CN104248645A - 一种复方聚维酮碘消毒液及其制备方法 - Google Patents
一种复方聚维酮碘消毒液及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种复方聚维酮碘消毒液,每1000ml消毒液中含有如下用量的原料:聚维酮碘10~100g,美洲大蠊提取物以总氨基酸计在0.8g以上,碘酸钾适量,余量为水。本发明还提供了消毒液的制备方法。本发明将美洲大蠊醇提物与聚维酮碘联合使用,不仅具有良好的杀菌作用,并且还能够促进肉芽组织生长、抗炎及消除炎性水肿,二者组成复方聚维酮碘消毒液制剂,可用于各种创伤的消毒及治疗;另外,本发明研究发现,聚维酮碘中加入美洲大蠊提取物后,明显增加了聚维酮碘的稳定性,为产品质量提供了保障。
Description
技术领域
本发明涉及一种复方聚维酮碘消毒液及其制备方法。
背景技术
美洲大蠊(PeriplanetaAmericana)属昆虫纲,蜚蠊目,蜚蠊科,“蟑螂”为其俗名,首见于《本草纲目拾遗》,也称其为石姜、滑虫,在地球上已经生存了3.5亿年,是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。美洲大蠊药用主癥瘕、破积聚,通利血脉,外用可敛疮、拔毒、化腐、生肌,现代研究表明其还具有良好的抗菌作用。
康复新液主要成分为美洲大蠊干燥虫体的乙醇提取物,功能通利血脉,养阴生肌,现代医学认为康复新液具有促进肉芽组织生长、抗炎及消除炎性水肿、提高机体免疫功能、抑制胃酸分泌等药理作用,临床用于十二指肠溃疡,胃溃疡,烧烫伤等的治疗。
聚维酮碘(PVP-I)是碘与表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及增溶剂形成的新型消毒剂,广泛应用于临床,杀菌谱广,对革兰阳性菌、革兰阴性菌、病毒、芽孢、真菌、原虫等都有强而迅速的杀灭作用。近年来有文献报道碘伏可能引起女性医护人员甲状腺疾病发病率上升,可能与碘的易挥发性有关,有研究表明碘伏的稳定性易受温度影响,也有文献表明,但有效碘浓度较高时(>1000μg/L)时,对细胞增殖有抑制作用,因此开展新型聚维酮碘复方消毒产品的研究工作,研发出质量好、性能稳定的产品,具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复方聚维酮碘消毒液。
本发明提供了一种复方聚维酮碘消毒液,每1000ml消毒液中含有如下用量的原料:
聚维酮碘10~100g,美洲大蠊提取物以总氨基酸计在0.8g以上(例如0.8~0.9g),碘酸钾适量,余量为水。
进一步地,聚维酮碘的含量为25~100g。
更进一步地,聚维酮碘的含量为50~100g。
目前在聚维酮碘溶液制剂中,碘酸钾一直作为稳定剂存在于溶液中,它有助于增加聚维酮碘溶液的稳定性。因此,碘酸钾的用量可以参考已知聚维酮碘溶液制剂中的用量。例如,本发明中每1000ml消毒液中碘酸钾的含量为1~5g。
其中,消毒液中还含有如下辅料:防腐剂或/和助溶剂。
进一步地,所述防腐剂为苯甲酸钠或/和山梨酸钾;所述助溶剂为甘油或/和吐温。
其中,所述美洲大蠊提取物为去油脂的美洲大蠊提取物。
进一步地,所述去油脂的美洲大蠊提取物的制备方法为:去美洲大蠊,乙醇提取后,去除油脂,即得。
更进一步地,制备方法的具体操作如下:
取美洲大蠊,粉碎,用80%~90%v/v乙醇提取,醇提液回收乙醇并浓缩后,加水,加热搅拌,静置,冷却,待油脂充分上浮,取下清液,过滤,滤液浓缩或干燥后,得美洲大蠊提取物。
具体地,美洲大蠊提取物的制备方法如下:
取美洲大蠊,粉碎,用80%~90%的乙醇提取,第一次加7倍量乙醇回流提取2小时,第二次加5倍量乙醇回流提取1.5小时,第三次加3倍量乙醇回流提取1小时,合并提取液,静置8h以上,滤过,滤液回收乙醇并浓缩成稠膏(相对密度约1.30(85℃)),加入20倍浸膏量的纯水,加热搅拌,静置,冷却,使油脂充分上浮,取下清液,过滤,滤液浓缩成稠膏(相对密度约1.30(85℃)),得美洲大蠊提取物。
本发明还提供了上述复方聚维酮碘消毒液的制备方法,它包括如下操作步骤:
(1)按配比称取原料;
(2)取去油脂的美洲大蠊提取物、聚维酮碘和碘酸钾,加水溶解后,加入常规辅料,混匀,滤过,灭菌,即得消毒液。
本发明将美洲大蠊醇提物与聚维酮碘联合使用,不仅具有良好的杀菌作用,并且还能够促进肉芽组织生长、抗炎及消除炎性水肿,二者组成复方聚维酮碘消毒液制剂,可用于各种创伤的消毒及治疗;另外,本发明研究发现,聚维酮碘中加入美洲大蠊提取物后,明显增加了聚维酮碘的稳定性,为产品质量提供了保障。
具体实施方式
实施例1
处方
聚维酮碘(PVP-I)50g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油150ml 山梨酸2g 苯甲酸钠3.5g 碘酸钾2g
制备成1000ml
制法
取PVP-I 50g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、甘油150ml、碘酸钾2g、苯甲酸钠3.5g及山梨酸2g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为5%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例2
