CN104232700A

CN104232700A - 一种生物法生产(2r,3s)羟基丙酸甲酯的方法

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Publication number: CN104232700A
Application number: CN201410518186.XA
Authority: CN
Inventors: 高鑫; 王美玲; 刘鹏程; 尚凤霞; 刘均洪
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2014-10-01
Filing date: 2014-10-01
Publication date: 2014-12-24

Abstract

一种生物法生产(2R,3S)羟基丙酸甲酯的方法。一种南极假丝酵母细胞生物还原制备光活性(-)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯的方法，反应罐中加入磷酸盐缓冲液，用单硬脂酸甘油酯乳化，加入南极假丝酵母细胞进行生物还原反应，产品收率高，对映体过量率高，具有很好的应用前景。

Description

一种生物法生产(2R,3S)羟基丙酸甲酯的方法

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到南极假丝酵母细胞生物还原制备手性医药中间体(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯的技术。

背景技术

羟基手性酯是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化羰基化合物的不对称还原具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性酯的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的羟基手性酯。生物催化制备羟基手性酯具有很好的应用前景。

生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物还原法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。

生物还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。

(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯。

发明内容

本发明采用细胞催化制备(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应式如下：

底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯（1）经南极假丝酵母催化还原，得到产物(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯（2）。有多种微生物可以催化还原，经过大量实验筛选，最终确定采用南极假丝酵母作为催化剂，因为其催化还原1的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。

许多南极假丝酵母都可以进行生物催化还原，然而，其效果不同，相差显著，经实验，本发明选用南极假丝酵母菌株为ATCC 34888 。

培养介质：

1、　培养液成份：葡萄糖20-25 g/L，淀粉15-20g/L,黄豆粉30-40 g/L，酵母浸膏8-10 g/L，吐温0.6-0.8 g/L ， KH₂PO₄ 2-2.4 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，豆油20-25 mL/L，麦芽浸膏20-25 g/L。

2、固体培养基成份：在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。

酵母细胞制备。南极假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-26℃，将南极假丝酵母ATCC 34888种子液接种至发酵罐，接种比例为8-10％，通气比为0.8-1V/（V分钟），即每分钟通气量为0.8-1倍发酵液体积，24-26℃培养45-48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.8，底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯浓度为90-100 g/L，葡萄糖含量为 6-9g/L，木糖8-10 g/L，单硬脂酸甘油酯含量为12-15g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至24-26℃时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿南极假丝酵母细胞使浓度为10-13g/L，通气比为0.1-0.13V/（V分钟），即每分钟通气量为0.1-0.13倍反应液体积，进行生物还原反应，反应时间为71-80小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应转化率93-95％，产品收率92-93％，对映体过量率（ee%）98-99％。

本发明所开展工作包括菌株选择（从近百个菌株中选择）、催化还原条件优化（反应温度、通气量、pH）、反应介质选择和浓度优化（底物浓度、葡萄糖含量、木糖含量、表面活性剂种类（20多种选1）及浓度、其它多种成份选择排除），还曾进行了水-有机溶剂2相体系试验。由于试验量很大，尽管采用了响应面优化设计试验，大幅度减少了试验量，试验量仍然很大，全部试验进行2年多才完成，达成目前的技术方案。对于光活性产物而言，当反应转化率94-96％，产品收率92-94％时，对映体过量率（ee%）仍然高达98-99％，是非常不易的，我们的工作取得了显著进步。

实施例 1 　

南极假丝酵母培养液成份为：葡萄糖20 g/L，淀粉20g/L,黄豆粉30 g/L，酵母浸膏8g/L，吐温0.6 g/L ， KH₂PO₄ 2.4 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3 g/L，豆油20mL/L，麦芽浸膏20 g/L；固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。

湿酵母细胞制备过程如下：南极假丝酵母ATCC 34888经斜面、摇瓶培养，得到种子液。10L发酵罐加入培养液，装料系数为0.6，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24℃，将酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9％，通气比为0.8V/（V分钟），即每分钟通气量为0.8倍发酵液体积。24℃培养45小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

15L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6， pH为6.8，底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯浓度为90 g/L，葡萄糖含量为 6g/L，木糖8 g/L，单硬脂酸甘油酯含量为12g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至24℃时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿南极假丝酵母细胞使浓度为13g/L，通气比为0.13V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为80小时；反应结束后，滤出细胞，反应液用0.4倍反应液体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应转化率93％，产品收率92％，对映体过量率（ee%）99％。

实施例 2 　

培养液成份为：葡萄糖25 g/L，淀粉20g/L,黄豆粉40 g/L，酵母浸膏10 g/L，吐温0.8 g/L ， KH₂PO₄ 2.4 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.4 g/L，豆油25 mL/L，麦芽浸膏25 g/L；固体培养基成份：在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。

