CN104173387B - 黑管孔菌的药用用途及治疗肿瘤的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黑管孔菌的药用用途及治疗肿瘤的药物组合物，属于医药领域。本发明药用用途具体为黑管孔菌在制备治疗肿瘤的药物中的应用。采用黑管孔菌的子实体为原料，制备有机溶剂提取物或提取物的萃取部位，进一步制成药用制剂，制备方法简单、可行。发明人通过试验证明黑管孔菌可抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，从而延长肿瘤病患者生存期和生存质量等方面能具有显著的功效。可应用于对多种肿瘤疾病及其症状体征的辅助性治疗、缓解和调节、康复等。

Description

黑管孔菌的药用用途及治疗肿瘤的药物组合物

技术领域

本发明涉及黑管孔菌的药用用途及治疗肿瘤的药物组合物，属于医药领域。

背景技术

黑管孔菌(Bjerkandera adusta(Willd.)P.Karst.)是多孔菌科的真菌，目前尚未见对其化学成分和药理功效的报道。

肿瘤是人体器官组织的细胞，可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，是在外界和/或内在有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特点的新生物。其中癌症是一类恶性肿瘤，从组织学上可以分为两类：一类是由上皮细胞发生恶变的称为癌，如肺上皮细胞发生恶变就形成肺癌，胃上皮细胞发生恶变就形成胃癌等；另一类是由间叶组织发生恶变的称为肉瘤，如平滑肌肉瘤，纤维肉瘤等。临床上癌与肉瘤之比大约为9:1。正常细胞变为癌细胞后，可产生无止境的“异常增生”，大量消耗人体的营养物质，并释放出多种毒素，使人体产生一系列症状和转移，后果极为严重，是导致死亡的一大常见疾病，己成为全球最大的公共卫生问题。

综合中西医理论认为，形成肿瘤的原因主要有遗传因素，各种环境污染，以及如心情抑郁，肝气郁结，感受湿寒，热邪阻塞，痰浊凝积，疏泄失调，气滞血淤，免疫功能下降等内在因素的渐积等。

但在目前可用于肿瘤疾病治疗和/或预防的诸多药物品种中，临床应用效果满意的不多。多数药物或是临床药效有限，或是药效强烈但毒副作用巨大，严重制约了肿瘤疾病的治疗，不能满足临床使用的需要。因此，开发可用于治疗肿瘤疾病，且药效强、毒副作用小的药物，特别是开发以天然原料和/或提取物为成分具有抗肿瘤活性的功能产品，更具有重要的社会意义与经济效益。

发明内容

本发明目的之一是提供黑管孔菌的药用用途，该药用用途为黑管孔菌在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

具体的，发明人通过试验证明黑管孔菌可抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡，从而延长肿瘤病患者生存期和生存质量等方面能具有显著的功效。可应用于对多种肿瘤疾病及其症状体征的辅助性治疗、缓解和调节、康复等。

其中，上述肿瘤是指结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌等。

在具体应用时，既可以采用黑管孔菌的子实体作为药用原料，也可以采用黑管孔菌的子实体提取物作为药用原料。制备黑管孔菌的子实体提取物时，采用有机极性溶剂提取。试验显示，作为有效药物成分以有机极性溶剂提取所得提取物的成分为佳，可以使有效成分更加集中，减少用药量。

作为本发明的优选方案之一：有机溶剂优选采用乙醇提取；

作为本发明的优选方案之一：所述乙醇浓度为50-100％v/v，优选70-95％v/v，结合生产成本和安全性更优选75％v/v。

作为本发明的优选方案之一：采用乙醇提取时，可采用浸渍法、渗漉法、超声提取法，优选超声提取法。

作为本发明的优选方案之一：对于乙醇提取物还可以进行萃取处理，可依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿萃取得到的石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氯仿部位，其中乙酸乙酯部位、正丁醇部位、氯仿部位具有明确的抗癌效果，尤其是对细胞增殖明确的抑制作用，又以乙酸乙酯部位最优。

