CN104195234A - 检测cx3cr1基因v249i突变位点的方法和引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测CX3CR1基因V249I位点突变的方法和引物，包括扩增CX3CR1基因V249I突变位点片段的正、反向引物和正向测序引物。将PCR扩增和Sanger测序相结合，可快速检测糖尿病以及糖代谢异常引起的心脑血管病患者体内CX3CR1基因V249I位点的突变情况。

Description

检测CX3CR1基因V249I突变位点的方法和引物

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测CX3CR1基因V249I突变位点的方法和引物。

背景技术

近年来，随着生活方式的逐渐改变，糖尿病发病率正在逐年增高，成为脑血管病的常见危险因素之一。临床资料研究表明，与非糖尿病患者相比，糖尿病性脑梗死患者的病残率、复发率、死亡率较高，并且病情恢复较慢。糖耐量减低(impaired glucose tolerance,IGT)和空腹血糖调节减低(impaired fasting plasma glucose,IFG)，两者是正常葡萄糖稳态和糖尿病高血糖之间的中间代谢状态，且均为2型糖尿病高风险的预示因素。有研究显示IGT患者中已有脑血管意外的风险，在IGT阶段各种复杂的关系已经充分暴露，糖代谢发生异常，胰岛素抵抗，高胰岛素血症，内皮细胞功能紊乱，氧化应激，血脂异常，血压升高等交织在一起，从而出现靶器官的损害。因此脑梗死患者的糖代谢异常是预测其预后的重要因素。

Fractalkine(FKN)是炎症内皮细胞释放的一种趋化因子，与受体CX3CR1结合以后可以增强自然杀伤细胞(NK细胞)的杀伤力，从而损伤血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的形成。因此，观察高血糖尤其是糖调节异常阶段与急性脑梗死患者FKN表达相关性的研究，对急性脑梗死合并糖耐量异常患者的防治工作将会有重要的临床意义。国外已有文献报道空腹血糖(FPG)和糖负荷后2h血糖(2hPG)是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的独立危险因素。另外有研究表明，颈动脉粥样硬化是导致脑梗死的重要原因之一。随着对动脉粥样硬化性疾病其相关发病机制的不断深入研究，近年来发现一种由炎症内皮细胞释放的新趋化因子Fractalkine(FKN)，与表达在淋巴细胞、单核细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)上的CX3CR1受体结合以后，可以增强NK细胞的杀伤力，损伤血管内皮细胞，从而促进动脉粥样硬化性疾病的形成和发展。趋化因子家族是一系列分子量约为8-12KD，结构相似并具有趋化功能，能够控制细胞定向迁移的细胞因子。趋化因子肽链N端的半胱氨酸残基是高度保守的，根据其相对位置和数量的差异，可以将趋化因子分为四个亚族。Fractalkine(FKN)是目前发现的唯一的CX3C类趋化因子。FKN基因定位于人类第16号染色体中的q13片段。不同于与其他趋化因子的是，FKN有两种存在形式，即膜结合型FKN和可溶型FKN，其中膜结合型FKN是黏附分子，可溶型FKN是化学诱导物。成熟的膜结合型可分为三段：胞外段，其CX3C趋化因子结构域位于头部氨基端，含有氨基酸残基76个，下面连接一段粘蛋白样的茎状结构，共有氨基酸残基241个，其中含有丰富的苏氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)及谷氨酸(Gly)；跨膜段，共含有疏氨基酸残基18个；胞内段，有氨基酸残基37个。膜结合型FKN位于其近膜侧的第314-317位氨基酸残基，即Thr-Arg-Arg-Gln，是一双碱基的水解位点，可以由蛋白酶水解，则膜结合型FKN转变成可溶型FKN。可溶型和膜结合型FKN之间的平衡是金属蛋白酶依赖性蛋白酶通过调节实现的。FKN在人体内分布广泛。研究表明，在非造血组织、神经细胞及血管内皮细胞表面，均发现有FKN表达。另外，Foussat等也发现在上皮细胞FKN表达较高。大多数FKN在活化的内皮细胞表面表达，既具有黏附功能又具有趋化作用，并且参与了白细胞向炎症组织游走的过程。FKN通过其黏蛋白样茎状结构，可以迅速结合位于细胞表面的高亲和受体CX3CR1，从而发挥生物学作用，并且不需要黏附分子参与该过程。另外有实验发现，FKN还可以增加炎性因子渗出，从而促进炎症级联反应的发生。

