CN104224863A

CN104224863A - 金钱草总黄酮在制备降低高尿酸血症药物中的应用

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Publication number: CN104224863A
Application number: CN201410294947.8A
Authority: CN
Inventors: 温尧林; 姚譞; 夏增华
Original assignee: Shanghai Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Technology Co Ltd; SUZHOU KAIXIANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Technology Co Ltd; SUZHOU KAIXIANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2014-06-25
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2034-06-25
Also published as: CN104224863B

Abstract

本发明涉及金钱草总黄酮在制备降低高尿酸血症药物中的应用，金钱草总黄酮中总黄酮含量在60%以上，并且含有山柰酚7.0wt%~10.0wt%、槲皮素6.0wt%~9.0wt%、芦丁5.0wt%~9.0wt%、表儿茶素7wt%~10wt%、橙皮苷7.0wt%~10wt%。本发明金钱草总黄酮不仅总黄酮含量高，成分明确，而且在低剂量条件下具有明显降低高尿酸血症模型小鼠血清尿酸的作用，安全性高，是非常好的降低高尿酸，治疗痛风药物。此外，本发明的金钱草总黄酮制备工艺简单，适合工业化生产和应用。

Description

金钱草总黄酮在制备降低高尿酸血症药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种制备治疗高尿酸血症药物的植物提取物总黄酮的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，由于人们压力的增大以及对高热量、高蛋白、高脂食物摄取的增加，使得患有高尿酸血症或由其引起的痛风症状的人数急剧增多，据报道目前约两成的成年男性处于高尿酸血症的状态。

一般而言，血中的尿酸值为7.0mg/dL以上的状态称为高尿酸血症。通常，单纯的高尿酸血症状态没有自觉症状，但是如果长时间放任该状态，则血中的尿酸盐发生结晶，该尿酸盐蓄积于关节等中时，会引起伴有剧烈疼痛的痛风发作。上述症状如果进一步发展，则会在皮下产生痛风结节或者在肾脏及尿路中蓄积尿酸结晶而容易产生尿路结石，若长期持续则可以引起肾衰竭等肾疾病。因此，适当控制血中的尿酸值是预防、改善以痛风为代表的高尿酸血症的根本。

目前，对血中尿酸的控制是通过两种途径实现的，一是抑制尿酸的生成：黄嘌呤氧化酶是次黄嘌呤转化为黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸所必需的酶，治疗痛风的一条有效途径是抑制黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XO)活性，从而抑制尿酸的形成；抑制尿酸生成的药物如别嘌呤醇；二是促进尿酸的排泄，促进尿酸排泄的药物如丙磺舒、苯溴马龙等。但上述药物毒副作用大，例如别嘌呤醇可引发变态反应(发生率10-15％)、超敏综合症(27.5％斑丘疹患者死亡)、骨髓抑制等严重毒副作用；丙磺舒、苯溴马隆具有胃肠道反应、肾绞痛及激发痛风急性发作等副作用，在一定程度上限制了这些药物的临床应用。因此，寻找新型的高效低毒的抗痛风和高尿酸血症药物依然是目前药学研究的一个热点。

金钱草为常用中药。《中国药典》2010年版一部收载本品为报春花科植物过路黄(Lysimachia christinae Hance)的干燥全草，具清利湿热，通淋，消肿的功效，主要用于热淋，沙淋，尿湿作痛，黄疸尿赤，痈肿疔疮，毒蛇咬伤，肝胆结石，尿路结石，使用历史悠久。

金钱草是治疗结石的临床常用的中药之一。临床实验和动物实验证明其具有较好利胆排石、利尿排石、防止尿结石等作用。同时还具有抗炎、镇痛作用。除了传统的排石作用之外，金钱草在临床应用上还具有治疗痛风的作用。南京中医药大学附属医院刘再朋教授,从事中医外科工作五十多年,在外科领域有很深的造诣，刘再朋教授根据多年临床经验，潜心研究的“痛风定痛汤”，利用金钱草等多味中药临床治疗痛风病患者，取得一定的疗效[薛建辉刘再朋教授治疗痛风性关节炎的经验中医研究2004；17(3)47-49]。但是在临床应用中，金钱草都是跟其它植物共同应用，形成复方，并无法推断金钱草在其中的作用以及有效成分。

