CN103290075A - 植物激素脱落酸诱导淡水小球藻快速积累油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物激素脱落酸诱导淡水小球藻快速积累油脂的方法，其特征在于采用如下步骤：（1）制备藻液：在温度22～24℃、光强1800～2000lx、光暗比12h/12h的条件下，培养淡水小球藻到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液，其中淡水小球藻采用9号淡水小球藻或31号淡水小球藻，均源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库；（2）激素诱导：将脱落酸添加到步骤（1）得到的200ml藻液中，直至终浓度为49～51mg/l；（3）获取高油脂含量藻体：将步骤（2）激素诱导后的藻液在温度为22～24℃、光强3800～4000lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。本发明简单易行、成本低廉，目标物油脂含量高，可以作为工业化生物产油原料。

Description

植物激素脱落酸诱导淡水小球藻快速积累油脂的方法

技术领域

本发明提供一种植物激素脱落酸诱导淡水小球藻快速积累油脂的方法，属于生物技术领域。

背景技术

小球藻（Chlorella）是一种球形单细胞淡水藻类，是绿藻小球藻科中的一个重要属，生态分布广泛，在海水和淡水中均有分布，目前包括大约10个种。小球藻细胞内含有丰富的蛋白质、必需氨基酸、多糖、脂类、叶绿素、胡萝卜素和维生素等等，在保健食品、水产养殖、化妆品、医药等领域内应用广泛。小球藻因繁殖快、含油量高等优点成为一种具有应用和开发前景的生物柴油原料。目前来说，掌握一定的促进油脂积累的诱导条件是降低利用小球藻制备生物柴油成本的有效途径之一。与美国、日本、以色列等国家相比，我国的小球藻规模化培养技术水平相对滞后。目前，国内市场上已经公开了一些刺激小球藻快速生长的相关专利技术，如华东理工大学公布了一种适合于普通小球藻高密度高品质培养的培养基组合物（200610024004）和一种高密度高品质培养小球藻的方法（200610025618），清华大学提供了一种高密度培养异养小球藻的方法（200610078003）。也有少量专利涉及利用小球藻生产生物柴油，如清华大学公开了一种利用异养小球藻高密度发酵生产生物柴油的方法（200810100871）、一种从自养到异养两步培养小球藻生产生物柴油的方法（200810112998）和一种小球藻及其培养方法和它在生物柴油生产中的应用（200910083797）。上述涉及小球藻培养和生物柴油生产的专利技术虽然具有一定先进行，但均未涉及诱导或刺激小球藻高产油脂的研究内容，且需要光生物反应器和发酵罐等大型专业设施，对设备要求比较高，技术工艺相对复杂，且费用高，这无疑增加了生产成本和技术推广难度。除了已经公开的专利，还有少量学术文章涉及植物激素对小球藻生长的影响，如植物激素在小球藻异养培养中的作用（植物学报，1999年第6期）；如NAA对小球藻生长及叶绿素和蛋白质含量的影响（盐城工学院学报自然科学版，2006年第2期）；如不同植物激素（IBA、NAA、6-BA、2,4-D、TDA）对原始小球藻生长的影响（广东农业科学2012年第8期）。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、速度快、成本低、无污染、安全性强的植物激素脱落酸诱导淡水小球藻快速积累油脂的方法。其具体的技术方案为：

一种植物激素脱落酸诱导淡水小球藻快速积累油脂的方法，其特征在于采用如下步骤：

（1）制备藻液：在温度22～24℃、光强1800～2000lx、光暗比12h/12h的条件下，培养淡水小球藻到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液，其中淡水小球藻采用9号淡水小球藻或31号淡水小球藻，均源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库；

（2）激素诱导：将脱落酸添加到步骤（1）得到的200ml藻液中，直至终浓度为49～51mg/l；

（3）获取高油脂含量藻体：将步骤（2）激素诱导后的藻液在温度22～24℃、光强3800～4000lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。

本发明与现有技术相比，其优点是：

1、本发明简单易行、成本低、无污染、安全性强。

2、藻体油脂含量增加迅速，可以作为工业化生物产油原料。

具体实施方式

实施例1：

步骤1、制备藻液：在温度22℃、光强1800lx、光暗比12h/12h条件下，培养源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的9号淡水小球藻细胞到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液；

步骤2、激素诱导：将上海源叶生物科技有限公司生产的脱落酸添加到步骤1得到的200ml藻液中，直至终浓度为49mg/l；

步骤3、高油脂含量藻体的获得：将步骤2激素诱导后的藻液在温度22℃、光强3800lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。

测试数据：本发明步骤3最后获得的藻体油脂含量为藻细胞干重的40.91%。为证明本发明的效果，在做实施例1的同时，也设定未加脱落酸的空白对照组。空白对照组除步骤2外，其余处理过程同本发明，最后测得空白对照组的藻体油脂含量为藻细胞干重的22.32%。

实施例2：

步骤1、制备藻液：在温度22℃、光强1800lx、光暗比12h/12h条件下，培养源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的31号淡水小球藻细胞到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液；

步骤2、激素诱导：将上海源叶生物科技有限公司生产的脱落酸添加到步骤1得到的200ml藻液中，直至终浓度为49mg/l；

步骤3、高油脂含量藻体的获得：将步骤2激素诱导后的藻液在温度22℃、光强3800lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。

