有化合物并用IFNα刺激的血液的温育

在加肝素的试管中收集人血。将血液分成392μL的等份。然后，向各等份中加入4μL化合物稀释液，将血液样品在37℃温育1h。将IFNα储备溶液在RPMI培养基中稀释1000-倍，以得到500ng/mL的工作液。将4μL的500ng/mL工作液加入到血液样品中(IFNα的终浓度：5ng/ml)。将样品在37℃温育30min。

2.4.1.1.2 细胞提取物的制备

在刺激末期，将7.6mL ACK缓冲液加入到血液样品中，以裂解血红细胞。通过倒置试管5次，将样品混合，将反应物在冰上培育5min。培育期间，RBC的裂解应该是明显的。通过在300g、4℃离心7min将细胞沉淀，除去上清液。将10mL 1×PBS加入到各试管中，将细胞沉淀物再悬浮。将样品在300g、4℃再离心7min。除去上清液，将沉淀物再悬浮在500μL的1×PBS中。然后，将细胞混悬液转移至透明的1.5mL微量离心管中。通过在4℃于700g离心5min来沉淀细胞。除去上清液，将沉淀物溶解在150μL细胞裂解缓冲液中。将样品在冰上培育15min。然后，将样品贮存在-80℃，直至进一步处理。

2.4.1.1.3 经ELISA测定STAT1的磷酸化

将购自Cell Signaling(目录号：#7234)的Pathscan Phospho-STAT1(Tyr701)夹心ELISA试剂盒用于测定Phospho-STAT1的水平。

在冰上解冻细胞提取物。将试管在16,000g、4℃离心5min，收集透明的溶解产物。同时，将试剂盒的微孔板条平衡至室温，通过在H₂O中稀释20×洗涤缓冲液来制备洗涤缓冲液。将样品在样品稀释剂中稀释2倍，将100μL加入到微孔板条中。将板条在4℃培育过夜。

第二天，将孔用洗涤缓冲液洗涤3次。向孔中加入100μL的检测抗体。将板条在37℃培育1h。然后，将孔用洗涤缓冲液再洗涤3次。向各孔中加入100μL HRP-酶标二抗，并在37℃培育样品。30min后，将孔再洗涤3次，向所有孔中加入100μL TMB底物。当样品变蓝时，加入100μL STOP溶液终止反应。在450nm测定吸收。

2.4.1.2 数据分析

细胞提取物中IFNα诱导的phosphoSTAT1的抑制对化合物浓度作图，并利用Graphpad软件得到IC₅₀值。如果R²比0.8大且斜率比3小，则数据保留。

2.4.1.2 IL-8ELISA

对于GM-CSF刺激，利用IL-8 ELISA分析测定血浆中白细胞介素-8(IL-8)水平的增加。粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)-诱导的白细胞介素8(IL-8)表达是JAK2-介导的事件。研发了可用于测定血浆样品中IL-8水平的IL-8 ELISA，以评价化合物抑制JAK2-依赖信号传导途径的能力。

从知情同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理(1h)，随后用GM-CSF刺激2h。利用IL-8ELISA分析测定血浆中IL-8水平的增加。

将10μg GM-CSF溶解在100μL H₂O中，以获得100μg/mL的储备液。将储备液于-20℃贮存。

在DMSO中制备化合物的3倍系列稀释物(最高浓度：10mM)。随后，将化合物再在培养基中稀释(稀释倍数取决于所需的化合物终浓度)。

2.4.1.2.1 含有化合物并用GM-CSF刺激的血液的温育

在加肝素的试管中收集人血。将血液分成245μL的等份。然后，向各等份中加入25μL化合物稀释液，将血液样品在37℃温育1h。将GM-CSF储备溶液在RPMI培养基中稀释100-倍，以得到1μg/mL的工作液。将2.5μL的1μg/mL工作液加入到血液样品中(GM-CSF的终浓度：10ng/ml)。将样品在37℃温育2h。

2.4.1.2.2 血浆样品的制备

将样品在1,000g、4℃离心15min。收集100μL血浆，于-80℃贮存，直到再次使用。

2.4.1.2.3 经ELISA测定IL-8水平

将购自R&D Systems(目录号：Q8000B)的人IL-8化学发光免疫测定试剂盒用于测定IL-8水平。

通过在H₂O中稀释10×洗涤缓冲液来制备洗涤缓冲液。在使用前4小时，通过将1份光亮试剂(Glo Reagent)1加入到2份光亮试剂B中制备工作光亮试剂。

向孔中加入100μL分析稀释剂RD1-86。然后，加入50μL样品(血浆)。将ELISA板在室温、500rpm温育2h。用洗涤缓冲液洗涤所有孔4次，并向所有孔中加入200μL IL-8共轭物。在室温温育3h后，将孔用洗涤缓冲液洗涤4次，并向所有孔中加入100μL工作光亮试剂。将ELISA板在室温(避光)温育5min。测定发光(0.5s/孔读取时间)。