CX3CR1是FKN因子的专一受体，属于G-蛋白偶联受体。CX3CR1基因定位于人类3号染色体中的短臂二区一带，一簇CC趋化因子受体基因与CX3CR1受体相邻。CX3CR1受体是由355个氨基酸残基组成的单链受体，共含有7个疏水性穿膜区段，并对百日咳毒素敏感。CX3CR1受体的第249和280位氨基酸残基具有多态性，考虑与形成动脉粥样硬化的过程有关。CX3CR1受体结构可分为三部分，分别是：胞外区(即趋化因子结构区)，跨膜区(即疏水性氨基酸富含区)和胞内区(即信号转导区)。CX3CR1受体的N端位于细胞外，含有N-糖基化位点结构，CX3CR1受体的C端位于细胞内，其磷酸化位点有蛋白激酶作用。在胞外区，3个环状结构和1个N端共同组成FKN的配体，可以结合FKN因子；在胞内区，3个环状结构和1个C端结合起来，用于传导FKN因子的功能信号。实验表明，与CX3CR1相关的钙离子流活化和细胞游走现象可被百日咳毒素所抑制，证明CX3CR1与G蛋白家族的Gi亚家族相偶联。当CX3CR1受体和FKN因子结合以后，可以通过与G-蛋白耦联，使细胞内信号转导机制启动，进一步促使肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表达水平升高，随之产生生物学效应。

动物实验结果显示，单核细胞将CX3CR1敲除后，FKN因子与该细胞的结合力和趋化活性均降低。与仅敲除apoE的小鼠相比，敲除CX3CR1和apoE的小鼠，在动脉壁上的巨噬细胞浸润发现有明显降低。因此可以证明，在富含巨噬细胞的动脉粥样硬化病变过程中，FKN因子起着直接和主要的作用。另外有研究表明，以FKN浓度依赖的方式，氧化型亚油酸和氧化型低密度脂蛋白可以诱导冠状动脉血管平滑肌细胞和单核细胞异常黏附，从而在动脉粥样硬化性疾病的进展中发挥作用。有研究表明，动脉粥样硬化性疾病进展过程的不同阶段，损伤的巨噬细胞源性泡沫细胞、内皮细胞和其他细胞，以及动脉粥样硬化形成的斑块中，过度表达FKN及其受体CX3CR1。其表达水平与病情的严重程度呈正相关，并且FKN可以通过诱导单个核细胞使NF-κB和TNF-α的表达水平增高，从而促进动脉粥样硬化的形成和进展。FKN因子及其受体CX3CR1对动脉粥样硬化的影响及其机制：膜结合型FKN因子刺激自然杀伤细胞，或FKN表达细胞与自然杀伤细胞共培养可诱导干扰素γ(IFN-γ)表达。而且FKN能与新分离的自然杀伤细胞结合，以剂量依赖的方式增强其杀伤力，从而导致内皮细胞出现损伤。另外由于淋巴细胞、单核细胞及血管平滑肌细胞等表达FKN的受体CX3CR1，因此FKN因子可以介导这些细胞向已经损伤的血管内皮细胞趋化并黏附，并且还能够跨越血管壁，迁移向血管外的特定部位。因此，FKN被认为是动脉粥样硬化形成的危险因素之一。研究证明，CX3CR1受体的基因多态性与动脉粥样硬化性心脑血管疾病相关。另外，在动脉粥样硬化性斑块内也发现FKN因子的高水平表达。

目前针对CX3CR1基因突变位点的检测普遍采用的是聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法，用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。该方法简便，结果容易判定，但是也同时存在诸多弊端，①靶片段的扩增产物要纯，如有非特异产物(特别是大片段可能含有酶识别序列)将竞争酶活性，使样品消化不完全或及出现酶消化杂带；②酶消化过程要充分(即底物与酶的比例要合适，消化时间要保证)，避免假阴性结果；③酶切阳性结果可以确定所检测具体序列，阴性结果仅可说明非酶识别序列，但不能准确判定具体序列。④酶识别序列如有甲基化之核苷酸将不被切割。而本发明采用测序的方法，可以有效地克服RFLP方法各种缺陷，从而快速，准确，高通量地检测样本。

