CN104186318B - 一种提高粘毛黄芩黄酮化合物含量的方法 - Google Patents
一种提高粘毛黄芩黄酮化合物含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种提高粘毛黄芩黄酮化合物含量的方法，属于生物技术领域；采用生化工程技术，用稀土镨诱导粘毛黄芩毛状根，提高黄酮化合物含量，具体包括如下步骤：（1）粘毛黄芩毛状根的悬浮培养：称取约100mg新鲜粘毛黄芩毛状根，置于规模化培养容器中，然后加入体积分数为80%的1/2MS0培养基进行悬浮培养；（2）Pr诱导子对粘毛黄芩毛状根培养物的处理：在培养液中加入25mmol/L的Pr3+溶液置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养7天；（3）黄酮类化合物的提取与检测；本发明采用稀土镨改良培养基，可高效生产黄芩黄酮的新型培养体系，相比于1/2MS0对照培养基，黄酮产量增加4.502倍；方法简单，培养体系稳定，为黄芩黄酮的生产提供一种新型优质的可持续药源。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高黄酮化合物含量的方法，具体涉及一种提高粘毛黄芩黄酮化合物含量的方法，属于生物技术领域。
背景技术
黄酮是唇形科药用植物粘毛黄芩（ScutellariabaicalensisBunge）的主要药效成分，具有清热解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利胆、降压脱敏、防晒美白等作用。随着国际上对黄芩黄酮研究的持续升温和认识的逐步深入，认为其在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV等多方面均有作用。近年来，由于黄芩黄酮药理作用被广泛重视，对粘毛黄芩的需求量大增，黄芩野生资源破坏严重。而黄芩黄酮来源十分有限，且在天然植物中含量低、生长周期长，致使黄芩已被我国列为三级濒危保护植物，同时药材产地环境污染和农药喷施等原因，导致原料药的供应在数量和质量上都难以满足临床应用的需要。因而提高粘毛黄芩产品的科技含量，提升粘毛黄芩产业地位势在必行，这有赖于科技的源头创新。
诱导子在促进植物次生代谢产物的生产中的作用是非常明显的，目前的研究也取得了一定的进展，例如Ge等在丹参毛状根培养物中加入Ag+和酵母提取物诱导子，丹参酮的含量比对照组增加了约10倍。诱导子活化植物次生代谢途径的一个明显的特点是具有种属专一性，即对特定次生代谢产物进行选择性诱导，例如真菌诱导物可诱导百脉根毛状根中的苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）快速活化，合成异黄酮化合物，而对其它无直接关系的酶没有明显作用。因此诱导子的筛选就是一个十分重要的工作，但同时也是一个世界性的难题。
毛状根培养是80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项新技术，以其生长快速、遗传稳定等优点成为颇具潜力的药用植物培养系统，而毛状根大规模培养的关键在于其生物反应器培养技术的建立和优化。生物反应器培养毛状根生产次生代谢产物作为一个方兴未艾的热点领域，虽然技术尚不成熟，但不乏成功的探索。Sudo等在3L反应器中培养喜树毛状根获得喜树碱，Savitha等在鼓泡式反应器培养甜菜毛状根获得甜菜红色素。因此，粘毛黄芩毛状根的生物反应器工程研究将为今后黄芩苷等黄酮类化合物的工业化生产奠定基础，对于粘毛黄芩这一濒危保护植物资源的持续开发利用以及绿色原料药的生产应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种稀土镨（Pr）和化学技术诱导粘毛黄芩毛状根培养物生产黄酮的方法，建立了高产黄酮的粘毛黄芩毛状根悬浮培养体系及其应用方法，大大提高了黄酮产量，为基于现代生物技术的粘毛黄芩黄酮生产工艺奠定了坚实的基础。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：
一种提高粘毛黄芩黄酮化合物含量的方法，采用生化工程技术，用稀土镨诱导粘毛黄芩毛状根，提高黄酮化合物含量，包括如下步骤：
首先配制Pr3+溶液母液，浓度为1mmol/L，pH值调至为5.5，然后将粘毛黄芩毛状根切成2-3cm长的节段，转入诱导子生化培养基上，其诱导子生化培养基为1/2MS培养基+一定浓度的Pr3+溶液母液，置于25℃±1.0℃恒温悬浮振荡培养，转速110rpm，7天后可见镨能显著促进粘毛黄芩毛状根的生长，最后进行黄酮类化合物的醇法提取与比色法检测。
所述的Pr3+溶液为Pr(No3)3、Pr2(SO4)3、或PrCl3溶液中的一种或其组合。
所述的一定浓度是指浓度为5-30mmol/L。
所述的黄酮类化合物的醇法提取是将培养30d的8个单克隆毛状根洗净，用卫生纸吸干水分，称鲜重后冷冻干燥30h至恒重；研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎20min，过滤，再提取一次，合并滤液，将甲醇提取液浓缩蒸干，用甲醇定容至10ml，－20℃保存，作为供试样品溶液。、
所述的比色法检测包括如下步骤：
（1）黄芩苷吸收峰测定和标准曲线的制作
