CN104177479A - 一种多肽及其在制备电压敏感钠通道抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽，其序列如SEQ ID NO.1所示；该多肽可用于抑制电压敏感钠通道，在抑制电压敏感钠通道时，该多肽的浓度为10μM—50μM，优选为10μM；该多肽还可用于制备电压敏感钠通道抑制剂。

Description

一种多肽及其在制备电压敏感钠通道抑制剂中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽及其在制备电压敏感钠通道抑制剂中的应用。
背景技术
电压敏感钠通道是神经细胞动作电位兴起与传递的一个重要组成部分，与人体的运动协调、伤害感知(疼痛)有着密不可分的关系。一些常见的难以治愈的疾病，例如痛风、痛觉过敏、帕金森症、亨廷顿舞蹈症等，都与电压敏感钠通道的不正常开放有关，因此电压敏感钠通道是进行药物开发的靶点之一。不过市面销售的针对于电压敏感钠通道的多肽类药物（抑制剂）均是以天然存在的多肽进行开发与设计的，然而天然多肽从发现到成药却是一个周期很长的过程。因此如何能够不依赖于天然多肽为模版进行电压敏感钠通道抑制剂的筛选，从而增加筛选的可能性与速度，是关系到人类健康的，非常值得研究的重要问题。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种多肽及其在制备电压敏感钠通道抑制剂中的应用。
为了达到上述目的，本发明通过（1）酵母双杂交的手段获取阳性克隆，并自激活验证；（2）生物信息学分析阳性结果，选出候选多肽序列；（3）化学多肽合成候选多肽序列；（4）全细胞膜片钳的手段验证多肽功能后得出一种多肽，其序列如SEQ ID NO.1所示；该多肽可用于抑制电压敏感钠通道，在抑制电压敏感钠通道时，该多肽的浓度为10μM—50μM，优选为10μM；该多肽还可用于制备电压敏感钠通道抑制剂。将该多肽命名为SSCM-1。
SSCM-1的分子量为3102.45，一级化学结构由26个氨基酸残基组成，该多肽的纯品为色白疏松体，无气味，极易溶解于水。该多肽在10μM浓度下，展现出以下特性：能够选择性的基本完全抑制在HEK293细胞上异源表达的电压敏感钠通道亚型hNav1.5电流，但是对rNav1.3、rNav1.4电流没有抑制作用；对大鼠背根神经节细胞（DRG）上的TTX-R电流无抑制作用。因此该多肽是一种对电压敏感通道亚型有着选择性的抑制剂。总之，本发明的多肽是一种与已知多肽无同源性、便于人工多肽合成且抑制专一性强的电压敏感钠通道抑制剂。
附图说明
图1为3条55肽的相似性比对；图中阴影和*号标记部分对应的序列就是SSCM-1氨基酸序列；
图2为HPLC第一轮分离纯化图谱；其中的*表示含SSCM-1的目的峰；
图3为HPLC第二轮分离纯化图谱；其中的*表示含SSCM-1的目的峰；
图4为SSCM-1的质谱鉴定图；
图5为SSCM-1对DRG上表达的TTX-R型电压敏感钠电流抑制作用检测图；
图6为SSCM-1对HEK293细胞上表达的hNav1.5电流抑制作用检测图；
图7为SSCM-1对HEK293细胞上表达的rNav1.3电流抑制作用检测图；
图8为SSCM-1对HEK293细胞上表达的rNav1.4电流抑制作用检测图。
具体实施方式
一、酵母双杂交的手段获取阳性克隆，并自激活验证
采用clontech公司的MATCHMAKER GAL4Two-Hybrid System3系统进行酵母双杂交实验。具体步骤是：1）将含有hNav1.5通道Domain II的S3-S4胞外连接环（hNav1.5-DII-S3-S4）的诱饵质粒（BD）转入酵母菌株AH109，并将其采用PEG/LiAc的方法制备成感受态；2）再取10μg随机多肽文库的质粒DNA转入前一步的感受态；3）最后将感受态细胞涂在生长缺陷性培养基上，30℃培养，直至阳性克隆长出；4）将阳性克隆进行小规模扩大培养，提取质粒，回转入AH109，涂在合适的缺陷性培养基上进行重复实验与自激活验证；5）将没有自激活的阳性质粒送去测序公司测序。
