CN104173360A - 一种抗血栓形成药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抗血栓形成活性确切的螺甾烷型薯蓣皂苷类成分的药物组合物及其制备方法,在制备工艺中采用生物酶转化的方法,将药材中的呋甾烷型皂苷转化为螺甾烷型皂苷,提高了药效成分的收率和纯度,简化了后续的纯化步骤,反应条件温和,收率高,产物稳定,适合工业化生产,可用于制备抗血栓形成药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种新的抗血栓形成药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术
血小板聚集和血栓形成是缺血性心脑损伤的重要原因,抗血栓治疗有助于减少心脑血管不良事件的发生。大量药理研究发现,甾体皂苷类成分具有抗血小板聚集,降低血脂,增加冠脉血流量等多种心脑血管活性。
薯蓣科植物中含有丰富的甾体皂苷类成分,至今已从中分离得到30多种甾体皂苷元,根据母核结构中F环结构的不同,分为呋甾烷型和螺甾烷型两大类结构。薯蓣科植物中常作为药用原料来源的穿龙薯蓣、黄山药等药材所含甾体皂苷类成分均以呋甾烷型结构为主,一般是在药材贮存或提取加工过程中部分呋甾烷型皂苷转化为螺甾烷型。目前市售的黄山药或薯蓣总皂苷提取物制剂中主要成分是呋甾烷型甾体皂苷[李克明,陈玉武,张永文.地奥心血康中薯蓣皂苷及伪原薯蓣皂苷的分离与鉴定,中国药房,2007,18(30),2339-2341]。发明专利CN1754541A、CN101035548A公开了一种来源于黄山药、穿龙薯蓣的甾体皂苷药物组合物,其组成也是以呋甾烷型皂苷为主。
我们对穿龙薯蓣中主要皂苷类成分进行分离,以在体动物血栓形成模型评价了不同结构类型成分抗血栓形成活性的差异,发现螺甾烷型甾体皂苷有明显的抗血栓的形成作用,强度与对照药阿司匹林相当,而呋甾烷类成分未显示相关活性。相应地,以螺甾烷型皂苷为主的提取组分抗血栓活性明显强于主含呋甾烷型皂苷的原生皂苷提取组分。说明大量无效成分的存在是造成现有甾体总皂苷提取物制剂临床低效的主要原因。
目前制备甾体总皂苷通常采用药材提取液经大孔吸附树脂纯化的方法。由于呋甾烷型皂苷水溶性好,与极性相近杂质分离困难,工艺路线复杂,生产可行性差,而且产品中主要成分为呋甾烷型皂苷,活性成分含量低而且不稳定。
发明内容
本发明提供一种抗血栓形成活性确切的螺甾烷型薯蓣皂苷类成分的药物组合物及其制备方法,其优势在于制备工艺中采用生物酶转化的方法,在提取过程中将药材所含呋甾烷型甾体皂苷转化为活性螺甾烷型皂苷,进而利用螺甾烷型皂苷的溶解惰性简化了分离纯化工艺,大幅提高了药效成分的收率和纯度,降低了生产成本。与现有市售品种不同,本方法制备的甾体皂苷提取组分主要含活性的螺甾烷型皂苷,有望提高临床疗效。
本发明提供一种具有抗血栓形成活性的药物组合物,其中薯蓣皂苷和纤细皂苷总重量百分比为50—99%,优选为85—99%,两个成分重量比为1:10-30:1(W:W),优选为1:1-10:1(W:W)。
本发明的另一个目的是提供上述药物组合物的制备方法,所述制备方法包括下述步骤:
a.配制水解酶水溶液,将穿龙薯蓣药材浸润,在30-45℃下放置24-72hr;所述水解酶选自植物提取用酶、纤维素酶、淀粉酶、糖化酶、β-葡萄糖苷酶中的一种或数种酶的混合物,所述水解酶水溶液中酶的浓度为0.5-10%(g/100ml);
b.浸润后的药材以含水低级醇加热回流提取,提取液浓缩至无醇,加入适量水稀释,放置,待析出沉淀,滤得沉淀,以水洗涤,干燥,得类白色粉末。所述含水低级醇中低级醇的浓度为50-95%(V/V);所述低级醇选自碳数为1-3的一元醇;
c.以低级醇或含水低级醇对所得类白色粉末进行重结晶,得终产物,所述低级醇选自碳数为1-5的一元醇。
上述制备工艺步骤a中,所述用于水解的酶优选纤维素酶、β-葡萄糖苷酶,或这两种酶分别与植物提取用酶组成的混合酶。
上述制备工艺步骤b中,所述提取用含水低级醇,其中低级醇选自甲醇、乙醇,优选乙醇。
上述制备工艺步骤c中,所述重结晶用低级醇选自甲醇、乙醇,含水低级醇中低级醇浓度为70-95%(V/V)。
