CN104195030B - 一种微流控芯片及使用其的评价伤口敷料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微流控芯片，其包括一块PDMS基板和在所述PDMS基板内部的两个微流控孔道和四个细胞注入管道；所述PDMS基板为对称八边形基板；所述微流控孔道位于所述PDMS基板的底面，其包括：一条长孔道和两条短孔道，长孔道与所述基板底边平行，短孔道与侧边平行，分别垂直连接所述长孔道的两个末端；所述长孔道和短孔道的底面具有孔道槽，两个微流控孔道的长孔道互相平行；所述细胞注入管道为圆柱形，竖直设置于所述PDMS基板中，其下端连接所述短孔道，上端在PDMS基板上平面开口。本发明所述微流控芯片可在体外模拟伤口并快速评价水凝胶类伤口敷料对伤口的愈合作用。

Description

一种微流控芯片及使用其的评价伤口敷料的方法
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片，包含其的试剂盒，使用其的评价伤口敷料的方法及其用途，具体地，涉及一种用于评价水凝胶类伤口敷料的微流控芯片，包含其的试剂盒，使用其的评价伤口敷料的方法及其用途。
背景技术
人们在日常生活和工作中造成人体皮肤的各种损伤是不可避免的。据世界卫生组织统计，1990年全球各种创伤致死人数约510万人，预计2020年会增至840万人。传统的组织修复，特别是大面积组织缺损的修复主要是从自体或同种异体甚至异种组织移植进行修复。这种方法虽然挽救了病人生命，但受到很多方面的限制，例如自身用于修复的组织器官来源受到限制，同种异体或异种组织的移植受到伦理和安全性的限制。因此，人为或天然制造且与人体天然组织有一致或相似的人造组织成为医学和科研界研究的热点，20世纪60年代中期人工皮肤开始用于烧伤患者的治疗，人造组织越来越受到人们的青睐。但如何解决人体对移植物的排斥性、材料对人体组织毒性和生物相容性；如何迅速有效的覆盖创伤面，避免空气中氧气与细菌对创面的危害；如何解决伤口对抗生素产生的耐药性；如何减轻炎症反应；如何加快表皮细胞的再生；如何减少疤痕的形成，实现皮肤创伤的完美修复成为创伤治疗所面临的问题。
水凝胶类伤口敷料因为柔韧性好。可以完全覆盖创伤面，且其自身的结构和孔隙可以预防病原微生物入侵，阻挡空气与细菌对创面的感染；同时此类敷料可以减少创面体液渗出，并保持局部湿润的微环。此类敷料在形成过程中可以与抗菌，杀菌消炎药物，细胞生长因子，减少疤痕形成的药物(类固醇、姜黄素)等复合形成复合类敷料且有一般都具有缓释的作用。根据伤口情况的需要可以短期更换，在其未干燥的情况下较容易从伤口移除，若不需短期更换，随着伤口的愈合会脱落，两种情况下都不会对伤口造成二次伤害。由于水凝胶类敷料的种种优势，其在医学领域的应用越来越广泛。
本领域已公开关于水凝胶类伤口敷料的许多专利。CN103044693A公开了一种细菌纤维素/聚乙烯醇复合水凝胶的制备方法；CN103495199A公开一种治疗激光灼伤和烧烫伤的水凝胶敷料，其活性成分包括抗菌剂、保湿剂和稳定剂，抗菌剂抑制激光灼伤伤口及周围的细菌的黏附和生长，并能杀灭灼伤部位多种致病菌，有效促进灼伤伤口的愈合；CN102600493A发明公开了一种天然普鲁兰多糖水凝胶伤口敷料，由羧甲基化普鲁兰多糖和肼或二元胺交联反应而成。以上专利主要介绍不同类型的水凝胶类伤口敷料，及其制备方法和应用。然而随着水凝胶类伤口敷料的发展，极有必要建立对水凝胶类伤口敷料快速且有效的评价方法。
目前对于水凝胶类伤口敷料在组织修复方面的应用主要有两种评价方法：一种方法是将细胞种植在其上看细胞形态及其增殖和检测细胞的存活率，另一种方法是利用动物实验来观察伤口愈合的快慢。目前尚未有关于使用微流控装置来评价水凝胶类敷料的专利。文献A Rapid Screening Method for Wound Dressing by Cell-on-a-Chip Device(Adv.Healthcare Mater.2012,1,560-566.)利用微流控装置对电纺丝敷料(PCL和明胶)进行评价。然而此装置在使用时受限较多，该装置为面积较大的长方形，需放在60mm的皿中使用，而且评价的电纺丝易漂浮和移动，可能会影响细胞迁移。