测试数据：本发明步骤3最后获得的藻体油脂含量为藻细胞干重的25.78%。为证明本发明的效果，在做实施例2的同时，也设定未加脱落酸的空白对照组。空白对照组除步骤2外，其余处理过程同本发明，最后测得空白对照组的藻体油脂含量为藻细胞干重的14.91%。

实施例3：

步骤1、制备藻液：在温度23℃、光强为1900lx、光暗比为12h/12h条件下，培养源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的9号淡水小球藻细胞到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液；

步骤2、激素诱导：将上海源叶生物科技有限公司生产的脱落酸添加到步骤1得到的200ml藻液中，直至终浓度为50mg/l；

步骤3、高油脂含量藻体的获得：将步骤2激素诱导后的藻液在温度为23℃、光强3900lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。

测试数据：本发明步骤3最后获得的藻体油脂含量为藻细胞干重的48.90%。为证明本发明的效果，在做实施例3的同时，也设定未加脱落酸的空白对照组。空白对照组除步骤2外，其余处理过程同本发明，最后测得空白对照组的藻体油脂含量为藻细胞干重的24.75%。

实施例4：

步骤1、制备藻液：在温度23℃、光强为1900lx、光暗比为12h/12h条件下，培养源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的31号淡水小球藻细胞到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液；

步骤2、激素诱导：将上海源叶生物科技有限公司生产的脱落酸添加到步骤1得到的200ml藻液中，直至终浓度为50mg/l；

步骤3、高油脂含量藻体的获得：将步骤2激素诱导后的藻液在温度23℃、光强3900lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。

测试数据：本发明步骤3最后获得的藻体油脂含量为藻细胞干重的44.71%。为证明本发明的效果，在做实施例4的同时，也设定未加脱落酸的空白对照组。空白对照组除步骤2外，其余处理过程同本发明，最后测得空白对照组的藻体油脂含量为藻细胞干重的20.93%。

实施例5：

步骤1、制备藻液：在温度24℃、光强为2000lx、光暗比为12h/12h条件下，培养源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的9号淡水小球藻细胞到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液；

步骤2、激素诱导：将上海源叶生物科技有限公司生产的脱落酸添加到步骤1得到的200ml藻液中，直至终浓度为51mg/l；

步骤3、高油脂含量藻体的获得：将步骤2激素诱导后的藻液在温度为24℃、光强4000lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。

测试数据：本发明步骤3最后获得的藻体油脂含量为藻细胞干重的44.29%。为证明本发明的效果，在做实施例5的同时，也设定未加脱落酸的空白对照组。空白对照组除步骤2外，其余处理过程同本发明，最后测得空白对照组的藻体油脂含量为藻细胞干重的26.36%。

实施例6：

步骤1、制备藻液：在温度24℃、光强为2000lx、光暗比为12h/12h条件下，培养源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的31号淡水小球藻细胞到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液；

步骤2、激素诱导：将上海源叶生物科技有限公司生产的脱落酸添加到步骤1得到的200ml藻液中，直至终浓度为51mg/l；

步骤3、高油脂含量藻体的获得：将步骤2激素诱导后的藻液在温度为24℃、光强4000lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。

测试数据：本发明步骤3最后获得的藻体油脂含量为藻细胞干重的27.61%。为证明本发明的效果，在做实施例6的同时，也设定未加脱落酸的空白对照组。空白对照组除步骤2外，其余处理过程同本发明，最后测得空白对照组的藻体油脂含量为藻细胞干重的17.84%。

上述实施例的油脂含量测试方法具体是：①将待测的小球藻藻液转移至50ml的离心管中，配平后，在低温高速离心机中，于8000rpm下离心10min，弃去上清，应尽量弃除上清；将收集好的藻泥用于油脂含量测定；②将准备好的藻泥置于电热恒温鼓风干燥箱中100℃干燥过夜，分别测量各实验组干燥粉质量M₀，并记录数据。研磨已称量的干燥粉，并加入等体积的氯仿和甲醇（1:2，现配现用）；③在功率40W、周期1min、破壁15s、间隔5s、3个循环的条件下进行超声波破壁，然后将破壁完的藻液分装于两个50mL离心管中，配平后，于低温高速离心机中，10000rmp条件下离心10min；④离心完后，取上清液，按3:1（氯仿：上清液）的比例加入氯仿并涡旋混匀。之后再加入与氯仿等体积的水涡旋混匀，静置待其分层。取下层有机相转入预先称重(M₁)的10ml离心管中，用氮吹仪吹干有机溶剂后称重所得到的数据为M2，氮吹仪水浴温度设定为61℃；⑤总脂含量的计算公式为：总脂含量百分比=（M2-M1)/M0×100%。

实验数据证明，本发明用植物激素脱落酸诱导淡水小球藻，能使其油脂含量快速、显著地提高，可以作为工业化生物产油原料。

Claims (1)

1.一种植物激素脱落酸诱导淡水小球藻快速积累油脂的方法，其特征在于采用如下步骤：

（1）制备藻液：在温度22～24℃、光强1800～2000lx、光暗比12h/12h的条件下，培养淡水小球藻到对数生长期，获得将进行激素诱导的藻液，其中淡水小球藻采用9号淡水小球藻或31号淡水小球藻，均源自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库；

（2）激素诱导：将脱落酸添加到步骤（1）得到的200ml藻液中，直至终浓度为49～51mg/l；

（3）获取高油脂含量藻体：将步骤（2）激素诱导后的藻液在温度22～24℃、光强3800～4000lx、24h持续光照条件下培养18天后，离心收集即得油脂含量高的藻体。