本发明另一目是提供一种治疗肿瘤的药物组合物，它是以黑管孔菌为原料，按常规方法制备而成的制剂。

作为本发明的优选方案之一：本发明药物组合物以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，再按照常规方法制备而成的制剂；其中，所用乙醇浓度为50-100％v/v，优选70-95％v/v，更优选75％v/v。

作为本发明的优选方案之一：本发明药物组合物以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，采用乙酸乙酯萃取得黑管孔菌乙酸乙酯萃取部位，再按照常规方法制备而成的制剂；其中，所用乙醇浓度为50-100％v/v，优选70-95％v/v，更优选75％v/v。

作为本发明的优选方案之一：本发明药物组合物以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，采用正丁醇萃取得黑管孔菌石油醚萃取部位，再按照常规方法制备而成的制剂；其中，所用乙醇浓度为50-100％v/v，优选70-95％v/v，更优选75％v/v。

作为本发明的优选方案之一：本发明药物组合物以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，采用氯仿萃取得黑管孔菌石油醚萃取部位，再按照常规方法制备而成的制剂；其中，所用乙醇浓度为50-100％v/v，优选70-95％v/v，更优选75％v/v。

本发明药物组合物所述的制剂可以采用口服制剂或注射制剂两种常用剂型。

例如与口服药物制剂中常规使用的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料成分混合，可以制备成为适合于临床使用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等口服型药物制剂或注射型药物制剂。尤其是，将黑管孔菌的提取物成分与相应注射药物制剂中允许使用的适当溶剂和/或附加剂等配合并经相应的工艺过程处理后，可以制备成相应的肌肉和/或静脉注射制剂，特别是适宜在肿瘤治疗中使用的靶向型注射制剂等。

作为本发明的优选方案之一：注射制剂可采用靶向型注射制剂。

本发明的有益效果：

1、本发明提供了黑管孔菌全新的药用用途，对于抗肿瘤有明确、显著的效果。

2、采用黑管孔菌的子实体为原料，制备有机溶剂提取物或提取物的萃取部位，进一步制成药用制剂，制备方法简单、可行。

3、黑管孔菌及其药用制剂可用于多种肿瘤疾病及其症状体征的辅助性治疗、缓解和调节、康复。

以下通过由所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

具体实施方式

下述的药效学试验用以表明作为本发明黑管孔菌子实体提取物及其乙酸乙酯萃取部位在抗肿瘤功能方面所具有的显著药效。其中，试验所用各剂量组的黑管孔菌乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取部位，均由黑管孔菌子实体按常规方法得到的。

以下试验一至四考察水及乙醇提取物的抗癌效果。

下述试验中子实体提取物的制备方法如下：

黑管孔菌子实体提取物的制备：将黑管孔菌子实体分别采用下述溶剂及方法提取：

1)采用水提取：将黑管孔菌子实体100g以2L蒸馏水分三次超声提取，每次1h，收集提取液，减压蒸干，即得水提取物。

2)采用95％乙醇提取：将黑管孔菌子实体100g以2L 95％乙醇分三次超声提取，每次1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。

试验一、黑管孔菌水提取物与95％乙醇提取物对人结肠癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HCT 116细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(空白组OD_570-样品组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

实验结果如表1，黑管孔菌95％乙醇提取物对HCT116细胞增殖有强烈的抑制作用，其IC₅₀为31.58μg/mL，而黑管孔菌水提取物对HCT116细胞增殖抑制效果不明显，浓度为100μg/mL时，其抑制率仅为31.50％。

表1 黑管孔菌水提取物和95％乙醇提取物对HCT116细胞增殖的影响

试验二、黑管孔菌水提取物与95％乙醇提取物对人宫颈癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HeLa细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵化过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(空白组OD_570-样品组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