处方
聚维酮碘(PVP-I)25g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油150ml 吐温-801ml 碘酸钾2g 山梨酸3g
制备成1000ml
制法
取PVP-I25g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、甘油150ml、碘酸钾2g、山梨酸3g及吐温-801ml,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为2.5%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例3
处方
聚维酮碘(PVP-I)10g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)0.8~0.9g 吐温-805ml 碘酸钾2g
制备成1000ml
制法
取PVP-I10g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)0.85g,加入80%所需量的纯水、吐温805ml及碘酸钾2g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为1%,含美洲大蠊提取物每1000ml为0.8~0.9g。
实施例4
处方
聚维酮碘(PVP-I)75g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油150ml 吐温803ml 山梨酸2g 碘酸钾2g
制备成1000ml
制法
取PVP-I75g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、甘油150ml、吐温803ml、碘酸钾2g及山梨酸2g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为7.5%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例5
处方
聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g吐温803ml 碘酸钾2g
制备成1000ml
制法
取PVP-I100g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、吐温803ml及碘酸钾2g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为10%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例6
处方
聚维酮碘(PVP-I)10g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g乙醇750ml 山梨酸2g 碘酸钾2g
制备成1000ml
制法
取PVP-I10g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、乙醇750ml、碘酸钾2g及山梨酸2g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为1%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例7
处方
聚维酮碘(PVP-I)50g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油50ml 碘酸钾2g 山梨酸5g
制备成1000ml
制法
取PVP-I50g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、甘油50ml、碘酸钾2g及山梨酸5g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为5%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例8
处方
聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油200ml 碘酸钾2g 山梨酸1g
制备成1000ml
制法
取PVP-I100g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、甘油200ml、碘酸钾2g及山梨酸1g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为10%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例9
处方
聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油150ml 山梨酸2g 苯甲酸钠3.5g 碘酸钾1g