由此可见，随着水凝胶类伤口敷料在皮肤损伤，烧伤、烫伤等方面应用越来越广泛，本领域急需一种可模拟伤口且快速评价水凝胶类伤口敷料对伤口的愈合作用的装置。
发明内容
本发明的目的之一在于提出一种微流控芯片，其可在体外模拟伤口并快速评价水凝胶类伤口敷料对伤口的愈合作用。
所述微流控芯片如图1所示，其内部的微流控孔道如图2所示。以下结合图1和图2对本发明的微流控芯片进行说明。
本发明所述的微流控芯片包括：一块PDMS基板和在所述PDMS基板内部的两个微流控孔道和四个细胞注入管道；
所述PDMS基板为对称八边形基板，其底边c、侧边e和斜边d的长度分别为1cm、0.5cm和0.5cm，总长度b为1.5-1.7cm，总宽度f为1.3-1.4cm，厚度a为3mm；
所述微流控孔道位于所述PDMS基板的底面，其包括：一条长孔道5和两条短孔道3；长孔道与所述基板底边平行，长度为7mm；短孔道与侧边平行，分别垂直连接所述长孔道的两个末端，长度为3mm；所述长孔道和短孔道具有孔道槽，其深度1为300μm，孔道槽直径4为500μm；两个微流控孔道的长孔道互相平行，距离7为800μm；
所述细胞注入管道为圆柱形，所述注入管道直径6为1mm，高度2为3mm，竖直设置于所述PDMS基板中，其下端连接所述短孔道，上端在PDMS基板上平面开口。
本发明的目的还在于提供一种用于评价伤口敷料的试剂盒，其包括根据权利要求1所述的微流控芯片、容器和待评价伤口敷料。优选地，所述容器为共聚焦培养皿或24孔板，本领域已公开的微流控芯片体积较大，必须在60mm的皿中使用，因而本发明的芯片适用性更强。
本发明的目的还在于提供一种评价伤口敷料的方法，所述方法使用所述试剂盒或所述微流控芯片，通过使用本发明所述的微流控芯片培养的细胞可模拟伤口，并用于评价水凝胶类伤口敷料对伤口的愈合作用。
如图3所示，本发明所述微流控芯片的使用方法包括以下步骤：
1)将所述微流控芯片置于容器中，芯片的孔道紧贴于容器底，从所述细胞注入管道加入细胞悬液；
2)进行细胞培养，芯片孔道中的细胞贴壁于容器底生长，取出所述微流控芯片，得到在容器底贴壁生长的细胞；
3)将待检测敷料覆盖于步骤2)中得到的细胞上，在容器中加入培养基，进行细胞培养和检测。
其中，所述细胞为上皮细胞、内皮细胞和真皮细胞中的一种或至少两种的组合，依据伤口的不同深度和性质选择不同的细胞或细胞组合，由此进行细胞培养所得的“模拟伤口”与真实伤口更接近，其评价结果更真实，可用于为真正的伤口选择适合的辅料；在本发明的实施方案中，所述细胞为MDCK细胞和/或NIH-3T3细胞。
所述细胞培养所用的培养基为任意领域内适用于上皮细胞、内皮细胞和/或真皮细胞的培养基，优选地，所述细胞培养为DMEM高糖培养基；
优选地，所述细胞培养在在37℃，5％二氧化碳的条件下进行，此条件对所述细胞的生长有利。
在步骤1)中，所述加入细胞悬液的方法为将细胞悬液从所述细胞注入管道的开口加入，在同一微流控管道的另一开口处使用用枪头将细胞悬液慢慢吸出，直至细胞悬液充满所述微流控孔道。若此过程中在微流控孔道中产生气泡，则须将细胞悬液小心吸出，再重新加入，直至所述微流控孔道中充满细胞悬液且无气泡。所述微流控孔道贴于容器底，孔道槽和容器底之间形成空隙，细胞存在于该空隙内，经历细胞培养后在该空隙内贴壁于所述容器底。
所述步骤2)中细胞培养的时间为4-6h，时间过短则细胞未贴壁，可能被冲洗掉；而培养时间过长则细胞生长过多，去除微流控芯片的操作中易随着芯片被揭掉。取出微流控芯片时，须用镊子小心夹取，保持贴壁细胞完整。
任选地，取出微流控芯片后，使用细胞培养基进行冲洗一次以除去未贴壁的细胞。所述容器中仅存在微流控芯片的孔道中生长形成的两条细胞带。
所述步骤3)中，将待检测敷料覆盖于细胞形成的孔道上，放入时一端先贴皿，再慢慢将整个敷料覆盖在孔道上以防止气泡产生；