实验结果如表2，黑管孔菌95％乙醇提取物对HeLa细胞增殖有强烈的抑制作用，其IC₅₀为38.56μg/mL，而黑管孔菌水提取物对HeLa细胞增殖抑制效果不明显，浓度为100μg/mL时，其抑制率仅为30.11％。

试验三、黑管孔菌水提取物与95％乙醇提取物对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

实验前一天，小鼠腋下接种S180肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁶个细胞。接种后24h，小鼠按体重随机分为8组，每组10只动物。水提取物、乙醇提取物分别设置小、中、大三个剂量组，剂量分别为10g生药/kg、20g生药/kg、30g生药/kg，灌胃给药；环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺。接种24h后，按实验设计剂量给药，连续10天。给药结束后，小鼠脱颈处死，解剖腋下瘤体称重。

结果表明，黑管孔菌95％乙醇提取物的中剂量能显著降低S180荷瘤小鼠瘤重，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),黑管孔菌95％乙醇提取物的中剂量能极显著降低S180荷瘤小鼠瘤重，与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)。黑管孔菌水提物的大、中、小剂量组与对照组相比均未呈现显著性差异。具体结果见表3。

表3 黑管孔菌水提取物与95％乙醇提取物对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

试验四、黑管孔菌水提取物与95％乙醇提取物对EAC荷瘤小鼠的生存期和生存质量的影响

实验前一天，小鼠腹腔接种EAC肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁷个细胞。接种后，小鼠按体重随机分为8组，每组10只动物。水提取物、95％乙醇提取物分别设置小、中、大三个剂量组，剂量分别为10g生药/kg、20g生药/kg、30g生药/kg，灌胃给药；环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺。接种24h后，按实验设计剂量给药，直至动物死亡，同时每日记录动物生存状态。

结果表明，黑管孔菌95％乙醇提取物可剂量依赖性地延长EAC荷瘤小鼠生存期，提高其生存质量，其中小剂量组与对照相比具有显著性差异(P<0.05)，中、大剂量组与对照相比具有极显著性差异(P<0.01)；而水提取物对EAC荷瘤小鼠生存期和生存质量影响不显著。具体结果见表4。

表4 黑管孔菌水提取物与95％乙醇提取物对EAC荷瘤小鼠生存期的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

由试验一至二的体外试验结果表明，黑管孔菌95％乙醇提取物可显著抑制HCT116和HeLa细胞的增殖，由试验三至四的在体试验结果表明，黑管孔菌95％乙醇提取物可抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长，延长EAC荷瘤小鼠生存期，改善其生存质量。因此可以认为，黑管孔菌95％乙醇提取物具有显著的抗肿瘤作用。

根据上述试验结论，进一步在以下试验五至八考察不同浓度乙醇提取物的抗癌效果。

下述试验中子实体提取物的制备方法如下：

黑管孔菌子实体提取物的制备：将黑管孔菌子实体分别采用下述溶剂及方法提取：

1)采用30％乙醇提取：将黑管孔菌子实体100g以2L 30％乙醇分三次超声提取，每次1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。

2)采用50％乙醇提取：将黑管孔菌子实体100g以2L 50％乙醇分三次超声提取，每次1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。

3)采用75％乙醇提取：将黑管孔菌子实体100g以2L 75％乙醇分三次超声提取，每次1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。

4)采用95％乙醇提取：将黑管孔菌子实体100g以2L 95％乙醇分三次超声提取，每次1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。

试验五、黑管孔菌不同浓度乙醇提取物对人结肠癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HCT 116细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(样品组OD_570-空白组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

结果表明，黑管孔菌不同乙醇浓度提取物对HCT116细胞增殖活性差异较大，肿瘤细胞增殖抑制活性与溶剂的乙醇浓度呈正相关。75％乙醇提取物活性与95％乙醇提取物活性相差不大，综合生产成本和安全性考虑，可优选75％乙醇作为提取溶剂。

