CN104186971A

CN104186971A - 一种仔猪用抗应激剂及其制备方法

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Publication number: CN104186971A
Application number: CN201410373093.2A
Authority: CN
Inventors: 曾梦良; 兰时乐
Original assignee: HUNAN DANWEI BILOGICALTECH Ltd
Current assignee: HUNAN DANWEI BILOGICALTECH Ltd
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明公开了一种仔猪用抗应激剂及其制备方法，是将丁酸梭状芽孢杆菌菌粉、乳酸菌菌粉、纳豆芽孢杆菌菌粉、维生素C和/或维生素E磷酸酯、有机酸、钾盐混合、搅拌均匀制得。所述各菌粉是在固体培养基中接入各菌种液体种子，经发酵、干燥、粉碎制得。本发明的抗应激剂不仅能帮助猪肠道快速建立微生态平衡，而且能提高断乳仔猪免疫力，预防由于仔猪在断奶、转群、运输等过程中出现的应激综合症，具有抗应激效果好、原料来源广泛、生产工艺简单、成本低廉、无“三废”排放等特点。

Description

一种仔猪用抗应激剂及其制备方法

技术领域

本发明属于动物养殖中的生物技术领域，具体涉及一种仔猪用复合微生态抗应激剂及其制备方法。

背景技术

猪的应激综合症是指猪体受到各种应激因素的强烈刺激后，处于紧张或戒备状态时，所产生的一系列神经内分泌的非特异性全身性反应，以及由此而引起的机体各种机能和代谢功能的变化。例如生长受损，抗病力下降，繁殖障碍，甚至死亡等。近年来，由于我国养猪业发展迅速，国外瘦肉型猪种引进并普及，以及集约化、规模化养猪业的兴起，长途运输多，饲养密度大，人为干扰频繁，使生猪应激反应综合症的发生率大幅度上升，给养猪业造成了巨大的经济损失。应激首先是机体的正常生理活动发生变化，例如配种繁殖，分娩泌乳，精神紧张等都可作为应激原引起应激反应。断奶、转群、去势、捕捉、驱赶、惊吓、拥挤、打斗、保定、运输、高温、噪音、空气污染，免疫注射、环境突变等一系列异常刺激，当强度和作用时间达到一定量时，均可引起应激反应综合症的发生。另外，应激的发生还与遗传因素（携带氟烷基因）、内分泌失调、硒缺乏、蛋白质缺乏等有一定关系。应激对猪的的健康和生产力、繁殖力、肉品质等都有不良影响，严重时可导致各种疾病的流行，甚至引起猪的死亡。特别是断奶仔猪，由于早期断奶导致断乳应激、产房到保育舍环境变化的应激、哺乳管理转为保育管理的应激等，造成仔猪精神状态不佳，呼吸不畅，腹泻，食欲不旺或拒食，生长发育不良或停滞（甚至负增长），出现僵猪，甚至死亡，使得保育仔猪的育成率降低。