加入培养基的量为0.5-1ml，优选1ml；
所述检测为加入所述培养基分别0h，12h和24h后，使用Leica显微镜对细胞生长情况进行拍照。
本发明的目的还在于提供所述微流控芯片和所述试剂盒在评价伤口敷料中的用途，所述伤口敷料为水凝胶类伤口敷料。优选地，所述伤口敷料为细菌纤维素伤口敷料。本发明可针对细菌纤维素敷料，此敷料的特点为水凝胶状且透明，不易漂浮在培养基中，对细胞贴壁生长无影响，能更准确地模拟敷料与“伤口”的相互作用。
在一个优选的实施方案中，本发明使用一种细菌纤维素进行评价，选用传统的包扎敷料纱布为对照组进行比较，通过Leica显微镜对细胞生长情况进行拍照，检测细胞迁移率从而检测伤口愈合状况，并通过传统的动物实验进行验证。所得的试验结果均证实本发明的微流控芯片对于评价伤口敷料的促愈合作用具有很高的可信度和准确性。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的微流控芯片可评价不同材料对细胞的生长的影响，可以快速准确地评价伤口敷料，整个检测过程只需30h左右，比传统的检测方法效率大大提高且可以使用多种细胞进行检测，检测结果与传统的伤口敷料评价方的检测结果一致。
(2)通过使用本发明的微流控芯片对不同细胞进行培养，可筛选出哪种敷料更利于“伤口”愈合，选择合适的伤口敷料不仅减轻病人的痛苦而且减轻了病人的经济负担；
(3)本发明的微流控芯片为敷料与“伤口”之间的关系提供动态实时观测，可以根据需要构建某些生理、病理机理研究的体外模型，为相关的研究提供有效工具，具有重要的临床意义和应用前景；
(4)本发明的微流控芯片可放置于24孔板进行多组比较，也可放入共聚焦培养皿中，更轻便，适用性更强。
利用本发明所述的微流控芯片在体外可以获取更多的相关信息，对伤口敷料在临床上的应用提供了理论基础和快速得到实验结果，具有重要的临床意义。
附图说明
图1是本发明微流控芯片的示意图。
说明书附图标记如下所示：
a-PDMS基板的厚度；b-PDMS基板的总长度；c-PDMS基板的底边；d-PDMS基板的斜边；e-PDMS基板的侧边；f-PDMS基板的总宽度。
图2是本发明微流控芯片内的微流控孔道的示意图。
说明书附图标记如下所示：
1-微流控孔道的孔道槽深度；2-细胞注入管道长度；3-短孔道长度；4-孔道槽直径；5-长孔道长度；6-细胞注入管道直径；7-互相平行的产孔道之间的距离。
图3为本发明微流控芯片使用方法流程图。
图4为微流控芯片使用MDCK细胞进行敷料评价的细胞迁移图。
图5为微流控芯片使用MDCK细胞进行敷料评价的细胞迁移结果柱形图。
图6为微流控芯片使用NIH-3T3细胞进行敷料评价的细胞迁移图。
图7为微流控芯片使用NIH-3T3细胞进行敷料评价的细胞迁移结果柱形图。
图8为微流控芯片使用MDCK细胞和NIH-3T3细胞进行敷料评价的细胞迁移图。
图9为微流控芯片使用MDCK细胞和NIH-3T3细胞进行敷料评价的细胞迁移结果柱形图。
图10为动物实验中不同时间点皮肤组织修复情况的照片。
图11为动物实验中不同时间点皮肤伤口愈合率柱形图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1：微流控芯片
所述微流控芯片如图1所示，其内部的微流控孔道如图2所示。
本发明所述的微流控芯片包括：一块PDMS基板和在所述PDMS基板内部的两个微流控孔道和四个细胞注入管道；
所述PDMS基板为对称八边形基板，其底边c、侧边e和斜边d的长度分别为1cm、0.5cm和0.5cm，总长度b为1.5cm，总宽度f为1.3cm，厚度a为3mm；
所述微流控孔道位于所述PDMS基板的底面，其包括：一条长孔道5，其与所述基板底边平行，长度为7mm；两条短孔道3，其与侧边平行，分别垂直连接所述长孔道的两个末端，长度为3mm；所述长孔道和短孔道具有孔道槽，其深度1为300μm，孔道槽直径4为500μm；两个微流控孔道的长孔道互相平行，距离7为800μm；