表5 黑管孔菌不同浓度乙醇提取物对人结肠癌细胞体外增殖的影响

试验六、黑管孔菌不同浓度乙醇提取物对人宫颈癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HeLa细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(空白组OD_570-样品组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

结果表明，黑管孔菌不同乙醇浓度提取物对HeLa细胞增殖活性差异较大，肿瘤细胞增殖抑制活性与溶剂的乙醇浓度呈正相关。75％乙醇提取物活性与95％乙醇提取物活性相差不大，综合生产成本和安全性考虑，可优选75％乙醇作为提取溶剂。

试验七、黑管孔菌不同浓度乙醇提取物对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

实验前一天，小鼠腋下接种S180肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁶个细胞。接种后24h，小鼠按体重随机分为6组，每组10只动物。30％、50％、75％、95％乙醇提取物分别按30g生药/kg剂量，灌胃给药，环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺，连续10天。给药结束后，小鼠脱颈处死，解剖腋下瘤体称重。

结果表明，黑管孔菌95％乙醇提取物和75％乙醇提取物30g生药/kg剂量下，在能显著降低S180荷瘤小鼠瘤重，与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，50％乙醇提取物和30％乙醇提取物组与对照组相比没有显著差异。因此，综合生产成本和安全性考虑，可优选75％乙醇作为提取溶剂。

表7 黑管孔菌不同浓度乙醇提取物对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

试验八、黑管孔菌不同浓度乙醇提取物对对EAC荷瘤小鼠生存期和生存质量的影响

实验前一天，小鼠腹腔接种EAC肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁷个细胞。接种后，小鼠按体重随机分为6组，每组10只动物。30％、50％、75％、95％乙醇提取物分别按30g生药/kg剂量，灌胃给药，环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺。接种24h后，按实验设计剂量给药，直至动物死亡，同时每日记录动物生存状态。

结果表明，黑管孔菌95％乙醇提取物和75％乙醇提取物30g生药/kg剂量下能够延长EAC荷瘤小鼠生存期，提高其生存质量，与对照相比具有显著性差异(P<0.05)，50％乙醇提取物和30％乙醇提取物组与对照组相比没有显著差异。因此，综合生产成本和安全性考虑，可优选75％乙醇作为提取溶剂。

表8 黑管孔菌不同浓度乙醇提取物对对EAC荷瘤小鼠生存期的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

由试验五至八的结论可知：通过比较黑管孔菌不同浓度乙醇提取物的体内、体外抗肿瘤作用可以确定，75％和95％乙醇提取均可获得具有显著抗肿瘤活性的提取物，同时综合考虑生产成本和安全性，可以确定优选乙醇浓度为75％。

根据上述试验结论，进一步在以下试验九至十二考察乙醇提取物不同萃取部位的抗癌效果。

下述试验中子实体提取物及萃取部位的制备方法如下：

黑管孔菌子实体提取物的制备：

采用75％乙醇提取：将黑管孔菌子实体100g以2L 75％乙醇分三次超声提取，每次1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。

黑管孔菌子实体乙醇提取物不同溶剂部位的制备

将75％乙醇提取物用适量的蒸馏水混悬，分别依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，收集萃取液和剩余的水相，减压蒸干，得黑管孔菌乙醇提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位。试验九、黑管孔菌乙醇提取物不同萃取部位对人结肠癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HCT 116细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(空白组OD_570-样品组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

实验结果如表9，黑管孔菌乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位对HCT116细胞增殖有强烈的抑制作用，其IC₅₀为23.98μg/mL，石油醚萃取部位对HCT116细胞增殖具有一定的抑制作用，但作用强度小于乙酸乙酯萃取部位。

试验十、黑管孔菌乙醇提取物不同萃取部位对人宫颈癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HeLa细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵化过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(空白组OD_570-样品组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