2.4.1.3 结果

例如，当进行所述试验设计时，化合物1抑制INFα诱导的pSTAT1水平增加的pIC₅₀是6.23±0.15(SEM)，这表明化合物可有效抑制生理环境中的JAK1通路。

2.4.2 IL-6刺激方案

还利用人全血完成流式细胞分析，以确定化合物离体对JAK1的选择性高于JAK2。因此，从知情同意的人类志愿者抽取血液。然后，将血液在轻微振动下于37℃平衡30分钟，接着在Eppendorf试管中进行等分。加入不同浓度的化合物，并在轻微振动下于37℃温育30分钟，随后对于JAK1-依赖通道刺激来讲，在轻微振动下于37℃用白细胞介素6(IL-6)刺激20分钟或者对于JAK2-依赖通道刺激来讲，在轻微振动下于37℃用GM-CSF刺激20分钟。然后，利用FACS分析评价Phospho-STAT1和phospho-STAT5。

2.4.2.1 Phospho–STAT1分析

对于IL-6-刺激的白血细胞中信号转导与转录激活子-1(pSTAT1)的磷酸化增加，从知情同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理30min，随后用IL-6刺激20分钟。通过FACS利用抗磷酸化-STAT1抗体测定淋巴细胞中经IL-6的STAT1磷酸化的增加。

将5×溶解/固定缓冲液(BD PhosFlow，目录号558049)用蒸馏水稀释5倍，在37℃预热。弃去剩余的稀释的溶解/固定缓冲液。

将10μg rhIL-6(R&D Systems，目录号206-IL)溶解于1ml的PBS0.1％BSA中，以获得10μg/ml的储备液。将储备液在-80℃等份贮存。

在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备液)。对照处理的样品加入DMSO，而不是化合物。所有样品用1％终浓度的DMSO温育。

2.4.2.1.1 含有化合物并用IL-6刺激的血液的温育

在加肝素的试管中收集人血。将血液分成148.5μl的等份。然后，向各等份中加入1.5μl化合物稀释液，并将血液样品在轻微摇动下于37℃温育30min。向血液样品中加入IL-6储备液(1.5μl)(终浓度10ng/ml)，并将样品在轻微摇动下于37℃温育20min。

2.4.2.1.2 全血细胞制备和CD4标记

在刺激末期，将3ml预加热的1×溶解/固定缓冲液立即加入到血浆样品中、快速旋转摇动并在水浴中于37℃温育15min，以溶解血红细胞并固定白细胞，然后在-80℃冷冻，直至进一步使用。

对于下面的步骤，在37℃将试管融解大约20分钟，并在400g于4℃离心5min。将细胞沉淀物用3mL冷的1×PBS洗涤，在离心后，将细胞沉淀物再悬浮于100μL含有3％BSA的PBS中。加入FITC-轭合的抗-CD4抗体或者对照FITC-轭合的同种型抗体，在黑暗中于室温温育20min。

2.4.2.1.3 细胞透化并用Phospho-STAT1抗体标记

用1×PBS洗涤细胞后，将细胞沉淀物再悬浮于100μl冰冷的1×PBS中，加入900μl冰冷的100％甲醇。然后，将细胞在4℃温育30min，以透化。

然后，将透化的细胞用含有3％BSA的1×PBS洗涤，并最终悬浮于含有3％BSA的80μl 1×PBX中。

加入20μL PE鼠抗-STAT1(pY701)或者PE鼠IgG2aκ同种型对照抗体(BD Biosciences，目录号分别是612564和559319)，混合，接着在黑暗中于4℃温育30min。

然后，将细胞用1×PBS洗涤，在FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences)上分析。

2.4.2.1.4 在FACSCanto II上的荧光分析

计数50,000个总事件，并在CD4+细胞设门控后，测定淋巴细胞门控中的Phospho-STAT1阳性细胞。利用FACSDiva软件分析数据，数据相应于根据CD4+细胞上对phospho-STAT1阳性的细胞百分数计算的IL-6刺激抑制百分数。

2.4.2.2 Phospho–STAT5分析

对于GM-CSF-刺激的白血细胞中信号转导与转录激活子5磷酸化的增加，从知情同意的人类志愿者抽取的人全血离体用化合物处理30min，并随后用GM-CSF刺激20分钟。通过FACS利用抗磷酸化-STAT5抗体测定单核细胞中经GM-CSF的STAT5磷酸化增加。

将10μg rhGM-CSF(AbCys S.A.，目录号P300-03)溶解于100μl的PBS0.1％BSA中，以获得10μg/ml的储备液。将储备液在-80℃等份贮存。

在DMSO中制备化合物的3倍稀释系列(10mM储备液)。对照处理的样品加入DMSO，而无任何受试化合物。所有样品用1％终浓度的DMSO温育。

2.4.2.2.1 含有化合物并用GM-CSF刺激的血液的温育

在加肝素的试管中收集人血。将血液分成148.5μl的等份。然后，向各等份中加入1.5μl化合物稀释液，并将血液样品在轻微摇动下于37℃温育30min。向血液样品中加入GM-CSF储备液(1.5μl)(终浓度20pg/ml)，并将样品在轻微摇动下于37℃温育20min。