国内外研究发现，常用的抗应激药物包括糖类(如葡萄糖、活性多糖、几丁聚糖等)、维生素类、氨基酸类(赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、牛磺酸、谷氨酰氨等)、电解质矿物元索类(碳酸氢钠、氯化钠、氯化钾、氯化铵、有机镁、硒、锌、铬)、有机酸类(柠檬酸、苹果酸、腐植酸、甜菜碱等)、抗生素类、化学约物、中草药、微生物等。近些年来，许多国内外研究工作者研究了抗应激免疫增强剂来提高动物机体的抵抗力，并取得了一定的研究成果，开发出了一系列新型高效的抗应激免疫增强剂。国内专利CN102987169A 公开了一种断奶仔猪核苷酸饲料添加剂、制备方法及应用，该发明通过加入核苷酸作为营养剂以缓解仔猪断奶的应激反应，但是该反应加入的核苷酸只能作为营养补充剂，无法从根本上减少仔猪应激反应问题的出现；CN103355545A 公开了一种发酵型植物性断奶仔猪饲料添加剂，主要由中草药、牛至草提取物和芦荟多糖混合配制而成。该发明使用了多种植物混合进行发酵之后加入到仔猪的饲料中，对于14 日龄早期隔离断奶的仔猪而言，过多的混杂添加剂，可能会使仔猪的消化负担加重；专利201310104364.X公开了了一种仔猪抗应激合生元中药组合物及其制备方法，主要由中草药及产乳酸枯草芽孢杆菌组成；专利201310031200.9、200510031708.4公开了由各种维生素、氨基酸、微量元素等组成的仔猪抗应激剂；专利201210310298.7、200910220085.3、201310729176.6分别公开了由中草药或其提取物组成的断奶仔猪抗应激、抗腹泻、促生长饲料添加剂。尽管这些专利产品在仔猪抗应激方面有一定的效果，但许多产品仅限于中草药或其提取物、维生素等组合物，存在抗应激作用不稳定、效果不突出等缺点。

发明内容

本发明的目的是：针对上述现有技术的不足，提供一种断乳仔猪用复合微生态抗应激剂及其制备方法，该抗应激剂能有效改善仔猪肠道生态环境，促进肠道益害微生物平衡，提高仔猪的免疫力和抗应激能力，解决目前市场上仔猪抗应激剂存在的抗应激作用不稳定、效果不突出等问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：本发明的仔猪用抗应激剂，包括按重量百分比计的下述成分：丁酸梭状芽孢杆菌菌粉30%-35%、乳酸菌菌粉30%-40%、纳豆芽孢杆菌菌粉14%-20%、维生素C和/或维生素E磷酸酯6.5%-11%、调节肠道pH值的有机酸4.5%-10.5%、和钾盐5%-8%，合计100%。

所述有机酸优选为柠檬酸和苹果酸，所述钾盐优选为KCl。

本发明的仔猪用抗应激剂优选重量百分比为：丁酸梭状芽孢杆菌菌粉30%-33.5%、乳酸菌菌粉31%-32.5%、纳豆芽孢杆菌菌粉14%-16%、维生素C 3.5%-5%、维生素E磷酸酯3%-4%、柠檬酸2.5%-3.5%、苹果酸3.5%-5%、和KCl 5%-7%。

所述仔猪为断乳仔猪，所述乳酸菌为乳酸片球菌。

该抗应激剂中有效活菌数含量1.5×10¹⁰-2.5×10¹⁰ cfu/g。

上述仔猪用抗应激剂的制备方法，包括以下步骤：

（a）按20-25%接种重量在固体培养基中接入纳豆芽孢杆菌液体种子，在30-37℃的无菌环境中培养至95%以上的菌体形成芽孢；

（b）按15-20%接种重量在固体培养基中接入乳酸菌液体种子，于35-37℃无菌环境中发酵4-5d；

（c）按15-20%接种重量在固体培养基中接入丁酸梭状芽孢杆菌液体种子，于35-37℃的无菌环境中发酵4-5d；

（d）分别在上述培养好的固体发酵培养中加入保护剂，干燥、粉碎得到纳豆芽孢杆菌菌粉、乳酸菌菌粉和丁酸梭状芽孢杆菌菌粉；

（e）将所得各菌粉与维生素C和/或维生素E磷酸酯、有机酸、钾盐按所述配比混合均匀，制得抗应激剂。

所述步骤（a）-（c）所述的固体培养基由下述方法得到：按重量百分比取麦麸30%-40%、玉米粉15%-25%、大米粉15%-20%、沸石粉20%-30%、葡萄糖1%-2%、(NH₄)₂SO₄1.5%-2%、KH₂PO₄0.1-0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.05-0.15%，合计100%，混合均匀，调节含水重量为50%-55%，灭菌。