魏绍煌[金钱草及其民间混用品种对高尿酸血症小鼠的效用，药物研究，2006，15(10)，10-11]等对金钱草及其民间混用品对高尿酸血症小鼠的降尿酸作用进行了研究。但是在魏的研究中，仅仅使用水提液进行药效评估，没有明确其活性成分，同时其药效评估剂量达到12.5g/kg，远远超出成药剂量，没有可行性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题的克服现有技术的不足，提供一种金钱草总黄酮在制备降低高尿酸血症药物中的应用，该金钱草总黄酮中黄酮含量高，成分明确，在低剂量条件下具有明显降低高尿酸血症模型小鼠血清尿酸的作用，安全性高。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

金钱草总黄酮在制备降低高尿酸血症药物中的应用，该金钱草总黄酮中含有山柰酚8.0wt％～9.0wt％、槲皮素7.0wt％～8.0wt％、芦丁7.0wt％～8.0wt％、表儿茶素8.5wt％～9.5wt％、橙皮苷8.0wt％～9.5wt％。

根据一个优选方面，所述的金钱草总黄酮中表儿茶素的含量为9.0wt％～9.2wt％。

根据又一优选方面，所述的金钱草总黄酮中橙皮苷的含量为8.5wt％～9.0wt％。

在一个具体且优选的实施方式中：所述的金钱草总黄酮中含有山柰酚8.3wt％～8.5wt％、槲皮素7.3wt％～7.7wt％、芦丁7.2wt％～7.5wt％、表儿茶素9.0wt％～9.2wt％、橙皮苷8.5wt％～9.0wt％。

优选地，所述的金钱草总黄酮通过如下步骤制得：

(1)、将金钱草干燥全草粉碎，用乙醇水溶液室温浸泡后，回流提取0.5-1.5小时提取液浓缩至干，得金钱草粗提物，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为20％～90％；

(2)、将步骤(1)所得金钱草粗提物上吸附树脂，金钱草粗提物吸附树脂的质量比为1:10～30，依次用水和乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集乙醇水溶液洗脱液，浓缩至干，干燥即得所述金钱草总黄酮。

进一步优选地，步骤(1)中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50％～70％。

进一步优选地，步骤(2)中，所用吸附树脂为聚乙烯型大孔吸附树脂。进一步地，所述吸附树脂包括但不限于D101，AB-8或Diaion HP-20树脂。

优选地，步骤(2)中，树脂洗脱所用乙醇水溶液中乙醇的体积分数为10％～90％。

根据一个具体方面：步骤(2)中，依次用水、30％v/v乙醇水溶液，60％v/v乙醇水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4-5个柱体积，流速为2-3个柱体积/小时，洗脱结束后，收集60％v/v乙醇水溶液洗脱液，浓缩至干，干燥即得所述金钱草总黄酮。

根据本发明的一个具体实施方案：所述的金钱草总黄酮通过如下步骤制得：

(1)、将金钱草干燥全草粉碎，用70％v/v乙醇水溶液室温浸泡一天后，回流提取50～70分钟，滤出提取液，向滤渣中再加入70％v/v乙醇水溶液，回流提取40～60分钟，过滤，合并两次提取液，真空浓缩至干，得金钱草粗提物；

(2)、将步骤(1)所得金钱草粗提物溶解在水中，上Diaion HP-20大孔吸附树脂，金钱草粗提物与Diaion HP-20大孔吸附树脂的质量比为1:18～22，依次用水、30％v/v乙醇水溶液，60％v/v乙醇水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4-5个柱体积，流速为2-3个柱体积/小时，洗脱结束后，收集60％v/v乙醇水溶液洗脱液，浓缩至干，干燥即得金钱草总黄酮。

优选地，步骤(1)中，所述70％v/v乙醇与所述金钱草干燥全草的投料质量比为15～25:1，具体可以为例如20:1。

由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优势：

本发明金钱草总黄酮不仅总黄酮含量高，成分明确，而且在低剂量条件下具有明显降低高尿酸血症模型小鼠血清尿酸的作用，安全性高，是非常好的降低高尿酸，治疗痛风药物。此外，本发明的金钱草总黄酮制备工艺简单。

附图说明

图1为实施例3中HPLC检测图谱。

具体实施方式

实施例1 金钱草总黄酮的制备

(1)、取5公斤金钱草干燥全草，粉碎，用50升70％v/v乙醇水溶液室温浸泡一天后，回流提取60分钟，滤出提取液之后，向滤渣中再加入50升70％v/v乙醇水溶液，回流提取40分钟，过滤。合并两次提取液，真空浓缩至干，得到400g金钱草粗提物，得率为8％。