2.4.2.2.2 全血细胞制备和CD14标记

在刺激末期，将3ml预温热的1×溶解/固定缓冲液立即加入到血浆样品中、快速旋转摇动并在水浴中于37℃温育15min，以溶解血红细胞并固定白细胞，然后在-80℃冷冻，直至进一步使用。

对于下面的步骤，在37℃将试管融解大约20分钟，并在400g于4℃离心5min。将细胞沉淀物用3mL冷的1×PBS洗涤，并在离心后，将细胞沉淀物再悬浮于100μL含有3％BSA的PBS中。加入FITC鼠抗-CD14抗体(BD Biosciences，目录号345784)或者对照FITC鼠IgG2bκ同种型抗体，并在黑暗中于室温温育20min。

2.4.2.2.3 细胞透化并用Phospho-STAT5抗体标记

加入20μL PE鼠抗-STAT5(pY694)或者PE鼠IgG2aκ同种型对照抗体(BD Biosciences，目录号分别是612567和554680)，混合，接着在黑暗中于4℃温育30min。

然后，将细胞用1×PBS洗涤一次，并在FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences)上分析。

2.4.2.2.4 在FACSCanto II上的荧光分析

计数50,000个总事件，并在CD14+细胞设门控后，测定Phospho-STAT5阳性细胞。利用FACSDiva软件分析数据，数据相应于根据CD4+细胞上对phospho-STAT5的阳性细胞百分数计算的GM-CSF刺激抑制百分数。

2.4.2.3 结果

当进行所述试验设计时，对各个受试化合物来讲，测定从3个健康志愿者平均值得到的抑制百分数(PIN)。例如，测定化合物1，得到STAT1磷酸化抑制中的pIC₅₀＝6.08。

实施例3：体内模型

实施例3.1：CIA模型

3.1.1 材料

完全Freund佐剂(CFA)和不完全Freund佐剂(IFA)购自Difco。II型牛胶原(CII)、脂多糖(LPS)和Enbrel分别购自Chondrex(Isle d’Abeau，法国)、Sigma(P4252,L’Isle d’Abeau，法国)、Whyett(25mg注射器，法国)Acros Organics(Palo Alto，CA)。所用的所有其它试剂是试剂级并且所有溶剂是分析级。

3.1.2 动物

黑色刺鼠(雄性，7-8周龄)从Harlan Laboratories(Maison-Alfort，法国)获得。使大鼠经历12小时的明/暗周期(0700-1900)。温度维持在22℃，随意提供食物和水。

3.1.3 胶原诱导的关节炎(CIA)

试验前一天，用0.05M乙酸配制CII溶液(2mg/mL)并且在4℃下贮存。在免疫前即刻，将等体积的佐剂(IFA)和CII通过匀化器在预冷的玻璃瓶中、在冰水浴中混合。如果没有形成乳状液，需要另外的佐剂和延长匀化。第一天在每只大鼠的尾巴根部皮内注射0.2mL乳状液，第9天进行第二次加强剂量皮内注射(2mg/mL的CII溶液在CFA 0.1mL盐水中)。该免疫方法是由公开的方法(Sims等人，2004；Jou等人，2005)改良的。

3.1.4 研究设计

受试化合物的治疗效果是在大鼠CIA模型中试验的。将大鼠随机分入相同的组中，每组包括10只动物。将所有大鼠在第1天免疫并且在第9天加强剂量。治疗剂量从第16天持续到第30天。阴性对照组是用介质(MC0.5％)处理的，阳性对照组是用Enbrel(10mg/kg，3×周)处理。通常在3个剂量下对目标化合物进行试验，例如口服3、10、30mg/kg。

3.1.5 关节炎的临床评价

根据Khachigian 2006；Lin等人,2007和Nishida等人,2004的方法对关节炎进行评分。四爪各自的肿胀是根据如下关节炎评分来排列的：0－没有症状；1－轻度，但是一种类型的关节(例如踝或腕)出现明显的发红和肿胀，或者明显的发红和肿胀限于单个指(趾)，不管受侵袭指(趾)的数目多少；2－两种或多种类型的关节出现中度发红和肿胀；3－整个爪(包括指(趾))出现严重发红和肿胀；4－最重发炎的肢，涉及多个关节(每只动物最高累积的临床关节炎得分为16)(Nishida等人,2004)。

为了进行多项研究的荟萃分析，临床评分标准如下：

临床评分的AUC(AUC评分)：计算各个大鼠第1天至第14天的曲线下面积(AUC)。本项研究中，每只个体动物的AUC除以从介质得到的平均AUC，由此得到所述动物的数据并乘以100(即将AUC表示为每项研究的平均介质AUC的百分数)。