精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用75％乙醇溶解，配成浓度为1000μg/mL，分别梯度稀释成200、100、80、60、40、20μg/mL；分别加各梯度浓度标准溶液1mL，加75％乙醇至5mL，分别加入0.3mL5％亚硝酸钠，0.3mL10％硝酸铝溶液，然后以75％乙醇定容至10mL，混匀，放置20min，于278nm波长处，用1cm比色杯测其吸光值，黄芩苷含量（μg）为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，得对照品的线性回归方程和标准曲线；
（2）粘毛黄芩中黄酮含量的测定
取提取好的样品溶液，在20mL加入1mL，每一样品进样三次，记录各组吸光值，代入线性回归方程，计算即得。
该方法获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根培养系统。
采用该方法获得粘毛黄芩毛状根的后代。
本发明的有益效果是：
（1）本发明利用镨生物培养基、粘毛黄芩悬浮培养基、黄酮提取和测定技术，建立了高产黄酮的粘毛黄芩毛状根悬浮培养体系及其应用方法，方法具有独创性。
（2）利用化学技术，建立适合粘毛黄芩毛状根生长、黄酮生产的培养基，为稀土镨的改良培养基，可高效生产黄芩黄酮的新型培养体系，相比于1/2MS0对照培养基，黄酮产量增加4.502倍。
（3）本发明方法操作简单，获得黄酮含量高，且培养体系稳定，为黄芩黄酮的生产提供一种新型优质的可持续药源。
附图说明
图1粘毛黄芩毛状根的悬浮培养。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
诱导子的配制与粘毛黄芩毛状根的生化处理
首先配制Pr(NO3)3母液，浓度为1mmol/L，pH值调至为5.5。然后将粘毛黄芩毛状根切成约2-3cm长的节段，转入诱导子生化培养基上，其配方为1/2MS培养基+一定浓度（0、5、10、15、20、25、30mmol/L）的Pr3+（Pr(No3)3、Pr2(SO4)3、或PrCl3），置于25℃±1.0℃恒温悬浮振荡培养，转速110rpm，7天后可见镨能显著促进粘毛黄芩毛状根的生长。
实施例2
诱导子的配制与粘毛黄芩毛状根的生化处理
首先配制Pr(SO4)2母液，浓度为1mmol/L，pH值调至为5.5。然后将粘毛黄芩毛状根切成约2-3cm长的节段，转入诱导子生化培养基上，其配方为1/2MS培养基+一定浓度（0、5、10、15、20、25、30mmol/L）的Pr3+（Pr(No3)3、Pr2(SO4)3、或PrCl3），置于25℃±1.0℃恒温悬浮振荡培养，转速110rpm，7天后可见镨能显著促进粘毛黄芩毛状根的生长。
实施例3
诱导子的配制与粘毛黄芩毛状根的生化处理
首先配制PrCl母液，浓度为1mmol/L，pH值调至为5.5。然后将粘毛黄芩毛状根切成约2-3cm长的节段，转入诱导子生化培养基上，其配方为1/2MS培养基+一定浓度（0、5、10、15、20、25、30mmol/L）的Pr3+（Pr(No3)3、Pr2(SO4)3、或PrCl3），置于25℃±1.0℃恒温悬浮振荡培养，转速110rpm，7天后可见镨能显著促进粘毛黄芩毛状根的生长。
实施例4
黄酮的提取
将培养30d的8个单克隆毛状根洗净，用卫生纸吸干水分，称鲜重后冷冻干燥30h至恒重；研磨成粉，称取100mg干粉加入10mL甲醇超声破碎20min，过滤，再提取一次，合并滤液，将甲醇提取液浓缩蒸干，用甲醇定容至10ml，－20℃保存，作为供试样品溶液。三年生自然根打粉后，称取150mg，提取方法同上。
实施例5
黄酮的测定
1.黄芩苷吸收峰测定和标准曲线的制作
精密称取2mg黄芩苷标准对照品，用75％乙醇溶解，配成浓度为1000μg/mL，分别梯度稀释成200、100、80、60、40、20μg/mL。分别加各梯度浓度标准溶液1mL，加75％乙醇至5mL，分别加入0.3mL5％亚硝酸钠，0.3mL10％硝酸铝溶液，然后以75％乙醇定容至10mL，混匀，放置20min，于278nm波长处，用1cm比色杯测其吸光值，黄芩苷含量（μg）为横坐标，吸光值(A)为纵坐标，得对照品的线性回归方程和标准曲线。
2.粘毛黄芩中黄酮含量的测定
取提取好的样品溶液，在20mL加入1mL，每一样品进样三次，记录各组吸光值，代入线性回归方程，计算即得。
结果显示，5、10、15、20、25、30mmol/LPr3+（Pr(No3)3、Pr2(SO4)3、或PrCl3）能诱导粘毛黄芩黄酮的合成和积累，依次为空白对照组的1.206、2.259、2.712、3.415、4.502和4.088倍，可见25mmol/LPr3+（Pr(No3)3、Pr2(SO4)3、或PrCl3）是提高粘毛黄芩毛状根黄酮产量的最佳浓度。
Claims (1)
1.一种提高粘毛黄芩黄酮化合物含量的方法，其特征在于：采用生化工程技术，用稀土镨诱导粘毛黄芩毛状根，提高黄酮化合物含量，包括如下步骤：
将粘毛黄芩毛状根切成2-3cm长的节段，转入诱导子生化培养基上，其诱导子生化培养基为1/2MS培养基+5-30mmol/L的Pr3+，置于25℃±1.0℃恒温悬浮振荡培养，转速110rpm，7天后可见镨能显著促进粘毛黄芩毛状根的生长，最后进行黄酮类化合物的醇法提取与比色法检测；
所述的Pr3+来自Pr(NO3)3、Pr2(SO4)3或PrCl3溶液中的一种或其组合。
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