CN104181310A - 一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有：装有分析液的试剂瓶；装有清洗液的试剂瓶；装有增强液的试剂瓶；装有β-hCG校准品的试剂瓶；装有标记的抗α-TSH单克隆抗体的试剂瓶。此外，本发明还公开了该试剂盒的制备方法及其在检测β-hCG含量中的应用。本发明试剂盒的灵敏度高、检测范围广、稳定性好。本发明可利用全自动时间分辨荧光免疫分析仪进行全自动操作，操作简单省时，灵敏度高，可达到0.01mIU/ml；准确性好、且无辐射污染。

Description

一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及体外免疫诊断试剂领域，尤其涉及一种检测尿液中β-hCG的时间分辨免疫荧光试剂盒及其制备方法和应用，实现对尿液中β-hCG含量的定量检测。
背景技术
人绒毛膜促性腺激素(hCG)，是由胎盘绒毛膜的合体滋养层产生的一种糖蛋白，β亚单位是特异性抗原，其结构与其它垂体前叶激素不同。
质量是一家生产型企业的立足之本。许多做hCG测试笔的体外诊断公司，需要利用含一定浓度β-hCG标准品进行测试笔功能性检测，从而确认此批测试笔是否达到标准，能否出售，这是一个关键质量控制点。标准品若不合格，有可能对测试笔的性能进行误判，对企业产生不利的影响。因此有必要发展一种灵敏度高、检测范围广、稳定性好的定量检测试剂盒，用于监测含一定浓度的β-hCG标准品的性能。
目前市售的试剂盒大多以酶联免疫为主，以血清为标本进行定量检测β-hCG含量，灵敏度一般，检测范围偏窄，取样操作复杂、不方便。尿液中β-hCG含量的测定已经是体外快速检测产品的一项重要指标，通过尿液中β-hCG含量的多少，可直接判断出是否怀孕以及怀孕的周数，取样简单、便捷。作为早早孕体外快速检测产品的质控标准品，也是用尿液来配制或者标定的；容易引起疏忽的是：不管是正常男性或妇女的尿液中，本身就存在一定含量(极低水平)的β-hCG抗原。因此定量测定尿液中β-hCG的含量，可为标准品的准确性提供一种定量的保证，也可辅助早期判断妊娠、流产、宫外孕等。
时间分辨免疫荧光分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)，是利用具有独特荧光特性的镧系元素作为标记示踪物，代替酶、同位素等，成为发光免疫分析中的一种重要方法，具有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点。
目前，对于采用时间分辨免疫荧光分析法检测尿液中β-hCG含量尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种检测尿液中β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其灵敏度高、检测范围广、稳定性好，取样方便，快速。
本发明要解决的技术问题之二是提供该试剂盒的制备方法。
本发明要解决的技术问题之三是提供该试剂盒在检测β-hCG含量中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有：
装有分析液的试剂瓶；
装有清洗液的试剂瓶；
装有增强液的试剂瓶；
装有β-hCG校准品的试剂瓶；其中，β-hCG校准品的浓度已知，用于建立标准曲线；
装有标记的抗α-TSH单克隆抗体的试剂瓶。
作为本发明优选的技术方案，所述容器孔内还放置有：装有包被液的试剂瓶、装有封闭保护液的试剂瓶、以及装有洗脱液的试剂瓶。
作为本发明优选的技术方案，所述酶标板为带保护膜的96孔酶标板。
作为本发明优选的技术方案，所述抗β-hCG单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml。
所述标记的抗α-TSH单克隆抗体的标记物可以采用本领域常用的标记物，例如镧系元素。作为本发明优选的技术方案，所述标记的抗α-TSH单克隆抗体的标记物优选是三价铕离子。
作为本发明优选的技术方案，所述标记的抗α-TSH单克隆抗体中抗体与标记物的标记重量比例是(6-10):1。