所述纳豆芽孢杆菌液体种子是将纳豆芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体肉汤营养培养基中，在35℃-37℃，160r/min-180r/min条件下，摇床振荡培养20-24h，使该种子培养液中菌体浓度达到4.5-6.7×10⁸-10⁹cfu/mL；所述乳酸菌液体种子是将乳酸片球菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体MRS培养基中，在37-40℃条件下静置培养24-48h，使该种子培养液中菌体浓度达到3.1-4.2×10⁷- 10⁸cfu/mL；所述丁酸梭状芽孢杆菌液体种子是将丁酸梭状芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于丁酸梭状芽孢杆菌液体种子培养基中，30-35℃条件下于厌氧培养箱中培养96-120h，使该种子培养液中菌体浓度达到2.5-3.5×10⁷-10⁸cfu/mL。

作为改进，步骤（b）和（c）中是将菌种液体种子装入用95%乙醇灭菌的内衬塑料编织袋中并压实，扎紧袋口后发酵。

作为改进，步骤（d）所述保护剂为海藻糖、甘油和轻质碳酸钙中的两种或三种混合物，以固体培养基干重计加入15%-18%的保护剂；所述干燥为40-45℃干燥6-8h。

本发明的“接种重量”指菌种液体种子体积（L）与固体培养基质量（kg）的比值，例如“20%的接种重量”指20L/100kg。

本发明同时应用三种不同类型的菌种（好氧菌、严格厌氧菌和兼性厌氧菌），能及时消耗肠道中的氧气，保持肠道内优势种群的稳定性和整个肠道微生态环境的相对稳定。其中采用的丁酸梭状芽孢杆菌，可抑制肠道有害菌，促进有益菌生长；减少肠内氨、胺含量（这两种物质会损害肝功能）；产生多种维生素，如维生素K等；产生多种酶类，提高饲料利用率，促进动物生长。此外，本发明同时结合能提高动物肌体免疫力和促生长作用等的维生素，补充肌体因应激造成的体液酸碱不平衡的有机酸，从而提高断奶仔猪机体对外来刺激的代偿能力。

因此，与现有技术相比，本发明的复合微生态抗应激剂不仅能快速、有效地建立和修复断奶仔猪的微生态平衡，清除机体内自由基，而且能提高断乳仔猪免疫力，预防由于仔猪在断奶、转群、去势、捕捉、驱赶、运输等过程中出现的应激综合症，降低应激反应强度，具有抗应激效果好。同时，本发明方法具有原料来源广泛、生产工艺简单、易于规模化生产、成本低廉、生产能耗低、无“三废”排放等特点。

具体实施方式

本发明中用到的菌种均为现有技术，可购自各保藏机构，例如保藏号分别为：丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyricum）：JSMCB或ATCC 25755；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）：CGMCC1.2696、CICC10146或CICC10346；纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）：CCTCC M207147、CGMCC 0724或ATCC 6051。

本发明所用菌种的液体种子培养基均为现有技术，例如可以按下述方法制备：

液体肉汤营养培养基可以按1000mL 水加10-20g 葡萄糖、5-10g蛋白胨、3-5g 牛肉膏、及3-5g 氯化钠的比例，于水中加入葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、及氯化钠，搅匀，在0.1MPa 压力下灭菌25min，冷却至30℃而成。

液体MRS培养基可以按下述方法制成：将蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温-80 1.0g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.29g、碳酸钙20.0g、琼脂15.0g依次加入蒸馏水并将蒸馏水补充到1000mL，pH调至6.3，在121℃、0.1Mpa下灭菌30min。

丁酸梭状芽孢杆菌液体培养基可以按1000mL 水加入 20-40g 葡萄糖、15-20g 胰蛋白胨、1.0-1.5g 硫酸铵、2.0-2.5g 氯化钠、1.0-1.5g 碳酸氢钠、3.0-4.0g 磷酸氢二钾、0.5-0.8g 七水硫酸镁、1.0-2.0g 碳酸钙的比例，于水中加入葡萄糖、胰蛋白胨、硫酸铵、氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、碳酸钙，搅匀，在0.1MPa 压力下灭菌25min，冷却至30℃而成。