发明内容

本发明的目的在于提供检测CX3CR1基因V249I突变位点的引物，其特征在于，包括：扩增CX3CR1基因V249I突变位点的正、反向引物；其碱基序列为：

V249I-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA

V249I-R：GTAAAGGTATCTTCTGAACT

进一步地，所述引物还包括正向测序引物，其碱基序列为

V249I-S-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA。

进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：V249I-F:V249I-R＝1:1。

进一步地，所述正向测序引物的使用浓度为：3.2uM

进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环35次；第三阶段，72℃10min；第四阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。

本发明的目的还在于提供一种检测CX3CR1基因V249I突变位点的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)利用一对扩增引物V249I-F和V249I-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；

(3)利用正向测序引物V249I-S-F对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与CX3CR1基因野生型参考序列CX3CR1-ref进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，

V249I-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA

V249I-R：GTAAAGGTATCTTCTGAACT

V249I-S-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA。

进一步地，步骤(2)的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环35次；第三阶段，72℃10min；第四阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。

本发明的目的还在于提供一种检测CX3CR1基因V249I突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括一对扩增产物V249I-F和V249I-R，测序体系反应液包括正向测序引物V249I-S-F，其特征在于：

V249I-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA

V249I-R：GTAAAGGTATCTTCTGAACT

V249I-S-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA。

进一步地，所述试剂盒还包括CX3CR1基因野生型参考序列CX3CR1-ref。

进一步地，所述测序纯化液还包括由碱性磷酸酶和核酸外切酶I组成的测序纯化液。

本发明的有益效果：本发明设计了扩增CX3CR1基因V249I突变位点的正，反向引物，构建了稳定的PCR扩增体系，对V249I突变位点的片段进行扩增，包含待检测的所有突变位点，同时在扩增时，富集正向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并采用Sanger测序法，对PCR扩增产物进行测序反应扩增、纯化后变性、直接测序检测CX3CR1基因V249I突变位点的多态性情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。

附图说明

图1：样本1的检测结果图。

图2：样本2的检测结果图。

图3：样本3的检测结果图。

图4：样本4的检测结果图。

图5：样本5的检测结果图。

图6：样本6的检测结果图。

图7为正常PCR-RFLP检测的胶图：AclI酶切，如果是纯合突变(ATT)，则只有295bp条带；如果是杂合突变(GTT/ATT)，则有295bp,191bp,104bp三条带；如果是野生型(GTT)，则有104bp,191bp两条带。

图8为异常的PCR-RFLP检测图：野生型两条带没有问题，而杂合型只有两条带，所以不能准确判定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测CX3CR1基因V249I突变位点的引物，包括：扩增CX3CR1基因V249I突变位点的正向引物；其碱基序列为：

V249I-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA

V249I-R：GTAAAGGTATCTTCTGAACT。

优选地，所述引物还包括正向测序引物，其碱基序列为

V249I-S-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA。

在检测中，先利用上述正、反向引物对CX3CR1基因V249I突变位点进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述正向测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。

检测CX3CR1基因V249I突变位点的试剂盒，包括：样本DNA抽提试剂(例如使用天根生物的试剂盒来抽提样本DNA)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中

检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；扩增CX3CR1基因V249I突变位点的正、反向引物V249I-F(10μm)、V249I-R(10μm)。

测序体系反应液包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：V249I-S-F(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。