从第1天至第14天的临床评分增加(结束点评分)：本项研究中，个体动物的临床评分差除以从介质得到的平均临床评分差，由此得到所述动物的数据并乘以100(即将差表示为每项研究的平均介质临床评分差的百分数)。

3.1.6 关节炎发作后的体重变化(％)

在临床上，体重减轻与关节炎有关(Shelton等人，2005；Argiles等人，1998；Rall，2004；Walsmith等人，2004)。因此，关节炎发作后体重变化可以用作非特异性端点(endpoint)，用于评价大鼠模型中的治疗效果。如下计算关节炎发作后体重的变化(％)：

小鼠：

大鼠：

3.1.7 放射学

拍摄每只个体动物的后爪的X-射线照片。随机盲选的身份号分配给每张照片，骨侵蚀的严重度是通过两种独立的记分排列的，应用放射学Larsen记分系统如下：0-正常，具有完整的骨轮廓和正常的关节间隙；1－轻度异常，任何一个或两个外部跖骨显示出轻度骨侵蚀；2－明显的早期异常，任何3至5个外部跖骨显示出骨侵蚀；3－中度破坏性异常，所有外部跖骨以及任何一个或两个内部跖骨显示出明显的骨侵蚀；4－严重破坏性异常，所有跖骨显示出明显的骨侵蚀并且至少一个内部跖关节完全侵蚀，留下部分保留的某些骨关节轮廓；5－残毁性异常，没有骨质轮廓。该记分系统是由Salvemini等人,2001；Bush等人,2002；Sims等人,2004；Jou等人,2005改良的。

3.1.8 组织学

放射学分析后，将小鼠的后爪固定在10％磷酸盐缓冲福尔马林(pH 7.4)中，为了精细的组织学，用快速骨脱钙剂脱钙(Laboratories Eurobio)并且包埋在石蜡中。为了确保深入评价关节炎关节，切割至少4个系列切片(5μm厚)，并且每个系列的切片两端之间是100μm。将切片用苏木精和伊红(H&E)染色。滑液炎症以及骨和软骨损伤的组织学检测是双盲进行的。在每个爪中，用4-点等级评价4个参数。这些参数是细胞渗透、血管翳严重性、软骨侵蚀和骨侵蚀。评分是如下进行的：1－正常，2－轻度，3－中度，4－显著。将这4个评分相加并且表示为另一个得分，即“RA总得分”。

3.1.9 跟骨(足跟骨)的微-计算机体层摄影术(μCT)分析

RA中观察到的骨退化特别是出现在骨皮质中，可以通过μCT分析来显示(Sims NA等人，Arthritis Rheum.50(2004)2338-2346：Targetingosteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction incollagen-induced arthritis(用唑来膦酸靶向破骨细胞，防止胶原诱导的关节炎中的骨破坏)；Oste L等人，ECTC Montreal 2007：A high throughputmethod of measuring bone architectural disturbance in a murine CIAmodel by micro-CT morphometry(通过显微-CT形态测定法测定鼠CIA模型中骨结构紊乱的高通量方法)。跟骨扫描和3D体积重建后，以每个片层出现的分散目标的数目测定骨退化，所述的片层是在垂直于骨纵轴方向在硅中分离的。骨退化的越多，测定到的分散目标越多。分析了1000个片层，沿根骨均匀分布(间隔约10.8μm)。

3.1.10 稳态PK

在第7或11天，用肝素铝作为抗凝剂在球后窦穴按照下列时间点收集血样：给药前、1、3和6小时。将全血样品离心，将得到的血浆样品在分析前贮存于-20℃。用LC-MS/MS方法测定各个受试化合物的血浆浓度，其中质谱在正电喷雾模式操作。利用美国)计算药代动力学参数，并假设给药前血浆水平等于24小时的血浆水平。

下面表V总结了所得到的本发明化合物和对比实施例化合物的几个PK参数结果，结果表明本发明化合物可以改善PK性能(例如Cmax，T1/2)。

表V

3.1.11 结果

下面表VI总结了在大鼠CIA模型中得到的化合物1和2的结果，“*”表示在评分中具有统计学上的显著改善，p 0.05，相对于未治疗的对照。

表VI

$-“临床评分”指化合物1所得的标准的AUC评分/标准的结束点评分和化合物2所得的AUC评分/结束点评分。

在0.1mg/kg剂量下，化合物1于标准临床评分值(以AUC表示或者以第1天至第14天的差表示)中显示统计学上的显著改进。此外，分别在0.3mg/kg和3mg/kg剂量观察到爪肿胀读数和Larsen评分中的显著统计学增加。相反，化合物2仅在10mg/kg剂量的标准临床评分值(在第14天)中观察到显著统计学增加。此外，在30mg/kg剂量观察到脚爪肿胀读数和Larsen评分中的显著统计学增加。因此，当比较口服剂量时，化合物1在功效方面显示高于化合物2的100倍改善。具体地讲，化合物1在3mg/kg的剂量下，在所有测定中观察到统计学上地显著改善，然而，更高剂量的化合物2才能引起临床评分方面的统计学上的显著改善。这种体内效能方面的改善不是由于提高化合物的浓度引起的，因为显而易见，与10mg/kg/天的化合物2相比，化合物1在0.1、0.3和1mg/kg/天时的AUC(0-24h)更低。