本发明中用到的维生素C、维生素E磷酸酯、柠檬酸、苹果酸、钾盐等均为现有产品，市场有售。下面以具体实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：

本实施例所用的菌种为丁酸梭状芽孢杆菌、乳酸片球菌、纳豆芽孢杆菌。其步骤为：

（1）制备液体菌种：将纳豆芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体扩大肉汤营养培养基中，在36℃，160r/min条件下，摇床振荡培养22h，使该种子培养液中菌体浓度达到5.8×10⁸cfu/mL；

将乳酸片球菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体MRS培养基中，在37℃条件下静置培养36h，使该种子培养液中菌体浓度达到3.7×10⁸cfu/mL；

将丁酸梭状芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于丁酸梭状芽孢杆菌液体种子培养基中，35℃条件下于厌氧培养箱中培养96h，使该种子培养液中菌体浓度达到2.6×10⁷cfu/mL。

（2）制备固体培养基：按重量百分比取麦麸35%、玉米粉21.2%、大米粉15%、沸石粉25.5%、葡萄糖1.5%、（NH₄）₂SO₄1.5%、KH₂PO₄0.15%、MgSO₄·7H₂O 0.15%，混合均匀，调节含水重量为52%，于121℃条件下灭菌60min，冷却至室温后，得到固体培养基。

（3）制备菌粉：于上述固体培养基中按20%接种重量接入纳豆芽孢杆菌液体种子，充分混合，置于发酵浅盘中，于35℃无菌发酵室中培养至95%以上的菌体形成芽孢；

分别按18%接种重量接入乳酸片球菌和丁酸梭状芽孢杆菌液体种子，装入用95%乙醇灭菌的内衬塑料编织袋中并压实，扎紧袋口后于37℃发酵4d；

以固体培养基干重加入8%海藻糖、8%甘油作为保护剂，充分拌匀；

将上述培养好的固体发酵培养基于42℃干燥6.5h，粉碎得各菌粉。

（4）取丁酸梭状芽孢杆菌菌粉30%、乳酸片球菌菌粉32%、纳豆芽孢杆菌菌粉16%、维生素C 5%、维生素E磷酸酯4%、柠檬酸2.5%、苹果酸4.5%、KCl 6%，充分混合均匀，过60目筛，包装后即得成品。

实施例2：

（1）将纳豆芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体扩大肉汤营养培养基中，在37℃，170r/min条件下，摇床振荡培养20h，使该种子培养液中菌体浓度达到6.5×10⁸cfu/mL；将乳酸片球菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体MRS培养基中，在40℃条件下静置培养48h，使该种子培养液中菌体浓度达到4.05×10⁸cfu/mL；将丁酸梭状芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于丁酸梭状芽孢杆菌液体种子培养基中，32℃条件下于厌氧培养箱中培养104h，使该种子培养液中菌体浓度达到2.2×10⁸cfu/mL。

（2）按重量百分比取麦麸31.5%、玉米粉24%、大米粉18.2%、沸石粉23%、葡萄糖1%、（NH₄）₂SO₄2%、KH₂PO₄0.25%、MgSO₄·7H₂O 0.05%，混合均匀，调节含水重量为55%，于121℃条件下灭菌60min，冷却至室温后，得到固体培养基。

（3）于上述固体培养基中按25%接种重量接入纳豆芽孢杆菌液体种子，充分混合，置于发酵浅盘中，于32℃无菌发酵室中培养至95%以上的菌体形成芽孢；分别按15%接种重量接入乳酸片球菌和丁酸梭状芽孢杆菌液体种子，装入用95%乙醇灭菌的内衬塑料编织袋中并压实，扎紧袋口后于35℃发酵5d；