(2)、取步骤(1)制备的金钱草粗提物50g，加水溶解，上Diaion HP-20大孔吸附树脂进行层析，提取物的质量跟树脂质量之比为1：20。依次用水，30％v/v乙醇水溶液，60％v/v乙醇水溶液和95％v/v乙醇水溶液进行洗脱，每个梯度洗脱4-5个柱体积，流速为2-3个柱体积/小时。洗脱结束后，30％v/v乙醇部位，60％乙醇部位和95％乙醇部位分别浓缩至干，其中，30％乙醇部位共9g，60％乙醇部位共22g，95％乙醇部位共3.4g。

实施例2 金钱草粗提物和乙醇洗脱部位总黄酮的测定

对照品储备液制备：精密称取芦丁对照品20mg，置100ml容量瓶中，加入60％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得芦丁储备液(0.2mg/mL)。

标准曲线制备：用移液管分别吸取芦丁储备液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于6个25mL容量瓶中,分别加入蒸馏水7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0mL，摇匀，加入5％亚硝酸钠1.0mL，摇匀，放置6min，加入10％硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6min；再加4％氢氧化钠溶液10mL，加蒸馏水至定容，摇匀，显色15min后，于510nm波长测其吸收度A。用最小二乘法线性回归，的溶液吸光度A与芦丁质量浓度C(mg/ml)的回归方程为：

A＝5.1758C+0.0032r＝0.9996

按照以上方法测定待测溶液中总黄酮吸光度A，由回归方程即可求得质量浓度。

取实施例1所得金钱草粗提物和各个乙醇部位，配成0.2mg/ml溶液。取样品溶液1mL，按照上述的制作方法，测定其吸光度，每个样品做三个平行试验，取平均值，计算样品中的黄酮含量，结果参见表1。

表1金钱草粗提物和各个部位总黄酮含量

样品	金钱草粗提物	30％	60％	95％
					代号	LCWE	LC30	LC60	LC95
总黄酮	25.3％	35.5％	67％	10.1％

从表1可见，金钱草粗提物经过富集工艺之后，总黄酮含量有非常大的提高，其中60％乙醇洗脱部位总黄酮含量最高。

实施例3 60％乙醇洗脱部位金钱草总黄酮成分分析

供试品溶液配制：精密称量样品26.1mg置于25ml容量瓶中，用80％甲醇溶解后定容至刻度，待分析。

HPLC检测条件：

液相：Agilent1260DAD

色谱柱：AX-09

柱温：30℃

进样量：5μl

流速：1ml/min

检测波长：190-400nm全扫描(提取274nm图谱)

流动相：B(乙腈)-D(2％乙酸-水)，梯度洗脱，见表2。

表2 梯度洗脱时间表

时间(min)	B[％]	D[％]
			0	15	85
3.30	15	85
			5.00	20	80
11.67	90	10
			13.33	90	10
15.00	15	85
			20.00	15	85

结果：HPLC检测图谱(DL-274nm)参见图1。根据液相检测结果计算金钱草总黄酮成分的含量，参见表3。

表3

实施例4 金钱草粗提物和乙醇洗脱部位总黄酮体外对黄嘌呤氧化酶的影响

黄嘌呤氧化酶是尿酸生成的重要物质，为评价受试化合物对黄嘌呤氧化酶的影响，本实验选取金钱草粗提物和部位研究体外对黄嘌呤氧化酶的影响，具体方法如下：

在2mL离心管中依次加入黄嘌呤底物溶液200μL(终浓度为400μM)，供试品溶液100μL(阴性对照XOD组加PB，阳性对照组加别嘌醇)，黄嘌呤氧化酶溶液200μL(终浓度为0.08U/mL)，涡旋震荡5s后置于25℃水浴锅中反应5min，反应完毕后加入1.5mL无水乙醇涡旋震荡5s终止反应。反应终止后样品经3500rpm离心5min，吸取200μl到1.5ml离心管中，按反应顺序依次用生化分析仪(BECKMAN COULTER AU480)检测UA值。每个供试品做三个重复实验，取平均值，参见表4.

