CN104212789A - 一种SiO2基大孔材料固定化漆酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种SiO₂基大孔材料固定化漆酶及其制备方法，属于固定化酶制备技术领域。该固定化漆酶是以表面改性的块体SiO₂大孔材料为载体，将漆酶通过静电和配位作用固定在该载体上。其制备方法包括两个步骤：载体的制备和漆酶的固定。载体制备：先将块体SiO₂大孔材料在水热条件下用铝酸钠改性，再经离子交换得到表面固定多价金属离子的载体成品。漆酶的固定：将载体浸入漆酶溶液，在室温下振荡吸附，经洗涤、干燥，得固定化漆酶成品。本发明提供了一种新型固定化漆酶，具有制备工艺简单，成本低廉，漆酶活力回收率高，性质稳定等特点。

Description

一种SiO2基大孔材料固定化漆酶及其制备方法

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种SiO₂基大孔材料固定化漆酶及其制备方法。

背景技术

漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶，广泛存在于多种生物体内。漆酶具有宽泛的底物专一性和较好的稳定性，能催化氧化多种难降解有机污染物，包括酚类化合物、多环芳烃、多氯联苯及其衍生物、除草剂、杀虫剂等，它在废水处理、生物传感器构建、生物制浆、食品加工以及有机合成等方面有重要应用价值。因此，国内外科学家在生物、化学、物理、医学等多领域对漆酶开展了广泛的研究工作。

游离的漆酶因在使用过程中易随环境的变化变性失活、易混入产品和不易循环利用等使其应用受到限制。对漆酶进行固定化是实现其重复利用、改善其稳定性的有效方法。固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机载体上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

自20世纪60年代，固定化酶技术的研究得到了蓬勃发展，迄今为止，已研究开发了多种酶的固定化方法，包括物理吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等。近年来国际上对漆酶的固定化进行了较为广泛的研究，使用的载体包括壳聚糖、亲水性微滤膜、SiO₂纳米颗粒、介孔SiO₂和介孔碳等多种材料。但是现有的固定化漆酶普遍存在着生产成本高、加工工艺复杂、分离效果差等缺点，很难工业化应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以大尺寸块体SiO₂基大孔材料为载体的固定化漆酶的制备方法。

本发明所提供的固定化漆酶的制备方法是，以我们前期制备的薄板状(长10cm、宽3cm、厚0.3cm)SiO₂大孔材料(参见专利200910095419.9)为原料，将其切割成长、宽、高为0.2～0.4cm的块体；利用该大孔材料机械强度高、水热稳定性好的特点，先在水热条件下用铝酸钠对其进行表面改性，再经离子交换得到表面固定多价金属离子的改性大孔材料；以表面固定多价金属离子的大孔材料为载体，将漆酶通过静电和配位作用固定在该载体上。具体制备方法如下：

(1)载体的制备：称取所需的干燥的块体SiO₂大孔材料置于含浓度为0.1～0.5mol·L^-1铝酸钠溶液的水热反应釜聚四氟乙烯内衬中，在120～180℃下反应2～24小时，滤出大孔材料，用去离子水反复冲洗、干燥，浸入金属盐水溶液中振荡4～6小时，滤出、用去离子水反复冲洗、干燥，即得固定化酶所用的载体；

(2)漆酶的固定：将步骤(1)中得到的载体浸入用缓冲溶液配置的漆酶溶液中，在5～30℃下振荡5～12小时，滤出、用缓冲液洗涤至溶液中检测不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。

步骤(1)中所述的金属盐选自在水中易解离出多价金属离子的水溶性金属盐，如醋酸铜、醋酸锌、三氯化铁、二氯化锰、硫酸镁等。

步骤(2)中所述的漆酶溶液的浓度为0.05～2.0mg·ml^-1、pH值为4～8；缓冲溶液可以是醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐中的一种或两种。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：(1)本发明提供的固定化漆酶，制备工艺简单，成本低廉；(2)本发明提供的固定化方法，漆酶活力回收率高，可以达到95％以上；(3)本发明通过静电和配位作用吸附固定漆酶，固定化漆酶性质稳定；(4)本发明使用大尺寸的块体材料固定化漆酶，便于从反应体系中分离出来、重复使用、应用于实际生产中。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步说明，本发明的范围不受实施例的限制。

