CN108542855A - 一种含有蝇蛆虫体生物活性组分的美白护肤品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有蝇蛆虫体生物活性组分的美白护肤品，其中含有蝇蛆虫体生物活性组分、常规辅料和赋形剂，经试验，该美白护肤品具有改善皮肤皴裂、美白、淡斑的效果。本发明还公开了一种蝇蛆虫体生物活性组分的制备方法，与常规方法相比，该方法可明显提高蝇蛆虫体生物活性组分中溶菌酶的含量，并可提高活性成分的浓度，提高活性效价。

Description

一种含有蝇蛆虫体生物活性组分的美白护肤品
技术领域
本发明涉及一种含有蝇蛆虫体生物活性组分的美白护肤品。
背景技术
蝇蛆，是完全变态昆虫蝇类的幼虫，由于其环境适应能力强、生物质利用度高、并且具有良好的抗病能力，一直以来都成为科学工作者研究的焦点。蝇蛆虫体含有大量的生物活性物质，包括抗菌肽，凝集素，壳聚糖，溶菌酶等等，为其在杂菌恒生的环境中生存提供一定的保障，现代医学上的蝇蛆疗法对于术后伤口感染具有很好的疗效。
随着人们生活水平的提高和审美标准的变化，越来越多的人追求皮肤的白皙与润泽。近年来，美白化妆品顺应“回归自然”的潮流，纷纷选用自然界绿色、无毒、有效的物质为原料，以迎合消费者的需求。
对蝇蛆蛋白的功能开发多集中于对其消炎抗菌功能的开发，暂未见到将其用于美白产品的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种美白护肤品，其功能成分为蝇蛆虫体生物活性组分。
本发明所采取的技术方案是：
一种美白护肤品，其中含有蝇蛆虫体生物活性组分、常规辅料和赋形剂，蝇蛆虫体生物活性组分的制备方法包括以下步骤：
(1)当蝇蛆幼虫生长至二龄时，对蝇蛆幼虫进行刺激处理，待蝇蛆幼虫长至三龄，收集蝇蛆幼虫，用水反复漂洗，排尽虫体内容物，再将漂洗干净后的蝇蛆幼虫消毒处理；
(2)将漂洗干净并消毒后的蝇蛆幼虫加入提取液充分匀浆，离心后弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液A，备用；
(3)向中间清液A中加入硫酸铵，静置，离心后去除上清液，得到沉淀B备用；
(4)将沉淀B加入提取液进行复溶，透析后进行浓缩除去部分水，取出溶液C备用；
(5)将溶液C冷冻成冰后取出融化，反复冻融两次，离心除去沉淀，得到上清液D备用；
(6)将上清液D冻干即可。
进一步地，刺激处理为针刺处理或者在培养基中加入菌悬液。
进一步地，菌悬液中含有细菌、真菌和霉菌中的至少一种，包括但不限于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌和黑曲霉菌。
进一步地，提取液为pH 6～10的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.1％～3％的NaCl，体积分数为0.1％～1％的β-巯基乙醇。
进一步地，提取液为pH 6～8的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.1％～1.5％的NaCl，体积分数为0.1％～0.3％的β-巯基乙醇。
进一步地，步骤(2)中加入提取液的比例为每1g蝇蛆幼虫加入1～20ml提取液，匀浆温度为3～5℃，离心温度为3～5℃，离心转速为11000～13000rpm，离心时间为10～35min。
进一步地，步骤(2)中加入提取液的比例为每1g蝇蛆幼虫加入10～15ml提取液，匀浆温度为4℃，离心温度为4℃，离心转速为12000rpm，离心时间为15～30min。
进一步地，步骤(3)中加入的硫酸铵的终浓度为60％～90％，静置时间为8～15h，离心温度为3～5℃，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为10～30min。