表4金钱草粗提物和各个乙醇洗脱部位抑制黄嘌呤氧化酶的活性

组别	浓度	UA(μmol/L)	抑制率％
				空白对照	‐	134.2±18.7	‐
别嘌醇	10μg/mL	71.7±8.3	46.6

LCWE	0.5mg/ml	75.2±8.3	44.1
				LC30	0.5mg/ml	69.4±4.9	48.2
LC60	0.5mg/ml	24.7±2.5	81.6
				LC95	0.5mg/ml	116.3±6.4	13.5

从表4可以看出，金钱草粗提物和各个乙醇洗脱部位对黄嘌呤氧化酶都有不同程度的抑制作用。其中总黄酮含量最高的LC60部位抑制作用最强。

实施例5 金钱草粗提物和各乙醇洗脱部位对高尿酸血症小鼠的影响

本发明通过动物实验验证金钱草粗提物和部位对高尿酸血症小鼠的影响。

取体重为15-18g的上海灵畅雄性KM小鼠80只，按每笼5只进行分笼处理后于公司屏障系统内适应性饲养4天。适应期第4天进行随机分组，从80只小鼠中选取体重集中的70只小鼠按体重随机平均分为7组，每组10只动物，分别为空白对照组，高尿酸血症模型组，阳性对照组，受试化合物组(共7组，分别为LCWE，LC30，LC60，LC95)。

适应期过后随即开始灌胃给药，每天上午灌胃1次。受试化合物用纯水进行混悬，按照20mg/kg进行灌胃。阳性对照非布司它用纯水进行混悬，按照2.5mg/kg进行灌胃。Control和Model组用纯水灌胃进行对照，连续灌胃6天。

在第7天上午灌胃0.5h后进行腹腔注射造模。Control组腹腔注射0.5％CMC-Na，Model组，阳性对照组和药物组注射氧嗪酸钾(OA，用CMC-Na进行溶解)，注射量均为300mg/kg体重。腹腔注射1.5h后摘眼球采血，采血容量不低于0.5mL。血样采集后于室温放置约1h，待血液完全凝固后于3500rpm/4℃条件下离心10min，取血清在同等条件下复离5min，取0.2mL血清用生化分析仪(BECKMAN COULTER AU480)检测UA值。

用Excel和SPSS对数据进行统计分析，计算平均数和SD，经单因素方差分析后比较各实验组的组间差异等。

实验结果：参见表5。结果表明，实验动物在腹腔注射氧嗪酸钾后，与正常对照组相比，血清尿酸水平显著提高，有显著性差异，表明造模成功。

表5金钱草粗提物和各个乙醇洗脱部位对高尿酸血症模型小鼠血清尿酸含量的影响

组别	剂量(mg/kg)	尿酸(μmol/L)
			正常组	0.5％CMC-Na	66.5
模型组	0.5％CMC-Na	201.4
			阳性对照组	2.5	114.7
LCWE	20	172.4^*
			LC30	20	164.1^*

LC60	20	126.9^**
			LC95	20	179.9

注：^*：与model组比，P<0.05；^**：表示与model组比，P<0.01(t-test检验)

从表5可以看出，给予受试化合物后，与模型组相比金钱草粗提物具有一定的降低尿酸效果，经过总黄酮富集工艺之后LC60部位降低尿酸的效果跟其它部位相比，效果最明显。同时这个部位也是总黄酮含量最高的部位，说明金钱草粗提物降低尿酸的功效是跟其总黄酮含量有正相关关系的。这一结果跟体外黄嘌呤氧化酶抑制实验比较吻合，说明总黄酮是其活性部位。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.金钱草总黄酮在制备降低高尿酸血症药物中的应用，其特征在于：所述的金钱草总黄酮中含有总黄酮在60％以上含有山柰酚8.0wt％～9.0wt％、槲皮素7.0wt％～8.0wt％、芦丁7.0wt％～8.0wt％、表儿茶素8.5wt％～9.5wt％、橙皮苷8.0wt％～9.5wt％。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的金钱草总黄酮中含有总黄酮在60％以上。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的金钱草总黄酮中含有山奈酚，槲皮素，芦丁，表儿茶素，橙皮苷等特征成分。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的金钱草总黄酮中含有山柰酚7.0wt％～10.0wt％、槲皮素6.0wt％～9.0wt％、芦丁5.0wt％～9.0wt％、表儿茶素7wt％～10wt％、橙皮苷7.0wt％～10wt％。

5.根据权利要求1至4中任一项权利要求所述的应用，其特征在于：所述的金钱草总黄酮通过如下步骤制得：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50％～70％。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，所用吸附树脂为聚乙烯型大孔吸附树脂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述吸附树脂为D101，AB-8或Diaion HP-20树脂。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，树脂洗脱所用乙醇水溶液中乙醇的体积分数为10％～90％。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(2)中，依次用水、30％v/v乙醇水溶液，60％v/v乙醇水溶液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱4-5个柱体积，流速为2-3个柱体积/小时，洗脱结束后，收集60％v/v乙醇水溶液洗脱液，浓缩至干，干燥即得所述金钱草总黄酮。