实验结果如表10，黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对Hela细胞增殖有强烈抑制作用，其IC₅₀为22.64μg/mL，石油醚萃取部位对Hela细胞增殖具有一定的抑制作用，但作用强度小于乙酸乙酯萃取部位。

试验十一、黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

实验前一天，小鼠腋下接种S180肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁶个细胞。接种后，小鼠按体重随机分为5组，每组10只动物。乙醇提取物乙酸乙酯部位给药剂量分组为：小剂量组(10mg/kg)，中剂量组(20mg/kg)，大剂量组(30mg/kg)，腹腔注射给药；环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺。接种24h后，按实验设计剂量给药，连续10天。给药结束后，小鼠脱颈处死，解剖腋下瘤体称重。

结果表明，黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯部位的中、大剂量都能有效抑制S180细胞的增殖，其中与对照组相比，中剂量组具有显著性差异(P<0.05)，大剂量组具有极显著性差异(P<0.01)。

表11 黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

试验十二、黑管孔菌提取物乙酸乙酯萃取部位对EAC荷瘤小鼠的生存期和生存质量的影响

实验前一天，小鼠腹腔接种EAC肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁷个细胞。接种后，小鼠按体重随机分为5组，每组10只动物。乙醇提取物乙酸乙酯部位给药剂量分组为：小剂量组(10mg/kg)，中剂量组(20mg/kg)，大剂量组(30mg/kg)，腹腔注射给药；环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺。接种24h后，按实验设计剂量给药，直至动物死亡，同时每日记录动物生存状态。

结果表明，黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯部位的小、中、大剂量都能有效延长生存期，其中与对照组相比，小剂量组具有显著性差异(P<0.05)，中、大剂量组具有极显著性差异(P<0.01)。给药组动物生存状态明显优于对照组。

表12 黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对EAC荷瘤小鼠生存期的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

根据上述试验结果，进一步在以下试验十三至十六考察乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位的抗癌效果。

下述试验中子实体提取物集萃取部位的制备方法如下：

黑管孔菌子实体提取物的制备

1)采用75％乙醇提取：将黑管孔菌子实体100g以2L 75％乙醇分三次超声提取，每次1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。

黑管孔菌子实体乙醇提取物不同溶剂部位的制备

将乙醇提取物用适量的蒸馏水混悬，以正丁醇萃取，收集萃取液，减压蒸干，得黑管孔菌乙醇提取物的正丁醇部位。

将乙醇提取物用适量的蒸馏水混悬，以氯仿萃取，收集萃取液，减压蒸干，得黑管孔菌乙醇提取物的氯仿部位。

试验十三、黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对人结肠癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HCT 116细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(空白组OD_570-样品组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

实验结果如表13，黑管孔菌醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对HCT116细胞增殖均有强烈的抑制作用，其IC₅₀分别为20.91μg/mL和20.13μg/mL。

表13 黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对HCT116细胞增殖的影响

试验十四、黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对人宫颈癌细胞体外增殖的影响

取对数期的HeLa细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀，其中：抑制率(％)＝(空白组OD_570-样品组OD₅₇₀)*100/空白组OD₅₇₀

实验结果如表14，黑管孔菌醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对HeLa细胞增殖有强烈的抑制作用，其IC₅₀分别为20.13μg/mL和20.85μg/mL。

表14 黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对HeLa细胞增殖的影响

试验十五、黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

实验前一天，小鼠腋下接种S180肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁶个细胞。接种后，小鼠按体重随机分为4组，每组10只动物。黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位分别按30mg/kg剂量腹腔注射给药；环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺。接种24h后，按实验设计剂量给药，连续10天。给药结束后，小鼠脱颈处死，解剖腋下瘤体称重。

结果表明，黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位都能有效抑制S180细胞的增殖，其中与对照组相比，具有极显著差异(P<0.01)。

表15 黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对S180荷瘤小鼠瘤重的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