进一步地，步骤(3)中加入的硫酸铵的终浓度为80％，静置时间为8～12h，离心温度为4℃，离心转速为4000～4500rpm，离心时间为15～20min。
进一步地，步骤(4)中加入的提取液的体积为沉淀B体积的1～5倍，透析袋的截留分子量为3000-4500KD，透析温度为3～5℃，透析时间为4～6h，采用PEG10000进行浓缩。
进一步地，步骤(4)中加入的提取液的体积为沉淀B体积的2倍，透析袋的截留分子量为3500-4500KD，透析温度为3～5℃，透析时间为5h，采用PEG10000进行浓缩。
进一步地，步骤(5)中冷冻温度为-80～-60℃，融化温度为3～5℃，离心温度为3～5℃，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为8～15min。
进一步地，步骤(5)中冷冻温度为-80℃，融化温度为4℃，离心温度为4℃，离心转速为3500～4500rpm，离心时间为10min。
进一步地，步骤(6)中冻干的真空度为10～100Pa，温度为-70～-40℃。
本发明的有益效果是：
(1)本发明中的美白护肤品，以蝇蛆虫体生物活性组分作为功效成分，开发了蝇蛆虫体生物活性组分的新用途，经验证，将蝇蛆虫体生物活性组分应用于美白护肤品中，具有良好的美白、保湿、抗氧化效果，并且由于蝇蛆虫体生物活性组分中溶菌酶、抗菌肽的存在，美白护肤品还能起到消炎抗菌的效果。
(2)本发明的蝇蛆虫体生物活性组分制备方法，预先对二龄蝇蛆幼虫进行一定的刺激处理，可以增加其抗菌抗炎物质的数量和种类，传统的溶菌酶制品如鸡蛋清溶菌酶中含有的抗菌抗炎物质较为单一，而本发明中制备得到的为含有蝇蛆溶菌酶的混合提取物含有包括溶菌酶在内的多种活性成分，且含量较一般未对幼虫进行针刺或者菌悬液处理时有所提高。
(3)本发明的蝇蛆虫体生物活性组分制备方法，制备工艺简单，价格低廉。本发明中蝇蛆虫体生物活性组分制备采用瞬间冻死新鲜蝇蛆全虫，极大地减少了蝇蛆传统晒干等长时间处理过程中有效物质的损失，提高了提取物的药用效果。
(4)本发明的蝇蛆虫体生物活性组分制备方法中，所用提取液中含有必须的能溶解蛋白质的盐，抗氧化剂等物质，可以有效地将含有蝇蛆溶菌酶的虫体生物活性组分提取出来，且防止有效物质的失活，抗氧化剂的加入可以防止提取液的褐变同时保存其中原本存在的抗氧化物质，提高成品的美观性，透析袋透析处理不仅可以除去其中的盐，还可以将所加入的抗氧化物质去除，排除了其抗氧化作用是由于加入的抗氧化物质引起的可能，将提取液经过低温预冷可以更有效地防止有效物质的失活。
(5)本发明的蝇蛆虫体生物活性组分制备方法中，用合理配比的提取液对蝇蛆充分匀浆，可以使蝇蛆细胞破裂，使蝇蛆虫体的有效物质充分释放，增加蝇蛆中有效物质的溶出，同时对全虫进行匀浆可以保存存在于蝇蛆外壳中的一些抗氧化物质。
(6)本发明的蝇蛆虫体生物活性组分制备方法中，匀浆后再进一步经过离心脱脂减少油脂对有效组分的干扰，反复冻融进行除杂去除一些不稳定的大分子蛋白质，从而减少了能包裹有效组分的物质，使得有效组分能更好地与细胞接触，进一步提高了所制备的含有蝇蛆溶菌酶的虫体生物活性组分的抗菌消炎效果，透析除杂及透析除水及冻干等步骤可以最大程度上去除非活性成分及制备过程中引入的非虫体固有成分对后面活性实验的干扰，同时可以将活性成分进行浓缩，提高活性成分的浓度，
提高活性效价。
附图说明
图1为蝇蛆虫体生物活性组分中溶菌酶定性检测结果；
图2为大肠杆菌生长曲线和抑菌曲线；
图3为金黄色葡萄球菌生长曲线和抑菌曲线。
具体实施方式
以下实施例中所述蝇蛆幼虫为环裂亚目各科下的蝇的幼虫，包括但不限于家蝇、大头金蝇、麻蝇、丝光绿蝇。