通过以上步骤，我们发现了3个文库质粒能与BD质粒有相互作用，序列如下：
ECLGFGKGCNPSNDQCCKSSNLVAAGSNTVVRMKYKNSTRVGIDTGSIELELQMNRRY（SEQ ID NO.2）；
ECLGFGKGCNPSNDQCCKSSNLVCSRATPVVIMKYKNSTRVGIDTGSIELELQMNRRY（SEQ ID NO.3）；
ECLGFGKGCNPSNDQCCKSSNLVCSRSPHIVCMKYKNSTRVGIDTGSIELELQMNRRY（SEQ ID NO.4）。
二、生物信息学分析阳性结果，选出候选多肽序列
通过分析3个阳性克隆的测序结果，我们发现3个阳性克隆的C末端均含有一段26个氨基酸的高度保守的序列（SEQ ID NO.1，命名为SSCM-1，见图1）。
三、化学多肽合成候选多肽序列
采用Fmoc保护策略在CEM Liberty微波辅助全自动多肽合成仪上合成SSCM-1树脂，微波功率为35W，最高反应温度为75℃。使用Rink Amide NovaPEG树脂，以20%哌啶/DMF溶液作为脱保护剂，肽键形成采用HBTU偶联，反应物按树脂载量4倍摩尔数投料。多肽链构建完成后，得到2g肽树脂。将肽树脂进行裂解，减压除去TFA，沉淀出粗肽。然后将粗肽用HPLC进行两轮的纯化（图2为第一轮纯化图谱，图3为第二轮纯化图谱），MALDI-TOF-MS分析目标产物（见图4），冷冻干燥等步骤，最终得到高纯度的SSCM-1多肽冻干粉。
四、全细胞膜片钳的手段验证多肽功能
将高纯度的SSCM-1多肽冻干粉，用无菌的去离子水溶解成浓度为2mM的储液，分装后-20℃保存。分别在大鼠背根神经节（DRG）细胞与HEK293细胞上检测SSCM-1多肽分子对不同电压敏感通道亚型的电生理特性，具体步骤如下：
1）大鼠背根神经节（DRG）细胞相关实验
挑选出生4周左右，体重在160克附近的SD大鼠，急性分离出其脊椎中的DRG细胞，然后采用标准的培养方式，用10%的胎牛血清在小皿内进行培养，37℃培养3-4小时，可见细胞贴壁。膜片钳实验均在室温（25±1℃）下进行，先将DRG细胞贴壁的小皿中的培养液用配置的钠电流外液替换，然后挑选显微镜视野中清晰可见，贴壁状态良好的DRG进行全细胞膜片钳实验。将单个细胞钳制在-100mV,然后用-10mV刺激出DRG细胞的电压敏感钠电流。测定SSCM-1对于DRG上TTX-R电压敏感钠电流的影响，实验时已经加入了终浓度为200nM的TTX，封闭DRG上的TTX-S型电流。实验结果表明，在加入终浓度为10μM SSCM-1后，对DRG上的TTX-R型电压敏感钠电流并无抑制作用（见图5）。
2）人胚肾细胞（HEK293）相关实验
将复苏的HEK293在标准的培养液中37℃、15%相对湿度、5%CO2的培养箱中培养传代5次后，方能进行转染实验。将含VGSCs通道全长的哺乳动物表达质粒（pCDNA3.1或者pRBG4等）按阳离子性的脂质体法转染方法转入生长旺盛的HEK293细胞内。实验均在室温（25±1℃）下进行，实验时挑选绿色荧光的HEK293细胞作为实验细胞。实验结果表明，在终浓度为10μM下，SSCM-1能够选择性的显著抑制在HEK293细胞上异源表达的电压敏感钠通道亚型hNav1.5电流（见图6），但是对rNav1.3、rNav1.4电流没有抑制作用（见图7和8）。

Claims (5)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述多肽在抑制电压敏感钠通道中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多肽的浓度为10μM—50μM。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多肽的浓度为10μM。
5.如权利要求1所述多肽在制备电压敏感钠通道抑制剂中的应用。
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