湿酵母细胞制备过程如下：南极假丝酵母ATCC 34888经斜面、摇瓶培养，得到种子液。50L发酵罐加入培养液，装料系数为0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至26℃，将酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为10％，通气比为1V/（V分钟），即每分钟通气量为1倍发酵液体积。24℃培养45小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

100L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6，pH为6.8，底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯浓度为100 g/L，葡萄糖含量为9g/L，木糖10 g/L，单硬脂酸甘油酯含量为15g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26℃时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿南极假丝酵母细胞使浓度为10g/L，通气比为0.1V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为71小时；反应结束后，滤出细胞，反应液用0.4倍反应液体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应转化率95％，产品收率93％，对映体过量率（ee%）98％。

实施例 3 　

培养液培养液成份为：葡萄糖22 g/L，淀粉18g/L,黄豆粉35 g/L，酵母浸膏9g/L，吐温0.7 g/L ， KH₂PO₄ 2.3g/L，MgSO₄.7H₂O 0.35 g/L，豆油22 mL/L，麦芽浸膏22 g/L；固体培养基成份：在液体培养基中加入1.8%的琼脂粉。

湿酵母细胞制备过程如下：南极假丝酵母ATCC 34888经斜面、摇瓶培养，得到种子液。500L发酵罐加入培养液，装料系数为0.62，121℃高压灭菌30分钟，冷却至25℃，将酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9.5％，通气比为0.9V/（V分钟），即每分钟通气量为0.9倍发酵液体积。25℃培养45-48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

1000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.65，pH为6.8，底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯浓度为95 g/L，葡萄糖含量为 8g/L，木糖9g/L，单硬脂酸甘油酯含量为13g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至25℃时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿南极假丝酵母细胞使浓度为12g/L，通气比为0.11V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为76小时；反应结束后，滤出细胞，反应液用0.4倍反应液体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应转化率94％，产品收率92-93％，对映体过量率（ee%）99％。

实施例 4 　

培养液培养液成份为：葡萄糖25 g/L，淀粉19g/L,黄豆粉307 g/L，酵母浸膏8.9g/L，吐温0.72 g/L ， KH₂PO₄ 2.3g/L，MgSO₄.7H₂O 0.34 g/L，豆油23 mL/L，麦芽浸膏24 g/L；固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。

湿酵母细胞制备过程如下：南极假丝酵母ATCC 34888经斜面、摇瓶培养，得到种子液。2000L发酵罐加入培养液，装料系数为0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至26℃，将酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为10％，通气比为1V/（V分钟），即每分钟通气量为1倍发酵液体积。26℃培养48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

10000L底部通气搅拌反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.65， pH为6.8，底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯浓度为100 g/L，葡萄糖含量为9g/L，木糖10 g/L，单硬脂酸甘油酯含量为15g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至26℃时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿南极假丝酵母细胞使浓度为13g/L，通气比为0.13V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为80小时；反应结束后，滤出细胞，反应液用逆流萃取机萃取，乙酸乙酯为萃取液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应转化率95％，产品收率93％，对映体过量率（ee%）98.5％。

Claims

1.一种南极假丝酵母细胞生物还原制备(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯的方法，其特征在于反应罐中加入磷酸盐缓冲液，装料系数为0.6-0.7，pH为6.8，底物2-苯甲酰-2-丙烯酸甲酯浓度为90-100 g/L，葡萄糖含量为 6-9g/L，木糖8-10 g/L，单硬脂酸甘油酯含量为12-15g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至24-26℃时，剧烈搅拌，使反应液乳化，加入湿南极假丝酵母细胞使浓度为10-13g/L，通气比为0.1-0.13V/（V分钟），进行生物还原反应，反应时间为71-80小时；反应结束后，滤出细胞，用乙酸乙酯萃取反应液，蒸出乙酸乙酯，得到产物(−)-(2R,3S)-3-羟基-2-苯基丙酸甲酯，反应转化率93-95％，产品收率92-93％，对映体过量率（ee%）98-99％。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于湿南极假丝酵母细胞制备过程如下：南极假丝酵母经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至24-26℃，将酵母种子液接种至发酵罐，接种比例为9-10％，通气比为0.8-1V/（V分钟），24-26℃培养45-48小时，用过滤式离心机离心得到湿酵母细胞，用作生物还原反应催化剂。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于培养液成份为：葡萄糖20-25 g/L，淀粉15-20g/L,黄豆粉30-40 g/L，酵母浸膏8-10 g/L，吐温0.6-0.8 g/L ， KH₂PO₄ 2-2.4 g/L，MgSO₄.7H₂O 0.3-0.4 g/L，豆油20-25 mL/L，麦芽浸膏20-25 g/L；固体培养基成份：在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。