实施例3.2 脓毒性休克模型

注射脂多糖(LPS)诱导可溶性肿瘤坏死因子(TNF-α)快速释放入外周。该模型用于体内分析TNF释放的有希望的阻断剂。

将每组6只BALB/cJ雌性小鼠(20g)在设定的剂量下口服处理一次。30分钟后，腹膜内注射LPS(15μg/kg；大肠杆菌血清型0111:B4)。90分钟后，将小鼠安乐死并且采血。用市售的ELISA试剂盒测定循环TNF-α水平。将地塞米松(5μg/kg)用作参考抗炎化合物。所选的化合物是在一个或多个剂量下试验的，例如口服3和/或10和/或30mg/kg。

在口服30mg/kg剂量下化合物1、2和10是有活性的。

实施例3.3 MAB模型

MAB模型提供快速评价治疗对RA-样炎性响应的调节(Kachigian LM.Nature Protocols(2006)2512-2516:Collagen antibody-induced arthritis(胶原抗体诱导的关节炎))。将DBA/J小鼠静脉内注射直接对抗胶原II的mAbs的混合剂。1天后，开始用化合物处理(介质：10％(v/v)HPβCD)。3天后，小鼠接受腹膜内注射LPS(50μg/小鼠)，导致炎症的快速发作。继续用化合物处理，直至mAB注射后10天。通过测定爪肿胀并且记录每只爪的临床得分来表示炎症。四肢的累积临床关节炎得分表示炎症的严重性。评分系统应用于各肢，应用0－4的等级，4表示最严重的炎症。

0 无症状

1 轻度，但是一种类型的关节(例如踝或腕)出现明显的发红和肿胀，或者明显的发红和肿胀限于单个指(趾)，不管受侵袭指(趾)的数目为何

2 两种或多种类型的关节出现中度发红和肿胀

3 整个爪(包括指(趾))出现严重发红和肿胀

4 最重发炎的肢，涉及多个关节

实施例3.4 肿瘤学模型

Wernig等人,Cancer Cell 13,311,2008和Geron等人,Cancer Cell 13,321,2008描述了用于确证小分子对JAK2-驱动的骨髓增殖性疾病的作用的体内模型。

实施例3.5 小鼠IBD模型

Wirtz等人,2007描述了用于确证小分子对IBD的作用的体外和体内模型。

实施例3.6 小鼠哮喘模型

Nials等人,2008；Ip等人,2006；Pernis等人,2002；Kudlacz等人,2008描述了用于确证小分子对哮喘的作用的体外和体内模型。

实施例4：药物动力学、DMPK和毒性模型

实施例4.1 热力学溶解度

在室温下，在玻璃瓶中将1mg/mL的受试化合物溶液配制在0.2M磷酸盐缓冲液pH 7.4或0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 3.0中。

在室温下，将样品在旋转驱动器STR 4(Stuart Scientific，Bibby)中以3.0速度旋转24小时。

24小时后，将800μL样品转移至eppendorf管中并且以14000rpm离心5分钟。然后将200μL样品上清液转移至MultiscreenR溶解度板(Millipore,MSSLBPC50)中，将上清液通过多头抽真空装置过滤(10-12”Hg)至干净的Greiner聚丙烯V底96-孔板(目录号651201)中。将5μL滤液稀释在95μL(F20)与在包含标准曲线的板中温育时所用的缓冲液相同的缓冲液中(Greiner，目录号651201)。

化合物的标准曲线新配制在DMSO中，从10mM DMSO储备液开始，以因子2稀释在DMSO(5000μM)中，然后进一步稀释在DMSO中，至多19.5μM。然后将3μL由5000μM产生的稀释系列转移至97μL乙腈-缓冲液混合物(50/50)中。终浓度范围是2.5至150μM。

将板用密封材料(MA96RD-04S，www.kinesis.co.uk)密封，将样品在室温下、在LCMS(ZQ 1525，Waters)上、在优化条件下测定，应用Quanoptimize测定分子的适合质量。

将样品在流速为1mL/分钟的LCMS上分析。溶剂A是15mM氨，溶剂B是乙腈。样品在Waters的XBridge C183.5μM(2.1×30mm)柱上、在正离子喷雾法下展开。溶剂梯度是2分钟的总运行时间，范围为5％B至95％B。

用Masslynx软件包分析峰面积，并且将样品的峰面积对标准曲线作图以获得化合物的溶解度。

溶解度值以μM或μg/mL报告。

实施例4.2 水溶解度

从10mM在DMSO中的储备液开始，在DMSO中制备化合物的系列稀释。将稀释系列转移至96NUNC Maxisorb板F底(目录号442404)中，在室温下加入0.2M磷酸盐缓冲液pH 7.4或0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 3.0。