实施例1
一种蝇蛆虫体生物活性组分，制备方法如下：
(1)当蝇蛆幼虫生长至二龄时，对蝇蛆幼虫进行针刺处理，待蝇蛆幼虫长至三龄，收集蝇蛆幼虫，用水反复漂洗，排尽虫体内容物，再将漂洗干净后的蝇蛆幼虫用酒精喷洒消毒；
(2)将漂洗消毒后的蝇蛆幼虫加入提取液(每1g蝇蛆幼虫加入15ml提取液)，4℃充分匀浆，将匀浆液于4℃下12000rpm离心20min，弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液A，备用；所述提取液为pH 6.5的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.2％的NaCl，体积分数为0.3％的β-巯基乙醇；
(3)向中间清液A中加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为80％，静置12h，4500rpm，4℃离心20min后去除上清液，得到沉淀B备用；
(4)将沉淀B加入提取液进行复溶，加入的提取液的体积为沉淀B体积的2倍，装入截留分子量为3500KD的透析袋中4℃中透析5h，再用PEG10000进行浓缩2h除去部分水，后取出溶液C备用；
(5)将溶液C置于-80℃冷冻成冰后取出于4℃中融化，将融化后的溶液于4℃中4500rpm离心10min除去沉淀，反复两次，得到上清液D备用；
(6)将上清液D冻干后-20℃保存，冻干时真空度为10Pa，温度为-70℃，时间为12h。
实施例2
一种蝇蛆虫体生物活性组分，制备方法如下：
(1)当蝇蛆幼虫生长至二龄时，在培养基中加入大肠杆菌和金黄葡萄球菌混合菌悬液，待蝇蛆幼虫长至三龄，收集蝇蛆幼虫，用水反复漂洗，排尽虫体内容物，再将漂洗干净后的蝇蛆幼虫用酒精喷洒消毒；
(2)将漂洗消毒后的蝇蛆幼虫加入提取液(每1g蝇蛆幼虫加入1ml提取液)，3℃充分匀浆，将匀浆液于3℃下11000rpm离心35min，弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液A，备用；所述提取液为pH 6的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.1％的NaCl，体积分数为0.1％的β-巯基乙醇；
(3)向中间清液A中加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为60％，静置8h，3000rpm，3℃离心30min后去除上清液，得到沉淀B备用；
(4)将沉淀B加入提取液进行复溶，加入的提取液的体积为沉淀B体积的1倍，装入截留分子量为3000KD的透析袋中3℃中透析4h，再用PEG10000进行浓缩2h除去部分水，后取出溶液C备用；
(5)将溶液C置于-80℃冷冻成冰后取出于3℃中融化，反复两次，，将融化后的溶液于3℃中3000rpm离心15min除去沉淀，得到上清液D备用；
(6)将上清液D冻干后-20℃保存，冻干时真空度为80Pa，温度为-50℃，时间为12h。
实施例3
一种蝇蛆虫体生物活性组分，制备方法如下：
(1)当蝇蛆幼虫生长至二龄时，在培养基中加入大肠杆菌和金黄葡萄球菌混合菌悬液，待蝇蛆幼虫长至三龄，收集蝇蛆幼虫，用水反复漂洗，排尽虫体内容物，再将漂洗干净后的蝇蛆幼虫用酒精喷洒消毒；
(2)将漂洗消毒后的蝇蛆幼虫加入提取液(每1g蝇蛆幼虫加入20ml提取液)，5℃充分匀浆，将匀浆液于5℃下13000rpm离心10min，弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液A，备用；所述提取液为pH 10的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为3％的NaCl，体积分数为1％的β-巯基乙醇；