作为本发明优选的技术方案，所述β-hCG校准品为尿液配制的β-hCG标准品。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)抗β-hCG单克隆抗体包被酶标板的制备：
将抗β-hCG单克隆抗体在包被液中透析，再加入到酶标板上,于2-8℃包被48小时以上；用清洗液清洗酶标板后，加入封闭保护液，室温封闭20小时以上；甩干封闭保护液干燥密封，置于2-8℃冰箱备用；
(2)三价铕标记的抗α-TSH单克隆抗体的制备：
将抗α-TSH单克隆抗体，用标记液进行透析，取透析好的抗α-TSH单克隆抗体，用标记液稀释；将抗体加入到冻干的铕标记液中缓慢摇匀后置于2-8℃冰箱中过夜；用纯化柱纯化2-8℃过夜的标记液，收集标记物，加入0.1％BSA置于-80±10℃冷冻保存备用；
(3)β-hCG校准品的制备：
用β-hCG干粉和阴性尿液配制浓度为0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β-hCG校准尿液，置于-80±10℃冷冻保存备用；
所述清洗液、分析液和增强液为市售商品。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，所述将抗体加入到冻干的铕标记液中，其中抗体与铕标记液的重量比例为(6-10)：1。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，所述用纯化柱纯化2-8℃过夜的标记液，收集标记物具体为：取纯化柱，用洗脱液洗脱平衡至少2小时，将2-8℃过夜的标记液全部转入柱子的顶端，重力自然洗脱，以0.25ml/管为单位进行收集。
在本发明的另一方面，还提供该试剂盒在检测β-hCG含量中的应用，该检测方法包括如下步骤：
(1)将β-hCG校准品和待检样品依次加入到抗β-hCG单克隆抗体包被的酶标板上，再加入分析液，震荡孵育；
(2)将清洗液用去离子水进行稀释，然后用已稀释的清洗液清洗酶标板并甩干；
(3)将纯化好的三价铕标记的抗α-TSH单克隆抗体，用分析液稀释，加入酶标板中，震荡孵育；
(4)用清洗液清洗酶标板并甩干；
(5)加入增强液，使用全自动时间分辨荧光免疫分析仪检测荧光信号；
(6)根据荧光数值建立标准曲线，将待检样品的荧光信号代入到标准曲线中，求得待检样品的浓度。
上述术语说明如下：
本发明所述的“分析液”：Assay Buffer，市售商品，采购自Perkin Elmer，货号：4002-0010。在检测时使用的缓冲液。
本发明所述的“清洗液”：Wash Solution，市售商品，采购自Perkin Elmer，货号：B117-100。用于酶标板清洗的溶液。
本发明所述的“增强液”：Enhancement Solution，市售商品，采购自Perkin Elmer，货号：B118-100。可使标记物从反应复合物上解离下来的溶液。
本发明所述的“包被液”：可自行配制，用于将抗体包被在酶标板上的溶液。
本发明所述的“标记液”：可自行配制，用于将抗原与标记物结合到一起的溶液。
本发明所述的“封闭保护液”：可自行配制，用于将包被在酶标板上的抗体封闭保护在酶标板上的溶液。
本发明所述的“洗脱液”：可自行配制，用于洗脱平衡PD10柱子的溶液。
和现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1 使用本发明能够准确定量检测QC标准品中β-hCG含量，即确认标准品性能，为准确检测hCG测试笔提供保障，增加了企业对hCG测试笔的质量控制，避免了因标准品问题引起的产品质量调查、返工、客户投诉等，节约了企业的人力、物力和时间成本，具有良好的经济效益。
2 使用本发明也能够用于定量检测尿液中β-hCG的含量，对于早期判断妊娠、流产、宫外孕等起到一定帮助，定量检测尿液中β-hCG的含量相比检测血液中的β-hCG的含量，其取样更简便，操作性更强。