所述细胞注入管道为圆柱形，所述注入管道直径6为1mm，长度2为3mm，竖直设置于所述PDMS基板中，其下端连接所述短孔道，上端在PDMS基板上平面开口。
实施例2：本发明评价伤口辅料的方法
将所述微流控芯片置于共聚焦培养皿中，芯片的孔道紧贴于皿底，将细胞悬液从微流控通道的一个入口管道加入，在另一端用200微升加样枪的枪头将细胞悬液慢慢吸出使细胞悬液充满孔道。在37℃，5％二氧化碳条件下，培养6个小时使孔道中的细胞贴壁于共聚焦培养皿底。用镊子小心将微流控芯片揭掉，用细胞培养基小心冲洗一下，以去掉没有贴壁的细胞，留下在微流控芯片的孔道中生长的细胞形成的两条细胞带。将敷料覆盖于细胞形成的孔道上，放入时一端先贴皿，再慢慢将整个敷料覆盖在孔道上以防止气泡产生。在培养皿中加入1mL培养基，Leica显微镜下拍照。然后置于37℃，5％二氧化碳培养箱中继续培养，分别在12h和24h后进行拍照。
实施例3：用MDCK细胞评价伤口敷料
如实施例2所述的步骤操作，选用细菌纤维素进行评价，选用传统的包扎敷料纱布为对照组进行比较。所用细胞为MDCK细胞(狗肾上皮细胞)。在纱布、细菌纤维素敷料致密面BC-上表面和细菌纤维素敷料疏松面BC-下表面的覆盖情况下比较细胞迁移。用Leica显微镜拍照，并计算出细胞的迁移距离，再通过origin软件画图，可以很清晰快速的看出不同敷料对相同细胞的影响和不同细胞在相同敷料下的关系。
微流控芯片使用MDCK细胞进行敷料评价的细胞迁移图，如图4所示，从上至下为纱布，细菌纤维素致密面BC-上表面，细菌纤维素-疏松面BC-下表面三种敷料，从左到右为0h，12h和24h三个时间点。其对应的柱形图如图5。可见BC-下表面的伤口覆盖下的细胞迁移速率大于BC-上表面，纱布的最慢。
实施例4：用NIH-3T3细胞评价伤口敷料
如实施例2所述的步骤操作，选用细菌纤维素进行评价，选用传统的包扎敷料纱布为对照组进行比较。所用细胞为NIH-3T3细胞(鼠成纤维细胞)。在纱布、细菌纤维素敷料致密面BC-上表面、和细菌纤维素敷料疏松面BC-下表面的覆盖情况下比较细胞迁移。用Leica显微镜拍照，并计算出细胞的迁移距离，再通过origin软件画图，可以很清晰快速的看出不同敷料对相同细胞的影响和不同细胞在相同敷料下的关系。
微流控芯片使用NIH-3T3细胞进行敷料评价的细胞迁移图，如图6所示，从上至下为纱布，细菌纤维素-致密面BC-上表面，细菌纤维素-疏松面BC-下表面三种敷料，从左到右为0h，12h和24h三个时间点。其对应的柱形图如图7。可见BC-下表面的伤口覆盖下的细胞迁移速率大于BC-上表面，纱布的最慢。
实施例5：用MDCK细胞和NIH-3T3细胞评价伤口敷料
如实施例2所述的步骤操作，选用细菌纤维素进行评价，选用传统的包扎敷料纱布为对照组进行比较。所用细胞为MDCK细胞和NIH-3T3细胞。在纱布、细菌纤维素敷料致密面BC-上表面、和细菌纤维素敷料疏松面BC-下表面的覆盖情况下比较细胞迁移。用Leica显微镜拍照，并计算出细胞的迁移距离，再通过origin软件画图，可以很清晰快速的看出不同敷料对相同细胞的影响和不同细胞在相同敷料下的关系。
微流控芯片使用MDCK细胞和NIH-3T3细胞进行敷料评价的细胞迁移图，如图8所示，从上至下为纱布，细菌纤维素-致密面BC-上表面，细菌纤维素-疏松面BC-下表面三种敷料，从左到右为0h，12h和24h三个时间点。其对应的柱形图如图9。可见BC-下表面的伤口覆盖下的细胞迁移速率大于BC-上表面，纱布的最慢。
实施例6：动物实验验证
通过动物实验进行进一步的验证：
全层皮肤组织损伤的制备过程和伤口愈合的动态观察：在老鼠背上制造直径为2厘米的全层皮肤组织损伤，然后使用纱布、细菌纤维素敷料致密面BC-上表面和细菌纤维素敷料疏松面BC-下表面为伤口敷料进行覆盖并包扎。在0d，7d和14d时进行拍照，拍照记录皮肤组织修复情况，如图10所示。通过伤口面积，计算7d和14d的伤口愈合率，如图11所示。结果与使用本发明微流控芯片的细胞迁移实验结果有高度的一致性。BC-下表面的愈合速率大于BC-上表面,纱布的最慢。这说明该装置在敷料评价方面具有很高的可信性和准确度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (14)