终浓度范围为200μM至2.5μM，5个等比稀释步骤。最终的DMSO浓度不超过2％。在每个96-孔板的角落点中加入200μM芘，并且用作显微镜上校准Z轴的参考点。

将分析板密封并且在37℃下温育1小时，同时以230rpm振摇。然后将板在白光显微镜下扫描，得到每个浓度沉淀物的单独图片。对沉淀物进行分析并且转换成数值，将其绘制成图。化合物出现完全溶解的第一个浓度是下面报告的浓度，但是真实的浓度位于该浓度与一个更高的稀释步骤的浓度之间。

溶解度值以μg/mL报告。

表VII

化合物编号	pH 3.0(μg/mL)	pH 7.4(μg/mL)
			1	>85	>85
2	>38	>38
			10	>87.9	>87.9

实施例4.3 血浆蛋白结合(平衡透析)

将10mM化合物的DMSO储备液以因子5稀释在DMSO中。将该溶液进一步稀释在新鲜解冻的人、大鼠、小鼠或狗血浆(BioReclamation INC)中，终浓度为10μM，最终DMSO浓度为0.5％(5.5μL在1094.5μL血浆中，在PP-Masterblock 96-孔(Greiner，目录号780285)中)。

制备含嵌入物的Pierce Red Device板(ThermoScientific，目录号89809)，在缓冲液槽中装入750μL PBS并且在血浆槽中装入500μL加标血浆。将板在37℃下温育4小时并以230rpm振摇。温育后，将两个槽中120μL转移至96-孔圆底、PP深孔板(Nunc，目录号278743)的360μL乙腈中并用铝铂盖密封。将样品混合并且在冰上放置30分钟。然后将该板在4℃下以1200rcf离心30分钟，将上清液转移至96-孔v底PP板(Greiner，651201)中，用于LCMS分析。

将该板用www.kinesis.co.uk的密封材料(MA96RD-04S)密封，将样品在室温下、在LCMS(ZQ 1525，Waters)上、在优化条件下进行测定，应用Quanoptimize测定分子的适合质量。

缓冲液槽和血浆槽中化合物的峰面积被认为是100％化合物。结合血浆的百分数由这些结果产生并且作为结合血浆的百分数报告。

通过显微镜检查PBS中最终试验浓度的化合物的溶解度，以确定是否观察到沉淀。

表VIII

化合物编号	人(％)	大鼠(％)
			1	76.4	65.7
2	70.5	64.5
			10	n/a	51
11	91.25	76.5

实施例4.4 微粒体的稳定性

将DMSO中的10mM化合物的储备液在96深孔板(Greiner，目录号780285)中、在182mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中稀释1000倍，在37℃预温育。

将40μL去离子水加入至聚丙烯Matrix 2D条形码标记的存储管(Thermo Scientific)的孔中，在37℃预温育。

在182mM磷酸盐缓冲液pH 7.4中配制葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)工作储备液，并且在应用前放置在冰上。在去离子水中配制包含MgCl₂、葡萄糖-6-磷酸和NADP+的辅因子，在应用前放置在冰上。

配制包含目标物种(人、小鼠、大鼠、狗)的肝微粒体(Xenotech)、先前描述的G6PDH和辅因子的最终工作溶液，将该混合物在室温下温育不超过20分钟。

将30μL预热的化合物稀释液加入至Matrix管的40μL预热的水中，加入30μL微粒体混合物。最终反应浓度是3μM化合物、1mg微粒体、0.4U/mL GDPDH、3.3mM MgCl₂、3.3mM葡萄糖-6-磷酸和1.3mMNADP+。

为测定零时间点的剩余化合物的百分数，在加入微粒体混合物前向孔中加入MeOH或ACN(1:1)。将板用Matrix Sepra sealsTM(Matrix，目录号4464)密封并且震摇数秒，确保所有组分完全混合。

将没有终止的样品在37℃、300rpm下温育，温育1小时后，用MeOH或ACN(1:1)终止反应。

终止反应后，将样品混合并且在冰上放置30分钟以沉淀蛋白质。然后将板在4℃下以1200rcf离心30分钟，并且将上清液转移至96-孔v底PP板(Greiner，651201)中用于LCMS分析。

将这些板用www.kinesis.co.uk的密封材料(MA96RD-04S)密封，并且将样品在室温下、在LCMS(ZQ 1525，Waters)上、在优化条件下测定，应用Quanoptimize测定母分子的适合的质量。

将样品在流速为1mL/分钟的LCMS上分析。溶剂A是15mM氨，溶剂B是甲醇或乙腈，这取决于所用的终止溶液。样品在Waters的XBridgeC18 3.5μM(2.1×30mm)柱上、在正离子喷雾法下展开。溶剂梯度是2分钟的总运行时间，范围为5％B至95％B。