制备成1000ml
制法
取PVP-I100g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、甘油150ml、碘酸钾1g、苯甲酸钠3.5g及山梨酸2g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为10%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
实施例10
处方
聚维酮碘(PVP-I)100g美洲大蠊醇提物(以总氨基酸计)不少于0.8g甘油150ml 山梨酸2g 苯甲酸钠3.5g 碘酸钾5g
制备成1000ml
制法
取PVP-I100g,美洲大蠊提取物(以总氨基酸计)不少于0.8g,加入80%所需量的纯水、甘油150ml、碘酸钾5g、苯甲酸钠3.5g及山梨酸2g,加热溶解,滤过,滤液加水至1000ml,搅匀,灭菌,滤过,灌装,即得。
该复方聚维酮碘消毒液含聚维酮碘以有效碘浓度计为10%,含美洲大蠊提取物每1000ml不少于0.8g。
本发明实施例中美洲大蠊提取物的均为去油脂品,其制备方法可以参见现有技术中的公开方法,如201210446614.3。也可参照如下方法:
取美洲大蠊,粉碎,用80%~90%的乙醇提取,第一次加7倍量乙醇回流提取2小时,第二次加5倍量乙醇回流提取1.5小时,第三次加3倍量乙醇回流提取1小时,合并提取液,静置8h以上,滤过,滤液回收乙醇并浓缩成稠膏(相对密度约1.30(85℃)),加入20倍浸膏量的纯水,加热搅拌,静置,冷却,使油脂充分上浮,取下清液,过滤,滤液浓缩成稠膏(相对密度约1.30(85℃)),得美洲大蠊提取物。
以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
下述试验例中,复方聚维酮碘消毒液中的有效碘浓度参照各具体试验步骤要求,消毒液中所含美洲大蠊提取物以总氨基酸计,每1000ml含0.8~0.9g。
试验例1 复方聚维酮碘消毒液的药理作用考察:
1.复方聚维酮碘消毒液对体外培养血管内皮细胞增殖的影响
1.1材料
1.1.1细胞株
内皮细胞细胞株ECV-304购于山东省医学科学院。
1.1.2主要试剂
复方聚维酮碘消毒液(实验中所用的复方聚维酮碘消毒液,其中除了聚维酮碘、美洲大蠊提取物、碘酸钾外,不含防腐剂和其他辅料)
美洲大蠊饮片、美洲大蠊醇提物(四川科伦药业集团有限公司)
聚维酮碘溶液(PVP-I,批号:101004,有效碘浓度10.0%),(成都永安制药有限公司)
聚维酮碘粉末(纯度≥99%,郑州赛诺康化工产品有限公司)
RPMI1640培养基,(美国GIBCO公司)
胎牛血清,(上海玉博生物科技有限公司)
PBS缓冲液(pH=7.4),(福州迈新生物技术开发有限公司)
0.25%胰蛋白酶,(北京格源天润生物科技有限公司)
青霉素(80万U/ml),(山东鲁抗制药股份有限公司)
链霉素(100万U/ml),(山东鲁抗制药股份有限公司)
溴化丙啶(PI),(SIGMA)
鼠抗人PCNA单克隆抗体,(上海亿欣生物科技有限公司)
兔抗人Ki-67单克隆抗体,(上海亿欣生物科技有限公司)
PV-9000通用型二抗,(上海亿欣生物科技有限公司)
DAB,(上海亿欣生物科技有限公司)
1.1.3仪器
酶标仪,Bio-RAD550,(美国Bio-RAD公司)
倒置显微镜,olympus,(日本)
医用净化工作台,APR-GM-ZYT-6,(成都艾普瑞实验设备有限公司)
微型迷你振荡器,MS-1,(日本IKA公司)
医用低速离心机,TDL-5,(四川蜀科仪器有限公司)
CO2细胞培养箱,MCO175,(日本三洋电器有限公司)
液氮生物容器,YDS-30,(成都信杰诚贸易有限公司)
-20℃冰箱,康佳,(安徽康佳电器有限公司)
-80℃超低温冰箱,ThermoForma725型,(日本三洋电器有限公司)
电热恒温干燥箱,(成都特思特仪器有限公司)
流式细胞仪,FACSCalibur,(美国BD公司)
培养板,6、24、96孔,(COSTER)
1.1.4各溶液配方
(1)RPMI1640培养液:取一包RPMI1640培养基粉末溶解于300ml三蒸水再用三蒸水洗包装袋内两次。加入磁性搅棒,放在振荡器上搅匀,加入2gNaHCO3,定容接近1000ml,并用1mol HCL溶液调pH值至7.0~7.2,并加入青霉素使终浓度至l00U/ml和链霉素终浓度100U/ml。0.22μm滤膜两张过滤除菌,无菌条件下分装,4℃冷藏备用。每批使用不超过两周。
(2)PI复合染液:生理盐水:129.6ml、PI:l0ml、RNase:2mg、1.0%Triton-100:0.5ml、枸椽酸钠:200mg,加蒸馏水至200ml,调整pH值至7.2~7.6,4℃避光保存。
(3)l:50PCNA或Ki-67抗体:取PCNA或Ki-67抗体原液10μl,以490μl PBS稀释至500μl,现用现配。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养