(3)向中间清液A中加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为90％，静置15h，5000rpm，5℃离心10min后去除上清液，得到沉淀B备用；
(4)将沉淀B加入提取液进行复溶，加入的提取液的体积为沉淀B体积的5倍，装入截留分子量为4500KD的透析袋中5℃中透析6h，再用PEG10000进行浓缩2h除去部分水，后取出溶液C备用；
(5)将溶液C置于-60℃冷冻成冰后取出于5℃中融化，反复两次，，将融化后的溶液于5℃中4500rpm离心8min除去沉淀，得到上清液D备用；
(6)将上清液D冻干后-20℃保存，冻干时真空度为100Pa，温度为-40℃，时间为12h。
实施例4
含有蝇蛆虫体生物活性组分的美白防晒制剂中
材料：实施例1中的蝇蛆虫体生物活性组分冻干粉10g、硬脂酸甘油酯5g、凡士林10g、液状石蜡8g、甘油12g、十二烷基磺酸钠10g、羟苯乙酯0.11g，纯化水50ml。
制备：取硬脂酸甘油酯、白凡士林、液状石蜡加热融化为油相。另将甘油及纯化水加热至90℃，再加入十二烷基磺酸钠及羟苯乙酯为水相。然后将水相慢慢倒入油相中，边加边搅拌，直至冷凝，最后将蝇蛆虫体生物活性组分冻干粉加入搅拌均匀即得。
对比例
一种蝇蛆虫体生物活性组分，制备方法如下：
(1)当蝇蛆幼虫生长至三龄时，收集蝇蛆幼虫，用水反复漂洗虫体，排尽虫体内容物，再将漂洗干净后的蝇蛆幼虫用酒精喷洒消毒；
(2)将漂洗消毒后的蝇蛆幼虫加入提取液充分匀浆(每1g蝇蛆幼虫加入15ml提取液)，15000rpm，4℃离心15min后弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液，备用；所述提取液为pH 6.5的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.2％的NaCl，体积分数为0.3％的β-巯基乙醇；
(3)向步骤(2)所得的中间清液中加入硫酸铵，使硫酸铵终浓度为80％，静置12h，4500rpm，4℃离心30min后去除上清液，得到沉淀备用；
(4)将(3)所得沉淀加入(2)中所述提取液进行复溶，装入截留分子量为3500KD的透析袋中透析5h，再用PEG10000进行浓缩2h除去部分水，后取出溶液备用；
(5)将步骤(4)所得溶液置于-20℃冷冻成冰后取出融化，后离心除去沉淀，反复两次，得到上清液备用；
(6)将上清液冻干后-20℃保存，冻干时真空度为10Pa，温度为-30℃，时间为12h。
溶菌酶定性检测
采用western blot技术对蝇蛆虫体生物活性组分中的溶菌酶进行定性检测，具体步骤为：将制备得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳后转到0.45μm PVDF膜上，用5％脱脂奶粉封闭1.5h后用一抗(Rabbits,Anti-lysozyme,1：10000)4℃孵育过夜，取出膜用TBST洗，10min×3次，再用二抗(Goat-anti-Rabbit,1：5000)孵育1h后用TBST洗10min×3次；最后用ECL显影液进行显影观察，结果如图1所示。
溶菌酶定量检测
采用比浊法对蝇蛆虫体生物活性组分中的溶菌酶含量进行测定，具体步骤如下：
(1)配制系列浓度溶菌酶标准品溶液，0μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，16μg/ml，32μg/ml，64μg/ml；
(2)配制溶壁微小球菌悬浮液，浓度为250μg/ml；