以固体培养基干重加入6%海藻糖、4%甘油和8%轻质碳酸钙作为保护剂，充分拌匀；将上述培养好的固体发酵培养基于40℃干燥7h，粉碎得各菌粉。

（4）取丁酸梭状芽孢杆菌菌粉32%、乳酸片球菌菌粉31%、纳豆芽孢杆菌菌粉15.5%、维生素C 4.5%、维生素E磷酸酯3.5%、柠檬酸3%、苹果酸3.5%、KCl 7%，充分混合均匀，过60目筛，包装后即得成品。

实施例3：

（1）将纳豆芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体扩大肉汤营养培养基中，在35℃，180r/min条件下，摇床振荡培养24h，使该种子培养液中菌体浓度达到4.2×10⁹cfu/mL；将乳酸片球菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体MRS培养基中，在38℃条件下静置培养40h，使该种子培养液中菌体浓度达到3.93×10⁷cfu/mL；将丁酸梭状芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于丁酸梭状芽孢杆菌液体种子培养基中，30℃条件下于厌氧培养箱中培养120h，使该种子培养液中菌体浓度达到3.12×10⁷cfu/mL。

（2）按重量百分比取麦麸38.5%、玉米粉20.5%、大米粉16.7%、沸石粉20.6%、葡萄糖1.87%、（NH₄）₂SO₄1.7%、KH₂PO₄0.1%、MgSO₄·7H₂O 0.13%，混合均匀，调节含水重量为50%，于121℃条件下灭菌60min，冷却至室温后，得到固体培养基。

（3）于上述固体培养基中按18%接种重量接入纳豆芽孢杆菌液体种子，充分混合，置于发酵浅盘中，于37℃无菌发酵室中培养至95%以上的菌体形成芽孢；分别按20%接种重量接入乳酸片球菌和丁酸梭状芽孢杆菌液体种子，装入用95%乙醇灭菌的内衬塑料编织袋中并压实，扎紧袋口后于36℃发酵4.5d；

以固体培养基干重加入11%甘油和7%轻质碳酸钙作为保护剂，充分拌匀；将上述培养好的固体发酵培养基于45℃干燥6h，粉碎得各菌粉。

（4）取丁酸梭状芽孢杆菌菌粉33.5%、乳酸片球菌菌粉32.5%、纳豆芽孢杆菌菌粉14%、维生素C 3.5%、维生素E磷酸酯3%、柠檬酸3.5%、苹果酸5%、KCl 5%，充分混合均匀，过60目筛，包装后即得成品。

本发明的抗应激剂在湖南桃江、安化等地的许多大中小养猪场进行了大量的应用试验，证明具有促生长、抗应激、提高免疫力和预防疾病等作用。应用效果举例如下：

（1）仔猪的选择和分组

选择同批次体重相近的长白二元杂交断乳仔猪45头，按性别、窝别和体重随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3组，每组15头，公母各半，初始重组内和组间差异均不显著（p＞0.05），基础日粮为大北农公司生产的仔猪料。其中Ⅰ组为对照组，Ⅱ、Ⅲ两组为试验组，Ⅱ组在基础日粮中添加1.5%的实施例1产品，Ⅲ组在基础日粮中添加2.0%的实施例1产品，对照组不添加任何其它物质。

（2）试验时间

试验时间自2013年9月5日开始至2013年11月5日结束。

（3）饲养管理

各组分栏饲喂，栏舍为水泥地板，其它环境条件一致。试验前进行防疫、去势和驱虫。采用自由采食和自由饮水，饲料为粉料，以吃饱不剩料为准。

（4）测定项目

每天记录每栏饲料的消耗量和猪只的健康状况、用药量、次数及价格。试验结束时空腹16小时称猪只终重，计算平均日增重、料重比、腹泻率等，并用EXCELL软件进行分析比较。

