CN104193812A

CN104193812A - Slrd1-4蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN104193812A
Application number: CN201410456919.1A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 程治军; 罗胜; 高赫
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-09-10
Filing date: 2014-09-10
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-09-10
Also published as: CN104193812B

Abstract

本发明公开了一种与植物株高发育相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)SEQ ID No.1所示蛋白质；2)将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株高发育相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的与调控植物株高发育相关蛋白主要控制植物株高，所述蛋白的编码基因在表达后可导致植物矮化，并且相对于正常高株为显性。选用所述显性矮秆基因作为矮源，亲本筛选的范围将更广泛，从而有利于远缘杂交包括籼、粳间亚种间杂交亲本的选配。

Description

Slrd1-4蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的一种蛋白质及其编码基因与应用，特别涉及与植物株高发育相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)作为我国乃至世界最重要的粮食作物之一，其产量的提高对解决未来全球粮食问题具有十分重要的战略意义。株型是影响水稻产量的重要农艺性状之一，对其深入研究不仅是了解水稻生长发育分子机制的重要途径，同时也为作物株型改良奠定了重要的应用基础。株高是作物株型改良的目标之一，世界范围内的“绿色革命”就是以作物矮化育种为标志。然而，自20世纪60年代至今，育种上可利用优秀矮源并不多，目前仍然以sd-1基因为主。过度应用有限的矮源可能会导致水稻品种遗传背景单一，从而导致品种抗病虫能力下降。特别是，随着杂交育种技术的突破和发展，杂种优势的充分利用也带来了株高的偏高的问题。现有的防止F₁株高过高的策略是：双亲都利用主效矮秆基因sd-1。如一个亲本含有隐性矮秆基因sd-1，则另一亲本只能在带有sd-1的矮秆品种或育种中间材料里寻找。从而排除了在数量更大、遗传基础更为多样的中、高秆水稻品种里寻找杂交稻亲本的可能性。但是，选用显性矮秆基因作为矮源，株高问题的解决将变得容易。在一个亲本含有显性矮秆基因的情况下，对手亲本的株高将不再受限制，亲本筛选的范围将更广泛，有利于远缘杂交包括籼、粳间亚种间杂交亲本的选配。此外，发掘能有效地降秆并抑制F₁株高超亲优势且对其它重要农艺性状影响小的显性矮秆基因，对其它作物的杂种优势利用以及果、疏和一些观赏、园艺植物的株型改良具有潜在的利用价值。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种与植物株高发育相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物株高发育相关的蛋白，名称为Slrd1-4，来源于稻属水稻(Oryza sativa var.Kitaake)的组织培养突变体Slrd1-4，是正常株高Kitaake的氨基酸序列的第96位置上发生了P→H的氨基酸突变。

本发明所提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白质：

1)SEQ ID No.1所示蛋白质；

2)将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物株高发育相关的由1)衍生的蛋白质。

本发明所提供的蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所示：

1)SEQ ID No.2所示编码基因；

2)SEQ ID No.2中自5’末端起第2529到4406位核苷酸所示基因；

3)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有80％以上同源性且编码所述蛋白的基因。

含有上述任一所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体为pCUbi1390-Slrd1-4；所述pCUbi1390-Slrd1-4为将上述基因插入pCUbi1390多克隆位点得到的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将上述任一所述编码基因导入出发植物中，得到株高矮于所述出发植物的转基因植物。

上述方法中，所述编码基因是通过所述重组表达载体导入出发植物中。

上述方法中，所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物。

上述方法中，所述单子叶植物为水稻。

上述方法中，所述水稻的品种为kitaake。

本发明的与植物株高发育相关蛋白主要控制植物株高，所述蛋白的编码基因在表达后可导致植物矮化，并且相对于正常高株为显性。选用该基因作为矮源，亲本筛选的范围将更广泛，从而有利于远缘杂交包括籼、粳间亚种间杂交亲本的选配。

附图说明

图1为野生型Kitaake和突变体fc21的株高对比形态。

图2为转pCUbi1390-Slrd1-4植株表型鉴定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、调控植物株高发育相关蛋白及其编码基因的获得及其功能验证

一、调控植物株高发育相关蛋白及其编码基因的获得

1、水稻显性矮秆突变体slrd1-4及其遗传分析

本研究利用野生型Kitaake愈伤组织培养后代中得到一个显性矮秆突变体fc21。突变体与其野生型相比表现为：(1)植株显著变矮，穗长及各节间均相应缩短，株高降低约70％；(2)每株穗数无明显变化；(3)每穗粒数减少约20％，明显降低结实率(78％)；(4)籽粒无明显变化；(5)株型紧凑，叶片短宽，叶色深绿(图1，a为野生型，b为突变体fc21)。用纯合矮秆突变体fc21作为父本，与水稻品种9311配制杂交组合。所有F₁种植在海南、北京，株高都低于亲本中亲值，比高秆亲本降低41％～71％，表现半矮秆，这是到目前为止在水稻中报道的降秆能力最强的突变体。显性矮化突变体与正常植株在不同F₂群体中的分离情况如表1所示。