(3)取溶菌酶标准液20μl与200μl菌液混匀，37℃孵育5min后测定吸光度，作出标准曲线；
(4)将各实施例中的冻干粉配置成浓度为15mg/ml的溶液，样品测定时取20μl样品与(2)中的溶壁微小球菌悬浮液混合，同法测定，得到吸光值后代入标准曲线进行计算样品的溶菌酶浓度。
经测定，实施例1、2、3和对比例1中的蝇蛆虫体生物活性组分的溶菌酶浓度为：19.98±1.04μg/ml、19.02±1.37μg/ml、18.84±1.43μg/ml和13.54±1.32μg/ml。结果表明，采用刺激处理的方法制备的蝇蛆虫体生物活性组分中溶菌酶的含量显著增加。
抑菌实验
本发明含有蝇蛆溶菌酶的虫体生物活性组分进行抑菌作用观察。
1.实验方法
1.1培养基配制
肉汤培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加蒸馏水到1000ml，调pH在7.2～7.5，分装于三角瓶中，100ml/瓶，灭菌处理后冷却密封保存待用。
1.2菌种活化
取出冻存于甘油中的菌种(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)20μl加入到肉汤培养基中，37℃恒温摇床上以160rpm速度震荡培养，溶液逐渐呈现混浊状态，约24h后，停止培养，此时的菌悬液作为活化好的菌种液。
1.3测定生长曲线
将活化好的菌种取3ml加入到97ml肉汤培养基中，放入恒温摇床中培养，依次在0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、22h、24h、28h、32h、38h、49h时取出300μl菌液测定OD600的值并记录，以时间为横轴，600nm处的吸光值为纵轴做出平滑曲线即为生长曲线。
1.4抑菌曲线的测定
抑菌曲线测定基本操作同生长曲线，只需要在加入菌悬液的同时加入蝇蛆虫体生物活性组分，使得蝇蛆虫体活性组分的浓度为16mg/ml，本实验中使用的是实施例1中的蝇蛆虫体生物活性组份。
2.实验结果
本发明制备的蝇蛆虫体生物活性组分对细菌的生长曲线有影响，可延长细菌的调整期，使细菌提前进入衰亡期。本发明所制备的含有蝇蛆溶菌酶的虫体生物活性组分对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌效果。
抗炎实验
抗炎实验中选用了实施例1中的蝇蛆虫体生物活性组分。
1.实验方法
MTT毒性实验：复苏实验室之前冻存起来的RAW264.7细胞，隔天进行传代，当传至第五代的时候按照5000个细胞/孔种板，放入培养箱中培养24h后进行给药，给药完成后放入培养箱中培养24h，避光加入浓度为5mg/ml的MTT试剂(Amresco,USA)，20μl/孔，继续培养4h，然后用注射器吸干各孔中的液体后按照100μl/孔加入DMSO溶剂，将96孔板放于摇床上5min使沉积于底部的紫色晶体完全溶解，最后用酶标仪测定540nm处的OD值。
抗炎实验：将RAW264.7细胞按照5.5万个/孔种板，放入培养箱中培养24h后进行分组，分为空白组、模型组和给药组，进行相对应的给药操作后继续培养24h后用一氧化氮试剂盒检测，即取出细胞培养上清液50μl放于另一块新的96孔板中，依次加入Griess试剂I和试剂II，排除气泡后用酶标仪测定在490nm处的OD值。
2.实验结果
蝇蛆虫体生物活性组分的浓度为15mg/ml时，细胞水平的炎症抑制率为40.7±1.5％，表明本发明所制备的含有蝇蛆溶菌酶的虫体生物活性组分具有明显的抗炎效果。
同样的方法测定得到的鸡蛋清溶菌酶标准品浓度为4mg/ml时，细胞水平的验证抑制率为25.2±3.1％。
临床试验