内皮细胞株ECV-304培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,内含终浓度为100U/ml的青霉素和链霉素,置于37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱内单层培养,待细胞长满80%~90%后,PBS缓冲液冲洗两遍,0.25%胰蛋白酶消化约5~8min待出现筛孔效应后,用lml吸管轻轻吹打完全后传代。
1.2.2复方聚维酮碘消毒液对体外培养ECV-304细胞增殖的影响
分别取复方聚维酮碘消毒液适量,用RPMI1640培养基分别稀释至一定浓度的溶液,具体方法步骤如下:
1.2.2.1消化制备单细胞悬液:待培养瓶内细胞长满约80%~90%后,加lml0.25%胰蛋白酶消化,镜下观察见细胞回缩,出现筛孔效应,倒掉消化液,加入含10%胎牛血清的RPMI16402~3ml吹打,使细胞脱壁,加培养液至10ml继续吹打使细胞之间分散成单个细胞,并于镜下观察,制备成单细胞悬液。
1.2.2.2计算细胞密度:用lml刻度吸管吸取少许细胞悬液,滴在计数板上并置于倒置显微镜下观察,计数并计算细胞密度。
细胞数/ml=4大格细胞总数/4×104
1.2.2.3调整细胞密度:使细胞密度调至0.8~1.0×105/ml,一般每瓶细胞需加培养基至24~25ml即可得到所需细胞密度。
1.2.2.4接种:24孔板每板分为1个对照组和3个实验组,每组设6个实验复孔。每孔加入1ml细胞悬液,置于培养箱内约2h后细胞贴壁。
1.2.2.5加入复方聚维酮碘消毒液:待镜下观察细胞贴壁后,取出培养板向实验孔加不同配比组成的复方聚维酮碘消毒液。具体方法为:从实验孔中取出20μl培养液弃去,然后加入等体积的复方聚维酮碘消毒液。
1.2.2.6细胞培养、形态学观察及细胞计数:加入不同复方聚维酮碘消毒液后放入培养箱继续培养,于第4、8、12和24h观察细胞生长状况,并进行细胞计数。
1.2.3对细胞周期的影响
将ECV-304细胞接种于6孔培养板上,用含有效碘浓度为0.10%、5.00%、10.00%的复方聚维酮碘消毒液的培养液分别培养24h后用胰酶适度消化制备单个细胞悬液,收集至离心管1000rpm离心15min,弃上清。PBS冲洗2次,加0.5ml PBS吹匀,用5ml注射器将细胞吸起打入5ml70%冷乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜。1000rpm离心15min,弃上清液,PBS冲洗2次。用0.4ml PBS重新悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎),将细胞悬液和等体积的PI复合染液混合,染色(4℃,20~30min),400目尼龙网过滤后上机检测。ModFit分析软件分析,用S期细胞比率(SPR)表示相对增殖力。
SPR=S/(Go/G1+S+G2/M)
1.2.4对PCNA、Ki67表达的影响
采用第二代聚合酶两步法(PV法)分析,其步骤为:
1.2.4.1在无菌条件下将消毒好的盖玻片放入6孔培养板;
1.2.4.2将ECV-304培养于盖玻片上(6片/实验组),待细胞贴壁后加入等量的复方聚维酮碘消毒液,有效碘浓度分别为10.00%、7.50%、5.00%、2.50%和0.10%,培养24h;
1.2.4.3由培养板中取出盖玻片,冷丙酮固定细胞(室温,10min),PBS冲洗(2min×3次);
1.2.4.445℃烤片3h,PBS冲洗5min,三次;
1.2.4.5滴加0.5%Triton-X100(37℃,10min),PBS冲洗5min,三次;
1.2.4.6每张切片滴加蒸馏水新鲜配置的3%H2O2(37℃,10min),以灭活内源性过氧化物酶,PBS冲洗5min,三次;
1.2.4.7滴加一抗(鼠抗人PCNAIgG1:50,兔抗人Ki67IgG1:50),37℃20min后4℃过夜;
1.2.4.837℃复温lh,PBS冲洗2min,三次;
1.2.4.9滴加二抗中试剂1,37℃,20min,PBS冲洗5min,三次;
1.2.4.10滴加二抗中试剂2,37℃,30min;PBS冲洗5min,三次;
1.2.4.11滴加新鲜配置的DAB显色,镜下控制时间,蒸馏水冲洗终止反应;
1.2.4.12苏木素轻度复染,自来水冲洗;梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片;
1.2.4.13镜下观察并照相,计数100个细胞中的阳性细胞数,随机选择6个视野,计算均值×100%为阳性细胞的比率。
1.2.5统计处理方法
数据处理采用SPSS18.0软件。实验数据均用均数±标准差表示,多组均数间的比较采用F检验,多组均数间的多重比较采用q检验。P<0.05有统计学意义;P>0.05无统计学意义。
1.3实验结果
1.3.1对体外培养ECV-304细胞增殖的影响
ECV-304细胞在不同配比组成的复方聚维酮碘消毒液培养液中培养不同时间后,可见细胞计数和细胞形态与有效碘浓度及作用时间存在一定关系(时间剂量效应关系,见表1-1)。