0时间点的母化合物的峰面积被认为是100％剩余。1小时温育后剩余百分数是从0点时间计算的，计算成剩余百分数。通过显微镜检查缓冲液中最终试验浓度的化合物的溶解度，报告结果。

微粒体稳定性的数据表示为60分钟后剩余化合物总量的百分数。

表IX

化合物编号	人(％)	大鼠(％)
			1	87.2	65.6
2	73	38
			10	102	89
11	51	26

实施例4.5 Caco2渗透率

如下所述进行双向Caco-2分析。Caco-2细胞取自欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)(ECACC，目录号86010202)，细胞培养21天后在24-孔Transwell板(Fisher TKT-545-020B)中应用。

将2×10⁵个细胞/孔接种在含有DMEM+GlutaMAXI+1％NEAA+10％FBS(FetalClone II)+1％Pen/Strep的平面培养基中。每隔2-3天更换培养基。

将试验和参考化合物(普萘洛尔和罗丹明123或长春碱，均购自Sigma)配制在含有25mM HEPES(pH7.4)的Hanks平衡盐溶液中，并且在浓度为10μM(最终DMSO浓度为0.25％)下加入至Transwell板装置的顶端槽(125μL)或底外侧槽(600μL)中。

将50μM荧光黄(Sigma)加入至所有孔的供体缓冲液中，通过监测荧光黄渗透来评价细胞层的完整性。由于荧光黄(LY)不能自由透过脂类屏障，所以高度的LY转运表示细胞层较差的完整性。

在37℃下温育1小时，同时以150rpm在定轨摇床上震摇后，从顶端槽(A)和底部槽(B)中各取出70μL，加入至在96孔板中的100μL含有分析内标(0.5μM卡马西平)的50:50乙腈:水溶液中。

在包含取自底外侧和顶侧的150μL液体的干净96孔板中用Spectramax Gemini XS(Ex为426nm，Em为538nm)进行荧光黄测定。

通过高效液相色谱/质谱(LC-MS/MS)测定样品中化合物的浓度。

通过下面关系式计算表观渗透率(P_app)值：

P_app＝[化合物]_受体最终×V_受体/([化合物]_供体最初×V_供体)/T_温育×V_供体/表面积×60×10^-6cm/s

V＝槽的体积

T_inc＝温育时间

表面积＝0.33cm²

应用P_appB>A/P_appA>B的比值计算流出比，该流出比为顶端细胞表面主动流出的一个指标。

应用下面分析接受标准：

普萘洛尔：P_app(A>B)值≥20(×10^-6cm/s)

罗丹明123或长春碱：P_app(A>B)值<5(×10^-6cm/s)并且流出比≥5。

荧光黄渗透率：≤100nm/s

表X

实施例4.6 啮齿动物中的药物代谢动力学研究

4.6.1 动物

Sprague-Dawley大鼠(雄性，5－6周龄)获自Janvier(法国)。治疗前将大鼠驯化至少7天，并进行12小时的明/暗周期(0700-1900)。温度维持在大约22℃，无限制提供食物和水。施用化合物1和2前两天，在异氟烷麻醉条件下，对大鼠进行手术，以在颈静脉放置导管。手术后，使大鼠单独居住。口服给药前16小时和给药后6小时，大鼠不能进食。水无限制提供。

4.6.2 药代动力学研究

对于静脉内途经，将化合物配制在PEG200/生理盐水中，对于口服途经，将化合物配制在0.5％甲基纤维素(化合物1和2)和10％羟丙基-β-环糊精pH 3(化合物11)中。在5ml/kg给药体积条件下，将受试化合物以5mg/kg单独食管管饲法口服给药，在5ml/kg给药体积条件下，以1mg/kg经尾静脉推注静脉内给药。每组包括3只大鼠。对于化合物1和2，经颈静脉用肝素锂作为抗凝剂、在下列时间点采集血样：0.05、0.25、0.5、1、3、5和8小时(静脉内途经)和0.25、0.5、1、3、5、8小时和24小时(口服途经)。对于化合物11，血样是经后眼眶窦用肝素锂作为抗凝剂、在下列时间点采集：0.25、1、3和6小时(口服途经)。将全血样品以5000rpm离心10分钟，并且将产生的血浆样品在-20℃下保存待分析。

4.6.3 血浆中化合物水平的定量

通过LC-MS/MS方法测定每个受试化合物的血浆浓度，其中质谱在正离子电喷雾模式下操作。

4.6.4 药物动力学参数的测定

应用United States)计算药物动力学参数。

表XI

实施例4.8 7-天大鼠毒性研究

受试化合物的7-天口服毒性研究是在Sprague-Dawley雄性大鼠中进行的，以评价它们中毒的可能性和毒物动力学，日剂量为100、300和500mg/kg/天，管饲法，恒定剂量-体积为5mL/kg/天。

将受试化合物配制在纯水中的30％(v/v)HPβCD中。对于毒物动力学，每组包括5只主要的(principal)雄性大鼠和3只随伴(satellite)动物。第4组以相同的频率、剂量体积和通过相同的施用途径给予在水中的30％(v/v)HPβCD，用作介质对照组。