1.一种用于评价水凝胶类伤口敷料的试剂盒，其特征在于，包括微流控芯片、容器和待评价水凝胶类伤口敷料，其中所述微流控芯片包括：一块PDMS基板和在所述PDMS基板内部的两个微流控孔道和四个细胞注入管道；
所述PDMS基板为对称八边形基板，其底边、侧边和斜边的长度分别为1cm、0.5cm和0.5cm，总长度为1.5-1.7cm，总宽度为1.3-1.4cm，厚度为3mm；
所述微流控孔道位于所述PDMS基板的底面，其包括：一条长孔道和两条短孔道，长孔道与所述基板底边平行，长度为7mm；短孔道与侧边平行，分别垂直连接所述长孔道的两个末端，长度为3mm；所述长孔道和短孔道的底面具有孔道槽，其深度为300μm，直径为500μm；两个微流控孔道的长孔道互相平行，距离800μm；
所述细胞注入管道为圆柱形，所述注入管道直径为1mm，高度为3mm，竖直设置于所述PDMS基板中，其下端连接所述短孔道，上端在PDMS基板上平面开口；
所述容器为共聚焦培养皿或24孔板。
2.一种评价水凝胶类伤口敷料的方法，其特征在于，所述方法使用根据权利要求1所述的试剂盒，其包括以下步骤：
1)将所述微流控芯片置于容器中，芯片的微流控孔道侧紧贴于容器底，从所述细胞注入管道加入细胞悬液；
2)进行细胞培养，芯片微流控孔道中的细胞贴壁于容器底生长，取出所述微流控芯片，得到在容器底贴壁生长的细胞；
3)将待检测敷料覆盖于步骤2)中得到的细胞上，在容器中加入培养基，进行细胞培养和检测。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞为上皮细胞、内皮细胞和真皮细胞中的一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养用到的培养基为DMEM高糖培养基。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养在37℃和5％二氧化碳的条件下进行。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述加入细胞悬液的方法为将细胞悬液从所述细胞注入管道的开口加入，在同一微流控孔道的另一开口处使用用枪头将细胞悬液慢慢吸出，直至细胞悬液充满所述微流控孔道。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中细胞培养的时间为4-6h。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中细胞培养的时间为6h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中取出微流控芯片后，使用细胞培养基进行冲洗以去除未贴壁细胞。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中加入培养基的量为0.5-1ml。
11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中加入培养基的量为1ml。
12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述检测为加入所述培养基分别0h，12h和24h后，使用Leica显微镜对细胞培养情况进行拍照。
13.根据权利要求1所述的试剂盒在评价伤口敷料中的用途，其特征在于，所述伤口敷料为水凝胶类伤口敷料。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述伤口敷料为细菌纤维素伤口敷料。
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