临床试验中选择10名不同年龄的皮肤皲裂且肤色较深的患者，使用实施例4中制备的美白护肤品，为避免过敏现象的发生，每位受试者在开始大面积使用之前均会将实施例4中的产品涂抹于耳部后侧皮肤和上臂内侧皮肤，无过敏反应才可进行使用其它部位涂抹。其它部位在涂抹方法：入睡前将需要涂抹的部位洗净，然后取适量实施例4中的产品，充分抹匀，第二天早上洗去。受试者在连续试用实施例4中的产品一周后，皮肤皴裂现象明显改善，且由于皴裂引起的皮肤伤口明显无红肿现象，无刺痛感，说明伤口在愈合；继续试用一周，皴裂部位已经完全愈合，新长出了组织；在继续使用一个月左右后(时间因人而异)，本次试验中的10位受试者中有四位年龄在30岁以下的在使用半个月后发现肤色有改善，脸上的晒斑明显淡化，另外30岁到40岁之间的三位在连续使用25天后皮肤明显变白，其它的几位年龄稍长者的皴裂现象改善较为明显，但是肤色变化不显著，只是稍微比之前细腻一些，看上去没那么粗糙。

Claims (10)

1.一种美白护肤品，其中含有蝇蛆虫体生物活性组分、常规辅料和赋形剂，蝇蛆虫体生物活性组分的制备方法包括以下步骤：
(1)当蝇蛆幼虫生长至二龄时，对蝇蛆幼虫进行刺激处理，待蝇蛆幼虫长至三龄，收集蝇蛆幼虫，用水反复漂洗，排尽虫体内容物，再将漂洗干净后的蝇蛆幼虫消毒处理；
(2)将漂洗干净并消毒后的蝇蛆幼虫加入提取液充分匀浆，离心后弃去上层油脂和不溶性沉淀，得中间清液A，备用；
(3)向中间清液A中加入硫酸铵，静置，离心后去除上清液，得到沉淀B备用；
(4)将沉淀B加入提取液进行复溶，透析后进行浓缩除去部分水，取出溶液C备用；
(5)将溶液C冷冻成冰后取出融化，离心除去沉淀，得到上清液D备用；
(6)将上清液D冻干即可。
2.根据权利要求1所述的美白护肤品，其特征在于：刺激处理为针刺处理或者在培养基中加入菌悬液。
3.根据权利要求1所述的美白护肤品，其特征在于：提取液为pH 6～10的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.1％～3％的NaCl，体积分数为0.1％～1％的β-巯基乙醇。
4.根据权利要求1或3所述的美白护肤品，其特征在于：提取液为pH 6～8的Tris-HCl缓冲液，其中含有质量分数为0.1％～1.5％的NaCl，体积分数为0.1％～0.3％的β-巯基乙醇。
5.根据权利要求1所述的美白护肤品，其特征在于：步骤(2)中加入提取液的比例为每1g蝇蛆幼虫加入1～20ml提取液，匀浆温度为3～5℃，离心温度为3～5℃，离心转速为11000～13000rpm，离心时间为10～35min。
6.根据权利要求1所述的美白护肤品，其特征在于：步骤(3)中加入的硫酸铵的终浓度为60％～90％，静置时间为8～15h，离心温度为3～5℃，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为10～30min。
7.根据权利要求1所述的美白护肤品，其特征在于：步骤(4)中加入的提取液的体积为沉淀B体积的1～5倍，透析袋的截留分子量为3000-4500KD，透析温度为3～5℃，采用PEG10000进行浓缩。
8.根据权利要求1所述的美白护肤品，其特征在于：步骤(5)中冷冻温度为-80～-60℃，融化温度为3～5℃，离心温度为3～5℃，离心转速为3000～5000rpm，离心时间为8～15min。
9.根据权利要求1或8所述的美白护肤品，其特征在于：步骤(5)中冷冻温度为-80℃，融化温度为4℃，离心温度为4℃，离心转速为3500～4500rpm，离心时间为10min。
10.根据权利要求1所述的美白护肤品，其特征在于：步骤(6)中冻干的真空度为10～100Pa，温度为-70～-40℃。
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