CN104237392A - 一种戊乙奎醚中杂质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种戊乙奎醚中3-奎宁酮、3-奎宁醇、苯基环戊基甲酮、苯基环戊基环氧乙烷、α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇等5个杂质的检测方法，该方法采用气相色谱法测定杂质的含量。在测定时，将戊乙奎醚用二甲基甲酰胺溶解配制成供试品溶液；杂质对照品同法处理，配制成杂质对照品溶液。分别取供试品溶液、杂质对照品溶液直接进样，采集色谱图，按外标法以峰面积计算杂质含量。本发明的方法具有操作简便、灵敏度高、可定量测定、准确度高、重现性好的特点，以有效控制戊乙奎醚的产品质量，保证临床用药的安全有效。

Description

一种戊乙奎醚中杂质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物中杂质的检测方法，具体地涉及戊乙奎醚中3-奎宁酮、3-奎宁醇、苯基环戊基甲酮、苯基环戊基环氧乙烷、α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇的检测方法。

背景技术

戊乙奎醚，化学名：3-(2-环戊基-2-羟基-2-苯基乙氧基)奎宁环烷。化学式为

Ⅰ

本品的盐酸盐系新型选择性抗胆碱药，能通过血脑屏障进入脑内。它能阻断乙酰胆碱对脑内毒蕈碱受体和烟碱受体的激动作用；因此，能较好地拮抗有机磷毒物中毒引起的中枢中毒症状，如惊厥、中枢呼吸循环衰竭和烦躁不安等。同时，在外周也有较强的阻断乙酰胆碱对M受体的激动作用；因而，能较好地拮抗有机磷毒物（农药）中毒引起的毒蕈碱样中毒症状，如支气管平滑肌痉挛和分泌物增多、出汗、流延、缩瞳和胃肠道平滑肌痉挛或收缩等。它还能增加呼吸频率和呼吸流量，由于本品对M2受体无明显作用，故对心率无明显影响；对外周N受体无明显拮抗作用。

盐酸戊乙奎醚临床用于麻醉前给药以抑制唾液腺和气道腺体分泌和有机磷毒物（农药）中毒急救治疗和中毒后期或胆碱酯酶（ChE）老化后维持阿托品化。由于盐酸戊乙奎醚确切的疗效，该药在临床中已得到广泛的运用，市场前景广阔。

在戊乙奎醚的制备过程中，3-奎宁酮Ⅱ（以下简称杂质Ⅱ）、3-奎宁醇Ⅲ（以下简称杂质Ⅲ）、苯基环戊基甲酮Ⅳ（以下简称杂质Ⅳ）、苯基环戊基环氧乙烷Ⅴ（以下简称杂质Ⅴ）是其合成中的重要的中间体。而戊乙奎醚在储存过程中也会产生降解产物杂质Ⅲ和α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇Ⅵ（以下简称杂质Ⅵ）。为确保临床用药的安全有效，有必要对戊乙奎醚制备工艺中引入的杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和储存过程中的降解杂质Ⅲ、Ⅵ进行严格的控制。

目前，药物杂质的常用检测方法首选高效液相色谱法（HPLC），但是，杂质Ⅱ、Ⅲ在常用的反相高效液相色谱柱中不保留，同时本身无紫外吸收，采用高效液相色谱法紫外检测器很难进行检测，使用蒸发光检测器和示差折光检测器时，杂质Ⅱ、Ⅲ的检测灵敏度低，重现性差。而杂质Ⅴ在反相高效液相色谱法酸性流动相中易水解。国家标准WS1-(X-026)-2004Z中采用了薄层色谱法对杂质Ⅲ进行检测，但薄层色谱法检测存在受温度、湿度、试剂种类、点样技术等环境影响较多、重现性低、显色不明显的缺点，同时对检测结果只能达到半定量，且操作误差较大。同时该标准规定杂质Ⅲ检测限度仅为0.25%，不能满足日益提高的对药品杂质严格控制的限度要求。杂质IV和杂质VI的检测未见报道。因此，迫切需要建立一种操作简便、灵敏度高、可定量测定、准确度高、重现性好的戊乙奎醚中的杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于建立一种戊乙奎醚中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的检测方法，以有效控制戊乙奎醚的产品质量，保证临床用药的安全有效。

本发明采用气相色谱法（GC）检测杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的含量，可通过一次测定就可同时检测5种杂质的含量，操作简便、灵敏度高、准确度高、重现性好，且可定量测得杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的含量，弥补了现有技术的不足。