3 与现有技术相比，本发明可利用AutoDELFIA1235(全自动时间分辨荧光免疫分析仪)进行全自动操作，操作简单省时，加样量小(50ul/份)；灵敏度高，可达到0.01mIU/ml；准确性好，标准曲线R2值接近1，线性稳定，由标准曲线拟合出的回归方程准确，便于样品浓度计算；无辐射污染；检测样品量大，一次可最多检测953份样品。
4.本发明检测范围广，可检测β-hCG含量范围为0～3500IU/ml。
附图说明
图1是时间免疫荧光试剂盒的原理示意图；
图2是本发明一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒的结构示意图；
图3是本发明的试剂瓶的结构示意图；
图4是本发明的酶标板的结构示意图；
图5是本发明实施例1中的洗脱曲线示意图；
图6是本发明实施例2中荧光数值建立标准曲线示意图。
图中附图标记说明：
1 是装有分析液的试剂瓶，2 是装有清洗液的试剂瓶，3 是装有增强液的试剂瓶，4 是装有包被液的试剂瓶，5 是装有封闭保护液的试剂瓶，6 是装有洗脱液的试剂瓶，7 是装有β-hCG校准品的试剂瓶，8 是装有标记的抗α-TSH单克隆抗体的试剂瓶，9 是酶标板，11 是包被在酶标板上的抗β-hCG单克隆抗体，12 是待测样品中的β-hCG抗原，13 是三价铕离子(Eu3+)标记的抗α-TSH单克隆抗体，14 是双抗体夹心法免疫复合物，15 是含铕的荧光物质，21 是5ml试剂瓶，22 是30ml试剂瓶，91 是加样孔，92 是保护膜。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
如图1所示，本发明的原理是双抗体夹心法，具体包括如下步骤：将抗β-hCG单克隆抗体包被到96孔酶标板上，形成包被在酶标板上的抗β-hCG单克隆抗体11，标记物是三价铕离子(Eu3+)标记的抗α-TSH单克隆抗体3，待测样品中的β-hCG抗原12先与包被在酶标板上的抗β-hCG单克隆抗体1反应(震荡、洗板)，然后与Eu3+标记的抗α-TSH单克隆抗体13反应(震荡、洗板)，形成双抗体夹心法免疫复合物14，加入增强液震荡反应，加入含铕的荧光物质15在荧光检测设备如AutoDELFIA1235上读荧光信号，进行TRFIA检测从而确定标准品中β-hCG的浓度。
如图2所示，本发明的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板9的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有：装有分析液的试剂瓶1；装有清洗液的试剂瓶2；装有增强液的试剂瓶3；装有包被液的试剂瓶4；装有封闭保护液的试剂瓶5；装有洗脱液的试剂瓶6；装有β-hCG校准品的试剂瓶7；装有标记的抗α-TSH单克隆抗体的试剂瓶8。
如图3所示，试剂瓶采用5ml试剂瓶21或30ml试剂瓶22。5ml试剂瓶21是塑料广口瓶(采用聚丙烯材质)。30ml试剂瓶22是塑料离心管(采用聚丙烯材质)。
如图4所示，酶标板9为带保护膜92的96孔酶标板，有96个加样孔91。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
实施例1 试剂盒的制备
上述试剂盒的制备方法如下：
1.200mmol/L pH＝6.8±0.1包被液的配制
将35.08g Na2HPO4·12H2O、5.91g NaH2PO4·2H2O和9g NaCl加入到600ml去离子水中，用1N HCl和1N NaOH调整PH值至6.8±0.1，定容到1L。
2.50mmol/L pH＝6.8封闭保护液的配制
将8.77g Na2HPO4·12H2O和3.98g NaH2PO4·2H2O加入到600ml去离子水中，再依次加入1g BSA(牛血清白蛋白)，60g Trehalose(海藻糖)和1g Diazolidinyl Urea(双咪唑烷基脲)，待完全溶解后调整PH值至6.8±0.1，定容到1L。
3.100mmol/L pH＝9.3Eu3+标记液的配制
将2.12g Na2CO3和6.72g NaHCO3加入到600ml去离子水中，用1N HCl和1N NaOH调整PH值至9.3±0.1，定容到1L。