检测体系PCR反应液试剂配制如下：

其中，V249I-F和V249I-R的碱基序列为：

引物名称	碱基序列
		V249I-F	GAGTTATTGCTACTTCAGAA
V249I-R	GTAAAGGTATCTTCTGAACT

阳性对照品：含有CX3CR1序列的溶液。

阴性对照品：无CX3CR1序列的溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。

优选地，该试剂盒还包括CX3CR1基因野生型参考序列CX3CR1-ref，其碱基序列如下所示：AAAGCAGAAAGAAAATGAATGCCTTGGTGACTACCCCGAGGTCCTCCAGGAAATCTGGCCCGTGCTCCGCAATGTGGAAACAAATTTTCTTGGCTTCCTACTCCCCCTGCTCATTATGAGTTATTGCTACTTCAGAATCATCCAGACGCTGTTTTCCTGCAAGAACCACAAGAAAGCCAAAGCCATTAAACTGATCCTTCTGGTGGTCATCGTGTTTTTCCTCTTCTGGACACCCTACAACGTTATGATTTTCCTGGAGACGCTTAAGCTCTATGACTTCTTTCCCAGTTGTGACATGAGGAAGGATCTGAGGCTGGCCCTCAGTGTGACTGAGACGGTTGCATTTAGCCATTGTTGCCTGAATCCTCTCATCTATGCATTTGCTGGGGAGAAGTTCAGAAGATACCTTTACCACCTGTATGGGAAATGCCTGGCTGTCCTGTGTGGGCGCTCAGTCCACGTTGATTTCTCCTCATCTGAATCACAAAGGAGCAGGCATGGAAGTGTTCTGAGCAGCAATTTTACTTACCACACGAGTGATGGAGATGCATTGCTCCTTCTCTG。

实施例2

检测流程：

(1)利用血液DNA抽提试剂盒(天根生物)提取血液样本中的基因组DNA:

1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。

2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。

3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组DNA溶液。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：

X＝18μl反应液×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测样本数。

(3)加样：将2ul步骤(1)中获得的血液基因组DNA溶液加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加2ul阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2ul阴性对照品；对空白对照实验而言，加2ul生理盐水或不加任何物质。

(4)PCR扩增：检测在常规PCR仪上进行，获得PCR扩增产物，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：

(5)Sanger测序：

取9μl PCR扩增产物与2μl测序纯化液。按照以下程序进行纯化，从而获得纯化产物：

将1μl纯化产物分别与测序引物V249I-S-F(3.2μm)按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序，获得PCR扩增产物的基因序列。

(6)结果判断：将(5)中获得的基因序列与CX3CR1基因野生型参考序列CX3CR1-ref进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

采用本发明核酸检测试剂盒检测临床样本。

取送检糖尿病患者抗凝血样本10例，按实施例2所述检测流程提取样本中的基因组DNA，配制试剂并检测

将2ul按照实施例2中所述检测流程提取出的每份样本基因组DNA溶液加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性和空白对照，一台96孔的普通PCR仪可同时检测46份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。

每份样本基因组DNA的扩增产物经Sanger测序与CX3CR1基因野生型参考序列CX3CR1-ref进行比对。同时我们对同一份样本进行传统的PCR-RFLP方法检测(限制性内切酶AclI(Bio labs公司))，以便与Sanger测序法进行比较。最后，根据测序结果对预后进行判断。

检测结果如下表：

从上表可以看出，在10例样本中，本发明检测出的所有样本中的CX3CR1基因V249I突变与否都可以通过序列直观准确的得到结果(见图1-6)，并根据结果给出治疗指导；但用传统的PCR-RFLP方法就不能准确给出结果，由于酶切后用胶图显示灵敏度很低，经常比测序法高10倍的DNA含量才能清晰显示条带，而本实验在同样浓度DNA的情况下，PCR-RFLP方法的104bp条带就不能显示(如图7-8)，从而不能作出准确结果判断。另外测序法不光灵敏度高，而且可以同时检测96个样本，高通量，节约成本；PCR-RFLP方法必须一个一个上样，而且不能同时进行大批量检测，另外使用限制性内切酶成本高，方法繁琐。

实施例4

取临床样本6份，按实施例2所述检测流程，提取样本基因组DNA、配制试剂并检测。

将2ul按照实施例2中所述检测流程提取出的每份样本基因组DNA溶液加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性和空白对照，一台96孔的普通PCR仪可同时检测46份样本，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。