1.3.1.1.1不同有效碘浓度的复方聚维酮碘消毒液作用4h对ECV-304细胞数量及形态的影响:加复方聚维酮碘消毒液培养4h,与对照组比较,康复新液组和各实验组细胞计数均显著增加,PVP-I组有增强趋势但无统计学意义,各组细胞形态无明显改变,细胞呈圆形或不规则形,均匀透亮,贴壁后内皮细胞呈典型铺路石状镶嵌排列,或呈扁平的短梭形、多角形,镶嵌排列。
1.3.1.1.2不同有效碘浓度的复方聚维酮碘消毒液作用8h对ECV-304细胞数量及形态的影响:培养8h后,康复新液组和各实验组细胞计数均显著增加,与对照组、PVP-I组比较有统计学意义,形态无明显改变;PVP-I组细胞计数有减少趋势,可见形态改变,细胞内可见空泡现象以及中毒颗粒。
1.3.1.1.3不同有效碘浓度的复方聚维酮碘消毒液作用12h对ECV-304细胞数量及形态的影响:培养12h后,康复新液组和各实验组细胞计数均显著增加,与对照组、PVP-I组比较有统计学意义,形态无明显改变;PVP-I组细胞计数显著减少,可见细胞形态明显改变为成纤维样长梭形,细胞内可见空泡现象以及中毒颗粒。
1.3.1.1.4不同有效碘浓度的复方聚维酮碘消毒液作用24h对ECV-304细胞数量及形态的影响:培养24h后,康复新液组和各实验组细胞计数均显著增加,与对照组、PVP-I组比较有统计学意义,形态无明显改变;PVP-I组细胞计数显著减少,可见细胞形态明显改变为成纤维样长梭形,且可见部分细胞回缩脱壁,细胞内可见空泡现象以及中毒颗粒。
表1-1 不同时间段复方聚维酮碘消毒液对细胞计数的影响
注:与空白组相比,P1<0.05,P2<0.01;与康复新液组相比,P3<0.05,P4<0.01;与PVP-I组相比,P5<0.05,P6<0.01;下表同。
1.3.2对细胞周期的影响
复方聚维酮碘消毒液作用24h后对内皮细胞增殖周期的影响表现为(见表1-2):①空白对照组的细胞S期比率(SPR)低于实验组而高于PVP-I组,各实验组与康复新液组无统计学差异;②G2/M期相同,对照组低于实验组而高于PVP-I实验组;③G0/G1期,对照组低于实验组和PVP-I组;④对照组的凋亡率高于各实验组而低于PVP-I组。
表1-2 复方聚维酮碘消毒液作用24h后ECV-304细胞增殖周期和凋亡水平的变化
1.3.3复方聚维酮碘消毒液对PCNA、Ki67表达的影响
复方聚维酮碘消毒液作用24h后检测ECV-304细胞PCNA和Ki67的表达(见表1-3),结果表明,各实验组ECV-304细胞PCNA和Ki67的表达增加,均显著高于空白组和PVP-I组,各实验组之间无显著差异。
表1-3 复方聚维酮碘消毒液作用24h对ECV-304细胞PCNA和Ki67表达的影响
1.4实验讨论
从以上实验可知,聚维酮碘溶液单独使用,浓度较大时抑制细胞增殖,具体表现为减少ECV-304细胞数量,明显改变细胞形态,细胞内可见空泡现象以及中毒颗粒,影响细胞周期,降低SPR、G2/M、G0/G1各期比率,提高细胞凋亡率,降低细胞PCNA和Ki67的表达。与康复新合用,一方面促进细胞增殖,表现为增加细胞数量,提高SPR、G2/M、G0/G1各期比率,降低细胞凋亡率,提高细胞PCNA和Ki67的表达,另一方面可克服聚维酮碘对细胞形态的改变,体外培养24h后,康复新液组和各实验组细胞形态无明显改变,细胞呈圆形或不规则形,均匀透亮,贴壁后内皮细胞呈典型铺路石状镶嵌排列,或呈扁平的短梭形、多角形,镶嵌排列。因此,复方聚维酮碘消毒液,有效碘浓度在0.10%~10.0%范围内对细胞增殖有明显促进作用,利于肉芽组织的生成,可促进外伤的修复,具有积极的意义。
2.康复新/美洲大蠊与复方聚维酮碘消毒液稳定性及杀菌性能实验考察
2.1实验材料
复方聚维酮碘消毒液(自制,有效碘浓度规格为0.10%、2.50%、5.00%、7.50%、10.00%)(实验中所用的复方聚维酮碘消毒液,其中除了聚维酮碘、美洲大蠊提取物、碘酸钾外,不含防腐剂和其他辅料)
试验菌种(金黄色葡萄球菌ATCC6358、大肠杆菌8099、白色念珠菌ATCC10231),购于北京北纳创联生物技术研究院
硫代硫酸钠(成都盛大创业化工有限公司)
卵磷脂(北京美亚斯磷脂技术有限公司)
吐温80(山东天道生物工程有限公司)
2.2实验方法
2.2.1复方聚维酮碘消毒液稳定性实验
按照《中国药典》2010年版1094页“聚维酮碘溶液”含量测定项下相关规定,分别测定PVP-I原液、不同复方聚维酮碘消毒液37℃存放90天、54℃存放14d或自然室温存放1年的下降率。
按照《中国药典》2010年版1094页“聚维酮碘溶液”鉴别项下相关规定,分别取PVP-I原液及不同配比组成的复方聚维酮碘消毒液各10ml,置50ml锥形瓶中(瓶内瓶颈切勿玷污),瓶口覆盖一张用淀粉指示液湿润的滤纸,观察滤纸变蓝所需的最短时间,考察碘的挥发性。
2.2.2试验菌悬液的制备
上述试验菌种,取37℃培养18~24h第4~9代菌的培养基斜面新鲜培养物置稀释液中,与30g/L牛血清白蛋白等量混合,配成含15g/L牛血清白蛋白的菌悬液。
2.2.3中和剂鉴定试验