实施例1：

(1)称取1g块状SiO₂大孔材料于80℃下干燥2h，置于含50ml、0.3mol·L^-1铝酸钠溶液的水热反应釜聚四氟乙烯内衬中，在120℃下反应12小时，自然冷却后，用8～10目的筛网滤出，用去离子水反复冲洗，干燥后得到改性SiO₂大孔材料Al-SiO₂。

(2)将Al-SiO₂浸入饱和醋酸铜溶液中振荡4小时，滤出、用去离子水反复冲洗、干燥，即得固定化酶用的载体Cu²⁺-Al-SiO₂。

(3)称取1g Cu²⁺-Al-SiO₂，浸入50ml用pH＝4.5缓冲溶液配置的蛋白浓度为0.1mg·ml^-1的粗漆酶溶液中，在25℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡5小时、用8～10目的筛网滤出，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，即得固定化漆酶。该固定化漆酶的酶活回收率为100.4％，酶活为59.2U·g^-1(定义一分钟使1μmol的ABTS氧化所需的酶量为一个酶活单位U)，固定化漆酶具有良好的操作稳定性，与底物ABTS反应反复操作10批次后剩余酶活为初始酶活的72.7％。

实施例2：

(1)同实施例1(1)。

(2)将Al-SiO₂浸入0.5mol·L^-1醋酸锌溶液中振荡5小时，滤出、用去离子水反复冲洗、干燥，得固定化酶用的载体Zn²⁺-Al-SiO₂。

(3)称取0.1g Zn²⁺-Al-SiO₂，浸入5ml用pH＝4.0缓冲溶液配置的蛋白浓度为0.05mg·ml^-1的粗漆酶溶液中，在25℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡5小时、滤出，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活回收率为95.4％，酶活为20.0U·g^-1，与底物ABTS反应反复操作10批次后剩余酶活为初始酶活的71.2％。

实施例3：

(1)同实施例1(1)。

(2)将Al-SiO₂浸入0.5mol·L^-1三氯化铁溶液中振荡4小时，滤出、用去离子水反复冲洗、干燥，得固定化酶用的载体Fe³⁺-Al-SiO₂。

(3)称取1g Fe³⁺-Al-SiO₂，浸入50ml用pH＝4.0缓冲溶液配置的蛋白浓度为0.05mg·ml^-1的粗漆酶溶液中，在25℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡5小时、滤出，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活回收率为96.8％，酶活为27.5U·g^-1，与底物ABTS反应反复操作10批次后剩余酶活为初始酶活的77.4％。

实施例4：

(1)同实施例1(1)。

(2)同实施例2(2)。

(3)称取1g Zn²⁺-Al-SiO₂，浸入50ml用pH＝4.0缓冲溶液配置的蛋白浓度为2.0mg·ml^-1的粗漆酶溶液中，在25℃、转速为50r·min^-1的摇床中振荡6小时、滤出，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活为76.2U·g^-1。

Claims (3)

1.一种SiO₂基大孔材料固定化漆酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)载体的制备：称取所需的干燥的块体SiO₂大孔材料置于含浓度为0.1～0.5mol·L^-1铝酸钠溶液的水热反应釜聚四氟乙烯内衬中，在120～180℃下反应2～24小时，滤出大孔材料，用去离子水反复冲洗、干燥，浸入金属盐水溶液中振荡4～6小时，滤出、用去离子水反复冲洗、干燥，即得固定化酶所用的载体；

(2)漆酶的固定：将步骤(1)中得到的载体浸入用缓冲溶液配置的漆酶溶液中，在5～30℃下振荡5～12小时，滤出、用缓冲液洗涤至溶液中检测不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的金属盐选自在水中易解离出多价金属离子的水溶性金属盐。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的漆酶溶液浓度为0.05～2.0mg·ml^-1、pH值为4～8。