样本1的正向测序结果如图1所示，为GTT/ATT杂合型，糖尿病人易引起心脑血管病，在控制血糖的治疗中，需要随时监测心脑情况。

样本2的正向测序结果如图2所示，为GTT/ATT杂合型，糖尿病人易引起心脑血管病，在控制血糖的治疗中，需要随时监测心脑情况。

样本3的正向测序结果如图3所示，为野生型，建议继续控制血糖水平。

样本4的正向测序结果如图4所示，为GTT/ATT杂合型，糖尿病人易引起心脑血管病，在控制血糖的治疗中，需要随时监测心脑情况。

样本5的正向测序结果如图5所示，为GTT/ATT杂合型，糖尿病人易引起心脑血管病，在控制血糖的治疗中，需要随时监测心脑情况。

样本6的正向测序结果如图6所示，为GTT/ATT杂合型，糖尿病人易引起心脑血管病，在控制血糖的治疗中，需要随时监测心脑情况。

实施例5

取实施例4的样本3(野生型)和样本4(杂合型)的DNA，按实施例2进行PCR扩增，扩增产物按以下流程进行RFLP实验。

限制性片段长度多态性分析(RFLP)：利用限制性内切酶AclI(Bio labs公司)对V249I基因的目的片段酶切,在20ul体系下进行:PCR扩增产物8ul,10X缓冲液2ul,100XBSA缓冲液0.2ul,3000U/ml限制性内切酶AclI0.5ul,加双蒸水至20ul,37度过夜,酶切产物在2.5％琼脂糖凝胶100V电压下电泳45min,紫外灯下检测照相。

产物正常经AclI酶切后,出现1条条带(295bp)的为突变型纯合子,出现2条条带(104bp和191bp)的为野生型,出现3条条带(104bp、191bp和295bp)的为杂合子。结果显示(见图8)：样本3野生型与测序结果一致，判断为野生型；但样本4，电泳没有显示104bp条带，不能判断是杂合型，与测序结果不符。所以电泳法的灵敏度不高，容易出现判断错误。

                                                 SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州艾迪康医学检验中心有限公司

 

<120>  检测CX3CR1基因V249I突变位点的方法和引物

 

<130> 

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gagttattgc tacttcagaa                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gtaaaggtat cttctgaact                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

gagttattgc tacttcagaa                                                 20

 

 

<210>  4

<211>  564

<212>  DNA

<213>  CX3CR1基因野生型参考序列CX3CR1-ref

 

<400>  4

aaagcagaaa gaaaatgaat gccttggtga ctaccccgag gtcctccagg aaatctggcc     60

 

cgtgctccgc aatgtggaaa caaattttct tggcttccta ctccccctgc tcattatgag    120

 

ttattgctac ttcagaatca tccagacgct gttttcctgc aagaaccaca agaaagccaa    180

 

agccattaaa ctgatccttc tggtggtcat cgtgtttttc ctcttctgga caccctacaa    240

 

cgttatgatt ttcctggaga cgcttaagct ctatgacttc tttcccagtt gtgacatgag    300

 

gaaggatctg aggctggccc tcagtgtgac tgagacggtt gcatttagcc attgttgcct    360

 

gaatcctctc atctatgcat ttgctgggga gaagttcaga agataccttt accacctgta    420

 

tgggaaatgc ctggctgtcc tgtgtgggcg ctcagtccac gttgatttct cctcatctga    480

 

atcacaaagg agcaggcatg gaagtgttct gagcagcaat tttacttacc acacgagtga    540

 

tggagatgca ttgctccttc tctg                                           564

 

 

Claims (7)

1.检测CX3CR1基因V249I突变位点的引物，其特征在于，包括：扩增CX3CR1基因V249I突变位点的正、反向引物；其碱基序列为：

V249I-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA

V249I-R：GTAAAGGTATCTTCTGAACT。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括正向测序引物，其碱基序列为：

V249I-S-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA。

3.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用浓度比为：V249I-F : V249I-R=1:1。

4.如权利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正向测序引物V249I-S-F的使用浓度3.2uM。

5.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95 ℃ 预变性10min；第二阶段，变性温度94 ℃ 30sec，退火温度58 ℃ 90sec，延伸温度72 ℃ 30sec，循环35次，第三阶段，72 ℃ 10min；第四阶段，扩增反应结束，扩增产物在4 ℃下保存。

6.一种检测CX3CR1基因V249I突变位点的方法，其包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)利用一对扩增引物V249I-F和V249I-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；

(3)利用正向测序引物V249I-S-F对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的基因序列；

(4)将(3)中的基因序列与CX3CR1基因野生型参考序列CX3CR1-ref进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，

V249I-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA

V249I-R：GTAAAGGTATCTTCTGAACT

V249I-S-F：GAGTTATTGCTACTTCAGAA。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)的扩增反应条件为：第一阶段，95 ℃ 预变性10min；第二阶段，变性温度94 ℃ 30sec，退火温度64 ℃ 90sec，延伸温度72 ℃ 30sec，循环35次；第三阶段，72 ℃ 10min；第四阶段，扩增反应结束，扩增产物在4 ℃下保存。