中和剂为1.0g/L硫代硫酸钠+1.0g/L卵磷脂+10.0g/L吐温80的TPS。以金黄色葡萄球菌、白色念珠菌为试验菌,试验设六组,按悬液定量杀菌的中和剂鉴定试验程序进行,试验温度为20℃,1、2组作用1.0min,PVP-I对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌试验浓度分别为有效碘50、60mg/L。结果判定:第1组长菌数比第2组少;第2组菌数\100cfu/ml,第3、4、5组金黄色葡萄球菌菌量在1×107~5×107cfu/ml、白色念珠菌菌量在1×106~5×106cfu/ml之间,三组间菌落数误差率应小于15%,第6组无菌生长,所选的中和剂符合试验要求,试验重复3次。
2.2.4定量杀菌试验
用标准硬水将复方聚维酮碘消毒液部分溶液配制稀释成试验浓度的1.25倍。取其4.0ml(对照组用PBS)置试管中,经19~21℃恒温后加入1.0ml含15g/L牛血清白蛋白菌悬液,作用至预定时间,分别吸取0.5ml混合液加于4.5ml中和剂试管内,中和作用10min,进行活菌培养计数。试验同时设阳性对照组、阴性对照组。评价标准:重复3次试验,对试验菌的杀灭对数值均≥5.00,可判为消毒合格。
2.3实验结果
2.3.1复方聚维酮碘消毒液稳定性测定结果
该PVP-I原液有效碘含量为10.00%(其中碘酸钾含量与本发明相同),37℃存放90天下降率达19.20%;54℃存放14d或自然室温存放1年下降率均>10%,复方聚维酮碘消毒液,在不同浓度、不同储存时间及条件下,其下降率均<5%,(见表2-1)。PVP-I原液碘挥发性的测定符合药典标准,但仍有一定程度的挥发,4分钟内淀粉指示滤纸变蓝,而复方聚维酮碘溶液在所考察的有效碘浓度范围内24h内均未变色,(见表2-2)。
表2-1 有效碘含量测定及稳定性试验结果
表2-2 碘挥发性试验结果
由上述试验可知,本发明制备的复方聚维酮碘消毒液,其稳定性明显优于现有的聚维酮碘消毒液。
2.3.2中和剂鉴定实验结果
实验证明,含1.0g/L硫代硫酸钠+1.0g/L卵磷脂+10.0g/L吐温80的TPS中和剂,能有效中和PVP-I有效碘50mg/L对金黄色葡萄球菌、60mg/L对白色念珠菌的残余作用,且中和剂、中和产物对细菌培养基计数无影响,所选中和剂溶液符合试验要求(表2-3)。
表2-3 PVP-I中和剂鉴定实验结果
2.3.3细菌定量杀灭试验结果
复方聚维酮碘消毒液中有效碘浓度在2.50%~10.00%范围内时,对金黄色葡萄球菌作用5min、大肠杆菌作用2min杀灭对数值>5.00,达到消毒合格标准;有效碘在5.00%~10.00%范围内时,对白色念珠菌作用2min,2.50%浓度时作用10min杀灭对数值>4.00,达到消毒合格标准(表2-4、2-5、2-6)。
表2-4 复方聚维酮碘消毒液对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的定量杀灭试验结果
表2-5 复方聚维酮碘消毒液对大肠杆菌(8099)的定量杀灭试验结果
表2-6 复方聚维酮碘消毒液对白色念珠菌(ATCC10231)的定量杀灭试验结果
2.4实验讨论
从稳定性角度看,复方聚维酮碘消毒液的各种浓度下有效碘下降率均得到较大程度的改善,碘挥发性实验也证明复方消毒液的碘挥发程度大大减轻,可能与美洲大蠊醇提物的成分组成有关,美洲大蠊醇提物富含蛋白质、氨基酸类成分,蛋白质的三级空间结构有利于碘的络合,聚维酮碘本身为络合结构,小分子的氨基酸填充其中也有利于碘的保留;从杀菌效果看,10.0%复方聚维酮碘消毒液杀菌效果与PVP-I相比,具有增强趋势,可能与康复新中含有的抗菌肽有关,较高有效碘浓度的,随着有效碘浓度下降,杀菌能力下降,表明该复方聚维酮碘消毒液中起杀菌作用的成分主要还是聚维酮碘,美洲大蠊醇提物主要提高聚维酮碘的稳定性。
3.复方聚维酮碘消毒液毒性考察
3.1实验材料
复方聚维酮碘消毒液(自制,规格有效碘浓度10.0%)(实验中所用的复方聚维酮碘消毒液,其中除了聚维酮碘、美洲大蠊提取物、碘酸钾外,不含防腐剂或其他辅料)
3.2实验动物
昆明小鼠、wistar大鼠及日本大耳白兔均由四川达硕实验动物中心提供。
3.3实验方法
依据“消毒产品毒理学实验技术规范”进行。
3.3.1急性经口毒性试验
选取体重180~220g的SPF级Wistar大鼠20只、体重18~22g的SPF级昆明小鼠20只,雌雄各半。一次灌胃至设计剂量5000mg/kg·bw,连续观察14d,记录中毒反应和死亡情况,试验后解剖观察脏器变化,计算大、小鼠的LD50。
3.3.2嗜多染红细胞微核试验
取体重25~30g的SPF级昆明小鼠50只,分为5组:即500、2000、5000mg/kg·bw3个剂量组,1个阳性对照组给予环磷酰胺(40mg/kg·bw),1个阴性对照组给予无菌蒸馏水,每组动物10只,雌雄各半。采用经口灌胃30h染毒法,即两次染毒间隔24h,第二次染毒后6h用颈椎脱臼法处死动物,股骨髓涂片,Giemsar染色。每只动物计数1000个PCE,微核率以千分率表示。
3.3.3多次完整皮肤刺激试验
选取2.5kg左右的清洁级健康日本大耳白兔3只,试验前24h于兔背部脊柱两侧脱毛,脱毛范围为左右各约3cm×3cm。次日将受试物原液0.5ml直接涂抹于一侧去毛完整皮肤上,另一侧涂无菌生理盐水作对照。作用4h后,用无菌蒸馏水除去残留受试物。每天涂抹一次,连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察结果,进行刺激反应评分。