4.50mmol/L pH＝7.8±0.1洗脱液的配制
将6.057g Tris，9g NaCl和345ml 0.1N HCl加入600ml去离子水中，用1N HCl和1N NaOH调整PH值至7.8±0.1，定容到1L。
5.抗β-hCG单克隆抗体包被酶标板的制备
5.1从冰箱中取出抗β-hCG单克隆抗体(采购自AlereSanDiego，货号：3468，作为包被抗体使用)，用200mmol/L pH＝6.8±0.1的包被液进行透析，将透析好的抗β-hCG单克隆抗体在紫外分光光度计下测定浓度，然后用此包被液将抗体稀释到8μg/ml，混匀备用。
5.2取出96孔酶标板，恢复至室温，每孔加入150μl用包被液稀释好的8μg/ml抗β-hCG单克隆抗体，将96孔酶标板置于2-8℃包被48小时以上。
5.3取出96孔酶标板，将液体甩干，用1:25清洗液清洗3次，甩干，仔细检查孔中不能存有液体。每孔加入200μl 50mmol/L pH＝6.8±0.1的封闭保护液，于室温封闭20小时以上。
5.4取出96孔酶标板，将封闭保护液甩干，放入自封袋中并同时放入适量的干燥剂，2-8℃冰箱干燥备用。
6.抗α-TSH单克隆抗体的三价铕(Eu3+)标记
6.1将抗α-TSH单克隆抗体(采购自AlereSanDiego，货号：3299，作为标记抗体使用)，用100mmol/L pH＝9.3±0.1的标记液进行透析。
6.2取透析好的抗α-TSH单克隆抗体，用标记液稀释至1.2mg/ml。
6.3按照抗体与铕标(6-10)：1的结合比例，将1.2mg/ml抗α-TSH单克隆抗体加入到冻干的Eu-Labelling Reagent(铕标记液)中，缓慢摇匀，置于2-8℃冰箱中过夜，待用。
6.3取PD-10(Sephadex G-50M填料)纯化柱，用50 m mol/L PH＝7.8±0.1的洗脱液洗脱平衡至少2小时。
6.4将2-8℃过夜的标记液(含抗α-TSH单克隆抗体)全部转入柱子的顶端，重力自然洗脱，以0.25ml/管为单位进行收集。收集好后，每管取10μL依次加入到96孔酶标板中，用AutoDELFIA 1235(全自动时间分辨荧光免疫分析仪)进行荧光读数，将所得数据利用Excel(或其它软件)进行描绘曲线。
6.5按照图5的洗脱曲线，收集两个箭头中间的部分用于检测，把两个箭头中间的部分合并后，根据体积估算，加入总体积0.1％的BSA，-80±10℃冷冻保存备用。
7.β-hCG校准品(浓度已知，用于建立标准曲线)
用β-hCG干粉(来源于世界卫生组织WHO)和阴性尿液配制浓度为0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β-hCG校准尿液，-80±10℃冷冻保存备用。
8.分析液(市售商品)Assay Buffer，采购自Perkin Elmer，货号：4002-0010。
9.清洗液(市售商品)Wash Solution，采购自Perkin Elmer，货号：B117-100。
10.增强液(市售商品)Enhancement Solution，采购自Perkin Elmer，货号：B118-100。
实施例2 试剂盒的应用
本发明还提供了试剂盒的应用方法：
1.将浓度为0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β-hCG校准品和待检样品依次加入到抗β-hCG单克隆抗体包被的酶标板上，每个校准品和待检样品重复三孔，每孔加样50μl，再加入150μl分析液，震荡孵育30分钟。
2.将清洗液用去离子水进行25倍稀释，然后用已稀释的清洗液清洗酶标板3次并甩干。
3.将纯化好的三价铕标记的抗α-TSH单克隆抗体，用分析液1:100稀释，200μl/孔加入酶标板中，震荡孵育30分钟。
4.用1:25清洗液清洗酶标板6次并甩干。
5.每孔加入300μl增强液，使用AutoDELFIA 1235检测荧光信号。
6.使用EXCEL或其他软件，根据荧光数值建立标准曲线(见图6)，将待检样品的荧光信号代入到标准曲线中，可求得待检样品的浓度，即检测出β-hCG的含量。

Claims (11)