该研究的目的是测定不产生可鉴别的副作用事件(没有可观察的副作用水平-NOAEL)的最小剂量。

实施例4.8 肝细胞稳定性

McGinnity等人，Drug Metabolism and Disposition 2008，32，11，1247中描述了评价肝细胞中代谢清除率的模型。

实施例4.9 QT延长的易感性

在hERG膜片钳分析中评价QT延长的可能性。

常规完整细胞膜片钳

应用Pulse v8.77软件(HEKA)控制的EPC10放大器记录完整细胞的膜片钳。串联电阻通常小于10MΩ并且补偿大于60％，记录没有漏减。电极是GC150TF吸管式玻璃制成的(Harvard)。

外部浴溶液包含：135mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl₂、5mM葡萄糖、10mM HEPES,pH 7.4。

内部贴片吸管溶液包含：100mM Kgluconate、20mM KCl、1mMCaCl₂、1mM MgCl₂、5mM Na₂ATP、2mM谷胱甘肽、11mM EGTA、10mM HEPES,pH 7.2。

药物是应用生物学MEV-9/EVH-9快速灌流系统灌注的。

在稳定表达hERG通道的HEK293细胞上进行所有的记录。在应用两根铂棒(Goodfellow)固定在记录槽中的12mm圆形盖玻片(德国玻璃，Bellco)上培养细胞。应用激活脉冲诱发hERG电流：+40mV，1000ms，随后是尾电流脉冲：-50mV，2000ms，保持电位是-80mV。每隔20秒应用一次脉冲，所有试验在室温下进行。

结果

当进行所述分析时，测得的化合物1的IC₅₀比150μM大。

结论

本申请中提供的数据表明与结构类似的化合物相比，化合物1(本发明化合物)显示显著提高的体内效能。这种提高是出乎意料的，并且是本领域技术人员不能预测的，特别是因为许多结构类似的化合物显示非常类似的体外抗JAK1和JAK2效能。

本领域技术人员应该理解上述描述本质上是示例性的和说明性的，旨在说明本发明及其优选的实施方案。通过常规试验，技术人员将意识到所做的没有脱离本发明的精神的修改和变化是显而易见的。因此，本发明旨在不通过以上描述进行定义，而是通过以下权利要求和它们的等同描述进行定义。

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McGinnity等，Drug Metabolism and Disposition(药物代谢和分布)2008，32，11，1247.

将本说明书中引用的所有出版物(包括但不限于专利和专利申请)引入文中作为参考，如同每个单独的出版物都具体并且单独引入文中作为参考，如同已经进行全部描述。

根据上面所述，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明的组合物和方法进行多种修改和变化。权利要求范围内出现的所有这些修改均包括在本发明范围内。

应当理解的是因素(例如不同化合物的不同的细胞渗透能力)可以归因于体外生物化学和细胞分析中化合物活性的差异。

可以通过应用市售的化学命名软件程序自动产生本申请书中给出和描述的本发明化合物的至少某些化学名称，这些名称没有单独进行查证。执行这项功能的代表性的程序包括Open Eye Software，Inc.销售的Lexichem命名工具和MDL，Inc.销售的Autonom Software工具。在其中化学名和描述的结构不同的情况下，以所描述的结构为准。

采用或/DRAW制作本文所示的化学结构。本文结构中碳、氧或氮原子上出现的任何开放的化合价表示存在氢原子。如果结构中存在手性中心但对于该手性中心没有显示具体的立体化学，那么则表示该结构包括与手性结构相关的两个对映异构体。

Claims

1.式(I)化合物或其药学上可接受的盐：

2.药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和药用有效量的权利要求1所要求保护的化合物。

3.根据权利要求2所要求保护的药物组合物，该药物组合物还包含其他的治疗物质。

4.根据权利要求1所要求保护的化合物在制备药物中的用途。

5.根据权利要求1所要求保护的化合物或根据权利要求2所要求保护的药物组合物，其用作药物。

6.根据权利要求1所要求保护的化合物，其用于治疗、防止或预防炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病。

7.根据权利要求1所要求保护的化合物在制备用于治疗、防止或预防下列疾病的药物中的用途：炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病。

8.用于治疗、防止或预防炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病的方法，所述方法包括施用足够使所述治疗、防止或预防有效的量的权利要求1的化合物或者根据权利要求2或3的药物组合物。

9.根据权利要求6或8所要求保护的化合物或方法，其中将根据权利要求1所要求保护的化合物与其他治疗物质联合施用。

10.根据权利要求2所要求保护的药物组合物或者根据权利要求9所要求保护的化合物或方法，其中所述其他治疗物质是用于治疗、防止或预防下列疾病的物质：炎症、自身免疫疾病、增殖性疾病、移植排斥、涉及软骨更新受损的疾病、先天软骨畸形和/或与IL6分泌过多相关的疾病。