3.3.4一次破损皮肤刺激试验
选取2.5kg左右的清洁级健康日本大耳白兔3只,试验前24h于兔背部脊柱两侧脱毛,脱毛范围为左右各约3cm×3cm。次日在涂抹受试物之前,在2.5cm×2.5cm的去毛皮肤上,用75%酒精清洁、消毒暴露皮肤,待酒精挥发后,用无菌注射针头在消毒区内划一个“#”形破损伤口,以不伤及真皮为度,并将受试物原液0.5ml直接涂抹于左侧破损区内皮肤上,然后用一层无刺激塑料膜覆盖,再用无刺激胶布固定;另一侧作对照,用生理盐水代替样品进行实验。作用4h后,用无菌蒸馏水除去残留受试物。分别于除去受试物后1h、24h、48h,观察皮肤局部反应,进行刺激反应评分。
3.3.5急性眼刺激试验
选取2.5kg左右的清洁级日本大耳白兔3只,将受试物原液0.1ml滴入兔左侧眼结膜囊内,立即使眼被动闭合4s,30s后用无菌生理盐水冲洗。右眼作对照,滴入等量无菌生理盐水。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d,肉眼观察兔眼结膜、虹膜和角膜的损伤和恢复情况,进行刺激反应评分。
3.3.6亚急性经口毒性试验
选取体重88~122g、7周龄的SPF级W istar大鼠40只,随机分为250、500、1000mg/㎏·bw三个剂量组和一个阴性对照组,每组动物10只,雌雄各半。每天经口灌胃染毒,阴性对照组给予无菌蒸馏水。连续染毒28d,末次染毒后24h断头取血,检测血红蛋白(Hb)、红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数及分类、血小板(PLT)计数和天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、肌苷(CRE)、血糖(GLU)、血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)等生化指标,测量脏器重量(肝、肾)、计算脏器系数,并对主要器官(心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃肠、卵巢、睾丸)做病理学检查。
试验数据使用SAS6.0软件进行方差分析。
3.4实验结果
3.4.1急性经口毒性试验
染毒后,未见动物出现明显中毒症状,观察期间无动物死亡。对观察期满动物处死后剖检,肉眼未见异常组织或脏器。大、小鼠急性经口LD50均大于5000mg/kg·bw。
3.4.2小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
各剂量组与阴性对照组之间微核发生率无显著性差异(P>0.05),与阳性对照组之间有显著性差异(P<0.01)(表3-1)。
表3-1 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果
3.4.3多次完整皮肤刺激试验
连续染毒14d,对照侧、试验侧均未见红斑或水肿症状,刺激反应积分均值均为0。
3.4.4一次破损皮肤刺激试验
观察期间,试验侧、对照侧均未见红斑或水肿症状,总积分均值均为0,其刺激指数为0。
3.4.5急性眼刺激试验
3只动物试验侧均出现眼结膜充血症状,最高积分为1分,平均积分为0.7分,未见角膜、虹膜损害及结膜水肿,72h恢复正常,对照侧均正常。3.4.6亚急性经口毒性试验:
3.4.6.1 动物一般表现试验过程中动物无死亡,毛发正常,无异常行为表现。
3.4.6.2 大鼠体重、脏器重量及脏/体比结果受试物各剂量组体重、脏器重量及脏/体比与阴性对照组相比均无显著性差异(P>0.05)(表3-2)。
3.4.6.3 血液学检查结果
3.4.6.3.1 大鼠血细胞结果各剂量组动物的Hb、RBC、WBC、PLT及白细胞分类计数(淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞)与阴性对照组相比均无显著性差异(P>0.05)(表3-3)。
3.4.6.3.2大鼠生化指标检查结果各剂量组大鼠血清ALT、AST、BUN、CHO、TG、CRE、GLU、ALB、TP测定结果与阴性对照组相比均无显著性差异(P>0.05)(表3-4)。
表3-2 大鼠体重、脏器重量及脏/体比结果
表3-3 大鼠血细胞计数结果
表3-4 大鼠血液生化指标检查结果
3.4.6.4病理组织检查
大体解剖各剂量组动物主要器官(肝、脾、肺、肾、肾上腺、心、胃肠、卵巢或睾丸)肉眼未见异常。镜下可见,高剂量组个别动物可见少数区域肝细胞轻度脂肪变性,肺脏间质呈淤血水肿、肺血管周围和支气管周围炎细胞浸润,肠固有膜可见炎细胞浸润等症状,其它器官(心脏、肾脏、脾脏、肾上腺、雌性大鼠卵巢、雄性大鼠睾丸)未见明显病理改变。
3.5实验讨论