戊乙奎醚和杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ化学性质不同，因此气相色谱溶剂的选择很重要，必须要选择一种溶剂，可以同时溶解戊乙奎醚及5个杂质，同时溶剂峰、戊乙奎醚峰及5个杂质峰的分离度也要符合要求。本发明人经过多次试验，选定二甲基甲酰胺（简称DMF）作为气相色谱溶剂，可以达到以上要求。该溶剂对上述物质溶解性好，溶剂峰和戊乙奎醚峰及杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ峰分离度良好。

本发明所述的具体技术方案如下。

本发明所述戊乙奎醚中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ气相色谱的检测方法，其色谱条件如下：

色谱柱：5%二苯基/95%二甲基聚硅氧烷Amine毛细管色谱柱或极性相近似的氨基检测柱，如：Rtx®-5 Amine (30m×0.25mm，0.5μm)、TG-5MS AMINE(30m×0.25mm，0.5μm) 。

检测器：氢火焰离子化检测器(FID)，温度280℃-300℃，优选300℃。

进样口温度：150℃-230℃，优选190℃。通过戊乙奎醚的热分析数据可知，戊乙奎醚从150℃开始挥发， 230℃后开始分解。若进样口温度过低，样品无法完全气化，达不到定量检测的目的，同时还会造成进样口残留，影响下一次测定。如果温度过高戊乙奎醚会分解出杂质造成检测不准确。优选190℃。

柱温：程序升温，初温70-150℃，然后以每分钟3℃-25℃的升温速率升到终温275-315℃，保持终温至主峰出尽。被测定物质均为高沸点物质，柱初温不能太低，但柱初温太高杂质不易分开，柱初温优选90℃；柱终温升到275-315℃，是为了保证主成分完全出峰而不存在柱残留影响下一次测定。为了避免柱温过高而令色谱柱受损，柱终温优选300℃；确定柱初温和柱终温后，本领域普通技术人员可根据气相色谱仪等色谱硬件的具体情况调整升温程序和升温速率，使杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的分离度达到要求。整个程序升温过程优选初温90℃，保持1分钟，以每分钟8℃的升温速率升温到300℃，保持8分钟。

柱流速：1.0-4. 0ml/min，优选2.5ml/min；

分流比：10:1-1:1，优选 4：1；

进样量：2μl；

其中，柱流速、分流比、进样量可以不进行特别限制，本领域技术人员可根据气相色谱仪的不同而进行相应的调整。

供试品溶液的配制：取戊乙奎醚适量，精密称定，用DMF溶解配制成每1ml中含戊乙奎醚5mg的溶液。

杂质对照品溶液的配制：分别取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ对照品适量，精密称定，各用DMF溶解配制成每1ml中含杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ对照品 5μg的溶液。

测定法：分别取供试品溶液、杂质对照品溶液2μl直接进样，采集色谱图，按外标法以峰面积计算结果；

式中A_杂为供试品中杂质的峰面积；A_对为杂质对照品的峰面积；C_对为杂质对照品的浓度；C_供为戊乙奎醚供试品溶液的浓度。

本发明所述的检测方法，可采用常用的气相色谱仪，如TRACE GC ΜLTRA气相色谱仪。

采用本发明所述检测方法测定戊乙奎醚中的杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的含量，具有以下优势：

1、可定量测定杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的含量：采用本发明的方法，用气相色谱法进行检测，相对目前国家药品标准WS1-(X-026)-2004Z中的薄层色谱法，可直接测得峰面积，通过外标法计算出戊乙奎醚中杂质的具体含量，增加了药品质量的可控性，为戊乙奎醚中杂质的检测提供了更直接、稳定的分析方法。

2、灵敏度高、准确度好：通过多次实验证实，本发明提供的检测方法，戊乙奎醚中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的定量限分别为1.0ng(0.5μg/ml)、2.4ng(1.2μg/ml)、0.3ng(0.15μg/ml)、1.0ng(0.5μg/ml)、1.0ng(0.5μg/ml)，大大提高了检测灵敏度；经过加样回收试验，杂质会回收率在90-110%之间，该方法准确可控。为严格控制戊乙奎醚的质量，提高质量标准提供了可靠的检验基础。