试验十六、黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对EAC荷瘤小鼠的生存期和生存质量的影响

实验前一天，小鼠腹腔接种EAC肿瘤细胞，每只小鼠接种2×10⁷个细胞。接种后，小鼠按体重随机分为4组，每组10只动物。黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位分别按30mg/kg剂量腹腔注射给药；环磷酰胺组按20mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺。接种24h后，按实验设计剂量给药，直至动物死亡，同时每日记录动物生存状态。

结果表明，黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位都能有效延长EAC荷瘤小鼠生存期，与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01)。给药组动物生存状态明显优于对照组。

表16 黑管孔菌乙醇提取物正丁醇、氯仿萃取部位对EAC荷瘤小鼠生存期的影响(x±s)

注：与对照组相比：^*表示P<0.05，^**表示P<0.01

试验十三至十六的结果表明，黑管孔菌75％乙醇提取物的正丁醇萃取部位和氯仿萃取部位均能显著抑制HCT116和HeLa细胞的增殖，可抑制S180荷瘤小鼠肿瘤的生长，延长EAC荷瘤小鼠生存期，改善其生存质量，说明采用正丁醇、氯仿作为萃取溶剂与以乙酸乙酯为萃取溶剂具有相似的作用。

根据试验九至十二的结果，进一步考察黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对其他类型肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用，以期初步评价对其敏感的肿瘤类型。

试验十七、黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对不同肿瘤细胞株体外增殖的影响

采用人卵巢癌细胞株SK-OV-3、人乳腺癌细胞株MCF7、人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞株MGC80-3、人非小细胞肺癌细胞株A549、人食管癌细胞株Eca-109、人前列腺癌细胞株PC-3，评价黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对不同肿瘤细胞株体外增殖的影响。

取对数期的肿瘤细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×10³个/孔接种到96孔板，在37℃培养过夜。往药物处理组中加入梯度稀释的样品。同时设置空白对照组，每个浓度做3个重复。放入37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。实验结束前4h，将96孔板里的培养液吸出，加入100μL PBS缓冲液和10μL 5mg/mL MTT溶液，37℃孵育4h。加100μL 10％SDS溶液。37℃孵育过夜。测定OD₅₇₀。计算抑制率和IC₅₀。

实验结果如表17，黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞株均有强烈增殖抑制作用，IC₅₀在6.99-21.31μg/mL之间。

表17 黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对不同肿瘤细胞株体外增殖抑制IC₅₀

根据试验十七的试验结果，可以确定黑管孔菌乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位对结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、食管癌、前列腺癌9中肿瘤细胞株均有显著抑制增殖作用，提示其可在以上肿瘤类型的临床上应用。

试验十八、毒性观察：

1.急性毒性实验：以吐温-20作为助溶剂，将乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位(参照试验十七配制)配置成最大腹腔注射给药浓度，以300mg/kg剂量腹腔注射小鼠，未见小鼠异常反应及死亡。连续观察14d，未见小鼠异常或死亡，体重增长与对照组无显著差异。

2.以乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位进行了大鼠致畸试验、Ames试验、小鼠骨髓微核试验和染色体畸变试验，证明该药无致畸和致突作用。

以下为本发明制备实施例

实施例1 黑管孔菌子实体乙醇提取物的制备

将黑管孔菌子实体1000g加入20L75％乙醇中，分三次超声1h，收集提取液，低温(40℃～60℃)减压蒸干，即得乙醇提取物。可供后续的口服型或注射型制剂中使用。

实施例2 黑管孔菌子实体乙醇提取物不同溶剂部位的制备

将乙醇提取物成分，用适量的蒸馏水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，收集萃取液和最后的水相，减压蒸干，得黑管孔菌乙醇提取物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和水部位，可供后续的口服型或注射型制剂中使用。