该次试验的复方聚维酮碘消毒液为新开发产品,其毒理学安全性研究未见报道。参考“消毒产品毒理学实验技术规范”对其进行了试验,结果表明,复方聚维酮碘消毒液(10.0%)对大、小鼠急性经口LD50均大于5000mg/kg·bw,属实际无毒;对小鼠骨髓嗜多染红细胞无致微核作用,表明无遗传毒性;其原液对兔眼及破损皮肤无刺激性;多次给药后对兔完整皮肤无刺激性,给药量在1000mg/kg·bw以下,对大鼠的体重、血常规及血液生物化学等指标无显著影响;对肝、脾、肺、肾、肾上腺、心、胃肠、卵巢或睾丸等主要器官未造成明显病理改变,未发现该受试物有明显亚急性毒性作用。
试验例2 复方聚维酮碘消毒液临床应用情况
1用于治疗迁延性伤口的效果观察*
将70例发生压疮导致迁延性伤口的老年患者按时间顺序分为PVP-I、康复新液对照组和观察1~5组各10例。各组常规清创后,PVP-I、康复新液对照组分别使用浸有PVP-I、康复新药液的纱布包扎疮面,观察组分别用浸有1%、2.5%、5%、7.5%、10%(有效碘浓度)不同浓度复方聚维酮碘的药液进行包扎。结果观察1~4组愈合时间(17.2d)与康复新液(16.5d)相比,差异无统计学意义(P>0.05);观察5组愈合时间(14.4d)明显短于康复新液组(P<0.05),各观察组治愈时间显著短于PVP-I对照组(21.3d)(P<0.05)。结论复方聚维酮碘消毒液能缩短迁延性伤口治疗时间。
2用于治疗Ⅱ度烧伤的效果观察(实施例1消毒液)
应用5%规格的复方聚维酮碘消毒液治疗Ⅱ度烧伤患者63例(观察组),并与单用康复新液治疗44例(对照组)作为对照,两组患者的烧伤面积、平均年龄等差异无显著性,用药方式均以半暴露为主。结果观察组细菌培养阳性率为8.6%,对照组为16.4%,两组比较差异有显著性(P<0.05);观察组治疗总有效率为96.2%(以创面愈合率计),对照组为94.8%,两组比较差异有显著性(P<0.05)。结论复方聚维酮碘消毒液具有较强的抗感染能力,缩短创面愈合时间,是Ⅱ度烧伤的良好外用药。
3在肛瘘术后换药应用的效果观察(实施例2消毒液)
采用半随机方案,将57名患者分别纳入PVP-I、康复新液纱条组及复方聚维酮碘消毒液纱条换药组,每组19名,比较各组伤口愈合情况。各组之间在年龄、性别构成比的比例无统计学差异。术后各组间的疼痛评分无统计学差异。脓腐物脱尽的时间,复方聚维酮碘消毒液纱条换药组(3.7d)短于PVP-I(5.3d)及康复新液纱条(4.7d)换药组(P﹤0.05),脓腐物脱尽后的愈合时间,复方聚维酮碘消毒液纱条换药组(6.8d)短于PVP-I(9.6d)及康复新液纱条(8.2d)换药组(P﹤0.05)。表明与PVP-I及康复新液纱条换药组相比,复方聚维酮碘消毒液纱条在肛瘘术后的不同阶段均有相应优势。
本发明将美洲大蠊醇提物与聚维酮碘联合使用,不仅具有良好的杀菌作用,并且还能够促进肉芽组织生长、抗炎及消除炎性水肿,二者组成复方聚维酮碘消毒液制剂,可用于各种创伤的消毒及治疗。
Claims (10)
1.一种复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:每1000ml消毒液中含有如下用量的原料:
聚维酮碘10~100g,美洲大蠊提取物以总氨基酸计在0.8g以上,碘酸钾适量,余量为水。
2.根据权利要求1所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:聚维酮碘的含量为25~100g。
3.根据权利要求2所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:聚维酮碘的含量为50~100g。
4.根据权利要求1所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:碘酸钾的含量为1~5g。
5.根据权利要求1所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:消毒液中还含有如下辅料:防腐剂或/和助溶剂。
6.根据权利要求5所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:所述防腐剂为苯甲酸钠或/和山梨酸钾;所述助溶剂为甘油或/和吐温。
7.根据权利要求1所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:所述美洲大蠊提取物为去油脂的美洲大蠊提取物。
8.根据权利要求1或7所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:所述美洲大蠊提取物的制备方法为:去美洲大蠊,乙醇提取后,去除油脂,即得。
9.根据权利要求8所述的复方聚维酮碘消毒液,其特征在于:制备方法的具体操作如下:
取美洲大蠊,粉碎,用80%~90%v/v乙醇提取,醇提液回收乙醇并浓缩后,加水,加热搅拌,静置,冷却,待油脂充分上浮,取下清液,过滤,滤液浓缩或干燥后,得美洲大蠊提取物。
10.权利要求1-9任意一项所述复方聚维酮碘消毒液的制备方法,其特征在于:它包括如下操作步骤:
(1)按配比称取原料;
(2)取去油脂的美洲大蠊提取物、聚维酮碘和碘酸钾,加水溶解后,加入常规辅料,混匀,滤过,灭菌,即得消毒液。
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