（5）试验结果

各组试验结果见表1。

表1 试验组与对照组断乳仔猪饲喂效果统计表

从表1可以看出，日粮中添加一定量的本发明产品，断乳仔猪日增重、饲料利用率都得到显著提高，腹泻率显著下降。且在饲养过程中发现，试验组与对照组相比，猪只毛皮红润，喜睡，外界干扰影响较小，而对照组猪只受到外界刺激表现为焦躁不安。因此可以得出结论，日粮中添加本技术产品，对断乳仔猪具有良好的抗应激效果。

Claims

1.一种仔猪用抗应激剂，其特征在于包括按重量百分比计的下述成分：丁酸梭状芽孢杆菌菌粉30%-35%、乳酸菌菌粉30%-40%、纳豆芽孢杆菌菌粉14%-20%、维生素C和/或维生素E磷酸酯6.5%-11%、调节肠道pH值的有机酸4.5%-10.5%、和钾盐5%-8%，合计100%。

2.根据权利要求1所述的仔猪用抗应激剂，其特征在于所述有机酸为柠檬酸和苹果酸，所述钾盐为KCl。

3.根据权利要求2所述的仔猪用抗应激剂，其特征在于重量百分比为：丁酸梭状芽孢杆菌菌粉30%-33.5%、乳酸菌菌粉31%-32.5%、纳豆芽孢杆菌菌粉14%-16%、维生素C 3.5%-5%、维生素E磷酸酯3%-4%、柠檬酸2.5%-3.5%、苹果酸3.5%-5%、和KCl 5%-7%。

4.根据权利要求1-3之一所述的仔猪用抗应激剂，其特征在于所述仔猪为断乳仔猪，所述乳酸菌为乳酸片球菌。

5.根据权利要求4所述的仔猪用抗应激剂，其特征在于该抗应激剂中有效活菌数含量1.5×10¹⁰-2.5×10¹⁰ cfu/g。

6.一种权利要求1-5之一所述仔猪用抗应激剂的制备方法，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的仔猪用抗应激剂的制备方法，其特征在于所述步骤（a）-（c）所述的固体培养基由下述方法得到：按重量百分比取麦麸30%-40%、玉米粉15%-25%、大米粉15%-20%、沸石粉20%-30%、葡萄糖1%-2%、(NH₄)₂SO₄1.5%-2%、KH₂PO₄0.1-0.3%、MgSO₄·7H₂O 0.05-0.15%，合计100%，混合均匀，调节含水重量为50%-55%，灭菌。

8.根据权利要求6或7所述的仔猪用抗应激剂的制备方法，其特征在于所述纳豆芽孢杆菌液体种子是将纳豆芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体肉汤营养培养基中，在35℃-37℃，160r/min-180r/min条件下，摇床振荡培养20-24h，使该种子培养液中菌体浓度达到4.5-6.7×10⁸-10⁹cfu/mL；所述乳酸菌液体种子是将乳酸片球菌1株接种一环斜面菌种细胞于液体MRS培养基中，在37-40℃条件下静置培养24-48h，使该种子培养液中菌体浓度达到3.1-4.2×10⁷- 10⁸cfu/mL；所述丁酸梭状芽孢杆菌液体种子是将丁酸梭状芽孢杆菌1株接种一环斜面菌种细胞于丁酸梭状芽孢杆菌液体种子培养基中，30-35℃条件下于厌氧培养箱中培养96-120h，使该种子培养液中菌体浓度达到2.5-3.5×10⁷-10⁸cfu/mL。

9.根据权利要求6或7所述的仔猪用抗应激剂的制备方法，其特征在于（b）和（c）中是将菌种液体种子装入用95%乙醇灭菌的内衬塑料编织袋中并压实，扎紧袋口后发酵。

10.根据权利要求6或7所述的仔猪用抗应激剂的制备方法，其特征在于步骤（d）所述保护剂为海藻糖、甘油和轻质碳酸钙中的两种或三种混合物，以固体培养基干重计加入15%-18%的保护剂；所述干燥为40-45℃干燥6-8h。