表1.显性矮化突变体与正常植株在不同F₂群体中的分离

2、突变基因的获得

以fc21的基因组DNA为模板，用如下引物primer1和primer2进行PCR扩增获得目的基因。其中的下划线部分为In-Fusion酶连接用接头。

Primer1：5'-GGTAGATCTGACTAGTTACCTCTCGGCCTCCTTCTA-3'；

primer2：5'-TAGCGTTAACACTAGTGTTGTTGCAGCAAACGCATT-3'。

将PCR产物回收纯化后连接入pBS-T(购买自北京Tiangen公司)测序载体，转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆后，进行测序。

测序结果表明，扩增得到的PCR产物的序列如SEQ ID No.2所示，其中编码框序列为SEQ ID No.2中自5’末端起第2529到4406位核苷酸，该编码框编码的蛋白序列如SEQ ID N o.1所示，将该蛋白命名为Slrd1-4。

二、与植物株高发育相关蛋白(Slrd1-4)及其编码基因的功能验证：

1.表达载体构建

将上述步骤一PCR产物连接到经SpeI酶切处理的pCUbi1390载体(Peng H,ZhangQ,Li YD,Lei CL,Zhai Y,Sun XH,Sun DY,Sun Y,Lu TG(2009)putativeleucine-rich repeat receptor kinase,OsBRR1,is involved in rice blastresistance.Planta 230:377–385，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得)上，得到重组植物表达载体；构建好的重组植物表达载体转化大肠杆菌菌株DH5a，提取质粒用于酶切和测序检测，将检测表明正确的含有Slrd1-4基因的重组载体命名为pCUbi1390-Slrd1-4。

用电击法将该重组载体转化农杆菌LBA4404(Invitrogen公司,18313－015)菌株，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。PCR鉴定用引物序列如下所述：

primer3：5'-TACCTCTCGGCCTCCTTCTA-3'；

primer4：5'-GTTGTTGCAGCAAACGCATT-3'。

将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCUbi1390-Slrd1-4。

2.农杆菌介导转化

利用农杆菌介导将构建好的EH-pCUbi1390-Slrd1-4转化Kitaake(常规粳稻品种，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得)，具体方法为：

1)28℃培养EH-pCUbi1390-Slrd1-4，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基(Sigma公司购买，C1416)，中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

2)将培养至一个月的水稻成熟胚胚性愈伤组织与上述菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入N6固体共培养培养基中，24℃共培养3天；

共培养基配方:

3)将上述愈伤组织接种在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司购买)的N6固体筛选培养基上进行第一次筛选；

N6固体培养基配方：

4)第16天挑取健康愈伤组织转入200mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上进行第二次筛选，每15天继代一次；

5)挑取抗性愈伤组织转入含有150mg/L潮霉素的分化培养基上分化；

分化培养基配方：

6)分化成苗的再生水稻植株即为所获得的转EH-pCUbi1390-Slrd1-4植株(T₀代)。

3.转基因植株分子鉴定及Slrd1-4基因功能验证

上述步骤2获得的转EH-pCUbi1390-Slrd1-4植株的T₀代幼苗和对照Kitaake的种子在温室中种植，抽穗后测量株高，同时取样提取DNA进行PCR分子检测。

将上述步骤2获得的转EH-pCUbi1390-Slrd1-4植株进行PCR分子检测的引物是primer 5：5'-TGCCTTCATACGCTATTTATTTGC-3'和primer 6：5'-GCAACCGAAGATGGGGATTC-3'，扩增产物为1008bp的为阳性。

表型鉴定结果表明，与突变体fc21一样，2株转EH-pCUbi1390-Slrd1-4的转基因kitaake(图2中B)表型均为矮株，其株高分别为35cm、38cm，而非转基因的野生型kitaake的表型为高株(图2中A)，所检测的2株野生型kitaake的株高分别为68.5cm、70cm。转空载体植株的表型与野生型一致。

结果表明，所有PCR鉴定阳性的转EH-pCUbi1390-Slrd1-4水稻植株其表型由转基因前的高株(Slrd1-4基因为显性基因)转变为转基因后的矮株。验证了转基因后的矮株性状是由Slrd1-4基因控制的，即该Slrd1-4基因为与株高发育相关基因。

Claims

1.一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：

1)SEQ ID No.1所示蛋白质；

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所示：

1)SEQ ID No.2所示编码基因；

2)SEQ ID No.2中自5’末端起第2529到4406位核苷酸所示基因；

3)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体为pCUbi1390-Slrd1-4；所述pCUbi1390-Slrd1-4为将权利要求2或3所述基因插入pCUbi1390多克隆位点得到的重组表达载体。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入出发植物中，得到株高矮于所述出发植物的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入出发植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述出发植物为双子叶植物或单子叶植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述水稻的品种为kitaake。