3、方法简单、操作简便易行：本发明所述的检测方法，使用一个检测系统，通过一次测定就可同时检测5种杂质的含量，且操作简便易行。

附图说明

图1本发明实施例1中DMF溶剂的气相色谱图；

图2本发明实施例1中3-奎宁酮对照品溶液的气相色谱图；

图3本发明实施例1中3-奎宁醇对照品溶液的气相色谱图；

图4本发明实施例1中苯基环戊基甲酮对照品溶液的气相色谱图；

图5本发明实施例1中苯基环戊基甲酮对照品溶液的气相色谱图；

图6本发明实施例1中α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇对照品溶液的气相色谱图；

图7本发明实施例1 中戊乙奎醚供试品溶液的气相色谱图；

图8本发明实施例2中3-奎宁酮线性关系图；

图9本发明实施例2中3-奎宁醇线性关系图；

图10本发明实施例2中苯基环戊基甲酮线性关系图；

图11本发明实施例2中苯基环戊基甲酮线性关系图；

图12本发明实施例2中α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇线性关系图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。

实施例1

主要仪器及色谱条件：

主要主要仪器及色谱条件：

TRACE GC ULTRA气相色谱仪，配氢火焰离子化检测器(FID)，温度300℃，自动进样器，Chromeleon色谱工作站。

色谱柱： Rtx®-5 Amine (30m×0.25mm，0.5μm)

柱 温：初温90℃，保持1分钟，以每分钟8℃的升温速率升温到300℃，保持8分钟。

柱流速：2. 5ml/min；

进样口温度：190℃；

分流比： 4:1；

进样量：2ul。

戊乙奎醚由重庆先洋医药科技有限公司提供，批号 110900。

杂质Ⅱ对照品由重庆先洋医药科技有限公司提供，批号 110601。

杂质Ⅲ购自Sigma，批号MKBF3377V。

杂质Ⅳ购自AlfaAesar，批号10121293。

杂质Ⅴ对照品由重庆先洋医药科技有限公司提供，批号 110401。

杂质Ⅵ对照品由重庆先洋医药科技有限公司提供，批号 110501。

供试品溶液的配制：取戊乙奎醚适量，精密称定，用DMF溶解配制成每1ml中含戊乙奎醚5mg的溶液。

杂质对照品溶液的配制：分别取杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ对照品适量，精密称定，各用DMF溶解配制成每1ml中含杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ对照品 5μg的溶液。

分别取DMF、供试品溶液、杂质对照品溶液2μl直接进样，采集色谱图（如图1~7），按外标法以峰面积计算结果。

其中图1为溶剂DMF色谱图；图2~6为杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ对照品溶液色谱图，如图可见杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的保留时间分别为5.128min、5.552min、9.765min、9.912min和11.420min。根据供试品溶液色谱图中杂质峰的保留时间确定杂质存在；根据杂质的出峰面积计算供试品中杂质的含量（图7）。

杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的含量分别为：0.03%、0.02%、0.02%、0.01%、0.02%。

实施例2：方法学验证试验

按照实施例1的色谱条件和操作方法，分别从专属性、精密度、线性、检测限与定量限、加样回收率、稳定性方面进行了方法学验证，结果如下：

(1)专属性：

分别取溶剂DMF、供试品溶液（戊乙奎醚溶液）、对照品溶液、戊乙奎醚与对照品Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ混合溶液，依次进样。结果表明，溶剂有保留时间为1.370min、2.565min、2.939min、3.331min的峰，杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的保留时间分别为5.128min、5.552min、9.765min、9.912min和11.420min，戊乙奎醚保留时间为14.948min。溶剂与戊乙奎醚及杂质对照品分离度良好，戊乙奎醚与杂质对照品不产生干扰，此方法专属性强。

(2)精密度：

取杂质对照品溶液依法进样6次，采集色谱图，结果见表1：

表1 精密度计算结果

结果表明，同一浓度下进样6次得各杂质峰的RSD%均小于10%，符合外标法计算要求，故该色谱条件下精密度良好。

(3)线性：

取杂质对照品Ⅱ~Ⅵ储备液依次稀释成最低浓度为0.5 μg/ml、1.2 μg/ml、0.15 μg/ml、0.5 μg/ml、0.5μg/ml，其余各点杂质浓度均为1.0μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml、4.0μg/ml、5.0μg/ml、6.0μg/ml、7.0μg/ml浓度的系列溶液，依法进样，测得浓度线性关系(附图8～12)。