1.一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括盒体和盒体上方的盒盖，其特征在于，所述盒体内设有放置包被抗β-hCG单克隆抗体的酶标板的隔层；所述盒体内设有放置试剂瓶的容器孔，所述容器孔内放置有：
装有分析液的试剂瓶；
装有清洗液的试剂瓶；
装有增强液的试剂瓶；
装有β-hCG校准品的试剂瓶；
装有标记的抗α-TSH单克隆抗体的试剂瓶。
2.如权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述容器孔内还放置有：装有包被液的试剂瓶、装有封闭保护液的试剂瓶、以及装有洗脱液的试剂瓶。
3.如权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述酶标板为带保护膜的96孔酶标板。
4.根据权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述抗β-hCG单克隆抗体的浓度为1-10μg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述标记的抗α-TSH单克隆抗体的标记物是三价铕离子。
6.根据权利要求1或5所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述标记的抗α-TSH单克隆抗体中抗体与标记物的标记重量比例是(6-10):1。
7.根据权利要求1所述的一种检测β-hCG含量的时间分辨免疫荧光试剂盒，其特征在于，所述β-hCG校准品为尿液配制的β-hCG标准品。
8.一种根据权利要求5所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)抗β-hCG单克隆抗体包被酶标板的制备：
将抗β-hCG单克隆抗体在包被液中透析，再加入到酶标板上,于2-8℃包被48小时以上；用清洗液清洗酶标板后，加入封闭保护液，室温封闭20小时以上；甩干封闭保护液干燥密封，置于2-8℃冰箱备用；
(2)三价铕标记的抗α-TSH单克隆抗体的制备：
将抗α-TSH单克隆抗体，用标记液进行透析，取透析好的抗α-TSH单克隆抗体，用标记液稀释；将抗体加入到冻干的铕标记液中缓慢摇匀后置于2-8℃冰箱中过夜；用纯化柱纯化2-8℃过夜的标记液，收集标记物，加入0.1％BSA置于-80±10℃冷冻保存备用；
(3)β-hCG校准品的制备：
用β-hCG干粉和阴性尿液配制浓度为0、15、25、37.5、50、75和100mIU/ml的β-hCG校准尿液，置于-80±10℃冷冻保存备用；
所述清洗液、分析液和增强液为市售商品。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述将抗体加入到冻干的铕标记液中，其中抗体与铕标记液的重量比例为(6-10)：1。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述用纯化柱纯化2-8℃过夜的标记液，收集标记物具体为：取纯化柱，用洗脱液洗脱平衡至少2小时，将2-8℃过夜的标记液全部转入柱子的顶端，重力自然洗脱，以0.25ml/管为单位进行收集。
11.一种根据权利要求1所述的试剂盒在检测β-hCG含量中的应用，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：
(1)将β-hCG校准品和待检样品依次加入到抗β-hCG单克隆抗体包被的酶标板上，再加入分析液，震荡孵育；
(2)将清洗液用去离子水进行稀释，然后用已稀释的清洗液清洗酶标板并甩干；
(3)将纯化好的三价铕标记的抗α-TSH单克隆抗体，用分析液稀释，加入酶标板中，震荡孵育；
(4)用清洗液清洗酶标板并甩干；
(5)加入增强液，使用全自动时间分辨荧光免疫分析仪检测荧光信号；
(6)根据荧光数值建立标准曲线，将待检样品的荧光信号代入到标准曲线中，求得待检样品的浓度。
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