实施例3 口服片剂的制备

原料：上述制备的黑管孔菌子实体乙醇提取物(或是其乙酸乙酯萃取部位)50g，淀粉60g，乳糖30g，硬脂酸镁10g。

将各原料成分混匀，常规方式制粒后，加硬脂酸镁整粒，压片，共制成1000片。每片含主药50mg。

实施例4 胶囊剂的制备

原料：上述制备的黑管孔菌子实体乙醇提取物(或是乙酸乙酯萃取部位)50g，淀粉60g，乳糖30g，硬脂酸镁10g。

将各原料成分混匀，常规方式制粒后，加硬脂酸镁整粒后，装胶囊，共制成1000片。每片含主药50mg。

实施例5 注射用粉针剂的制备

原料：黑管孔菌子实体乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位5g，吐温-400.4g，甘露醇28g，对羟基苯甲酸乙酯0.04g，注射用水1000mL。

将符合制剂标准的黑管孔菌子实体乙醇提取物的乙酸乙酯萃取与处方量的辅料混合均匀，冷冻干燥，分装(小瓶及胶塞于分装前灭菌处理)，补充灭菌，包装得到黑管孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位注射用粉针剂。共制成1000支，每支含主药5mg。

实施例6 注射用肝靶向(或其他器官靶向)粉针剂的制备

原料：黑管孔菌子实体乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位5g，吐温-400.4g，脂质体(或其他靶向辅料)140g，对羟基苯甲酸乙酯0.04g，注射用水1000mL。

将符合制剂标准的黑管孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位与处方量的辅料混合均匀，冷冻干燥，分装(小瓶及胶塞于分装前灭菌处理)，补充灭菌，包装得到黑管孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位肝靶向(或其他器官靶向)注射用粉针剂。共制成1000支，每支含主药5mg。

实施例7 注射用输液剂的制备

原料：黑管孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位5g，吐温-400.4g，苯甲醇200g，甘氨酸300g，注射用水20Kg。

将符合制剂标准的黑管孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位溶解在配液中，添加处方量的辅料混合均匀，滤过，罐封，灭菌，包装得到黑管孔菌子实体乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位输液剂。制成100mL/瓶。

Claims (12)

1.黑管孔菌在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于：黑管孔菌子实体采用乙醇浓度为70-95％v/v的乙醇提取所得提取物；所述肿瘤是指结肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、肺癌、食管癌或前列腺癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗肿瘤是指抑制肿瘤细胞生长或促进肿瘤细胞凋亡。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述乙醇浓度为75％v/v。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：采用乙醇提取时，采用浸渍法、渗漉法、超声提取法。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述采用乙醇提取时采用超声提取法。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：黑管孔菌子实体采用乙醇提取所得的乙醇提取物，采用乙酸乙酯萃取，得黑管孔菌乙酸乙酯萃取部位；或采用石油醚萃取，得黑管孔菌石油醚萃取部位。

7.治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：它是以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，再按照常规方法制备而成的制剂；所用乙醇浓度为70-95％v/v。

8.根据权利要求7所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述乙醇浓度为75％v/v。

9.治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：它是以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，采用乙酸乙酯萃取得黑管孔菌乙酸乙酯萃取部位，再按照常规方法制备而成的制剂；或

以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，采用石油醚萃取得黑管孔菌石油醚萃取部位，再按照常规方法制备而成的制剂；或

以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，采用正丁醇萃取得黑管孔菌石油醚萃取部位，再按照常规方法制备而成的制剂；或

以黑管孔菌为原料，以乙醇提取得到乙醇提取物，采用氯仿萃取得黑管孔菌石油醚萃取部位，再按照常规方法制备而成的制剂；

其中，所用乙醇浓度为70-95％v/v。

10.根据权利要求9所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述乙醇浓度为75％v/v。

11.根据权利要求7-10任一项所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述制剂为口服制剂或注射制剂。

12.根据权利要求11所述的治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于：所述注射制剂为靶向型注射制剂。