结论：

杂质Ⅱ在0.5～7.0μg/ml浓度范围内时，线性关系良好，相关系数为0.9943。

杂质Ⅲ在1.2～7.0μg/ml浓度范围内时，线性关系良好，相关系数为0.9966。

杂质Ⅳ在0.15～7.0μg/ml浓度范围内时，线性关系良好，相关系数为0.9933。

杂质Ⅴ在0.5～7.0μg/ml浓度范围内时，线性关系良好，相关系数为0.9967。

杂质Ⅵ在0.5～7.0μg/ml浓度范围内时，线性关系良好，相关系数为0.9999。

(4)检测限与定量限：

分别取杂质对照品溶液用DMF依次稀释成系列浓度溶液，依法测试，得

杂质Ⅱ检测限为0.5ng（0.25μg/ml）、定量限为1.0ng（0.5μg/ml）。

杂质Ⅲ检测限为0.8ng（0.4μg/ml）、定量限为2.4ng（1.2μg/ml）。

杂质Ⅳ检测限为0.10ng（0.5μg/ml）、定量限为0.30ng（0.15μg/ml）。

杂质Ⅴ检测限为0.24ng（0.12μg/ml）、定量限为1.0ng（0.5μg/ml）。

杂质Ⅵ检测限为0.30ng（0.15μg/ml）、定量限为1.0ng（0.5μg/ml）。

(5)加样回收率：

在戊乙奎醚供试品溶液中，分别加入低、中、高质量的杂质对照品，配制成含杂质0.08%、0.1%、0.12%的溶液，依法测定，结果见表2：

表2 回收率测定结果

结果显示，三种浓度下测得加样回收率均在90%～110%，符合气相回收率计算要求，证明了该方法准确可控。

(6)稳定性：

取3-奎宁醇对照品溶液放置12小时分别取不同时段内样品进样，结果见表3：

表3 溶液稳定性试验结果

由结果可知，各杂质对照品溶液稳定性RSD%均小于10%，符合外标法计算要求，杂质对照品溶液12小时稳定。

(7)样品测定：

用上述方法测定多批盐酸戊乙奎醚，结果见表4：

表4 样品中杂质Ⅱ、Ⅲ的含量测定结果（%）

以上结果表明，本方法灵敏度高，重现性好，结果真实可靠，能准确测定出戊乙奎醚中杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的含量。

实施例3

参照实施例1的方法，对进样口温度进行考察。结果见表5：

表5 进样口温度考察结果（%）

以上结果表明，进样口温度在150-230℃范围内进行测定，杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分离良好，能实现准确测定。

实施例4

参照实施例1的方法，对柱温的初温、终温及升温速率条件进行考察。结果见表6：

表6不同柱温条件考察结果

结果表明，柱温初温较低时升温速率可适当快一点，初温较高时升温速率可适当慢一点，杂质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ分离良好。在柱温终温变化时，柱终温在275-315℃之间的测定结果无明显差异。

Claims (9)

1.一种戊乙奎醚中杂质的检测方法，其特征在于采用气相色谱法进行检测，将戊乙奎醚用二甲基甲酰胺溶解配制成供试品溶液；3-奎宁酮、3-奎宁醇、苯基环戊基甲酮、苯基环戊基环氧乙烷、α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇杂质对照品分别同法处理，配制成杂质对照品溶液；分别取供试品溶液、杂质对照品溶液直接进样，采集色谱图，按外标法以峰面积计算杂质含量。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：

供试品溶液的配制：取戊乙奎醚适量，精密称定，用二甲基甲酰胺溶解配制成每1ml中含戊乙奎醚5mg的溶液；

杂质对照品溶液的配制：分别取杂质3-奎宁酮、3-奎宁醇、苯基环戊基甲酮、苯基环戊基环氧乙烷、α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇对照品适量，精密称定，用二甲基甲酰胺溶解配制成每1ml中各含3-奎宁酮、3-奎宁醇、苯基环戊基甲酮、苯基环戊基环氧乙烷、α-苯基-α-环戊基-α-羟基乙醇5μg的溶液。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于色谱条件如下：

色谱柱：5%二苯基/95%二甲基聚硅氧烷Amine毛细管色谱柱或极性相近似的氨基检测柱；

检测器：氢火焰离子化检测器，温度280℃-300℃；

进样口温度：150℃-230℃；

柱温：程序升温，初温70-150℃，终温275-315℃，升温速率为每分钟3-25℃。

4.根据权利要求3所述的一种戊乙奎醚中杂质的检测方法，其特征在于所述的分流进样口温度为190℃。

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述柱温条件的初温为90℃。

6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的柱温终温为300℃。

7.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的柱温条件为初温90℃，保持1分钟，以每分钟8℃的升温速率升温到300℃，保持8分钟。

8.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱为5%二苯基/95%二甲基聚硅氧烷Amine毛细管色谱柱。

9.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于色谱条件还包括：柱流速为2.5 ml/min，分流比为4:1，进样量为2μl。