本发明提供的抗血栓形成药物组合物制备工艺采用生物酶水解法,采用浸润的方法,将药材中的呋甾烷型皂苷转化为螺甾烷型皂苷,简化了后续的纯化步骤,反应条件温和、收率高,产物稳定,制备过程无需使用毒害有机溶剂或强酸碱性试剂而环保,具有很强的工业生产可实施性。
本发明同时提供所述药物组合物在抗血栓形成药物制备中的应用。
穿龙薯蓣甾体皂苷类成分以及提取组分抗血栓形成作用:
1.材料:
1.1试剂:
肝素钠:天津市化学试剂批发部经销,批号:891125。
氯化钠:天津市塘沽化学试剂厂产品。
羧甲基纤维素钠:天津市福晨化学试剂厂产品,批号:20050407。
吐温80:天津市精细化学品有限公司产品,批号:920311。
1.2药物
薯蓣皂苷类化合物以及提取组分由TY606课题组提供。
阿司匹林:为组内留样。配制方法为300mg+10d吐温+1%CMCNa至30ml。
1.3动物
Wistar大鼠,雄性,体重240~300g,由本院动物室繁殖饲养。
1.4仪器
BS124S型电子天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司产品。
HZS-D水浴震荡器:哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品。
2.方法:
将250~300g大鼠麻醉(戊巴比妥钠,54mg/kg,ip)仰卧位固定,分离右颈总动脉和左颈外静脉。在聚四氟乙烯管的中段放入一根长6cm的丝线。以肝素生理盐水溶液(50u/ml)充满聚四氟乙烯管。当聚四氟乙烯管的一端插入左颈外静脉后,由聚四氟乙烯管准确地注入50u/kg的肝素抗凝,然后再将聚四氟乙烯管的另一端插入右颈总动脉。打开动脉夹,血液从右颈总动脉流至聚四氟乙烯管内,返回左颈外静脉。开放血流15min后中断血流,迅速取出丝线称重,总重量减去丝线重量即得血栓湿重。
将受试样品每3个分为一组,每个受试样品做3只动物的试验,每日做一个模型和一个阳性药阿司匹林。
给药方式:口服给药100mg/kg,连续给药3次,末次给药后1小时进行试验。
表1.薯蓣皂苷类成分对大鼠动静脉旁路血栓形成模型的抗血栓形成作用
结论:螺甾烷型皂苷以及含有这类成分的提取组分具有抗血栓形成活性,强度与对照药阿司匹林相当。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明,但不以此作为对本发明的限制。
实施例1
取240g植物提取用酶加入3L水配制成含酶水溶液,将800g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在35℃下恒温酶解48hr,加90%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以95%甲醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量92%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为5:1。
实施例2
取50g淀粉酶加入2L水配制成含酶水溶液,将500g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在30℃下恒温酶解24hr,加70%甲醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以80%异丙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量86%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为2:1。
实施例3
取15g淀粉酶和25g糖化酶加入4L水配制成含酶水溶液,将1000g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在45℃下恒温酶解48hr,加50%甲醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以正丁醇重结晶,所得沉淀继续以甲醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量95%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为8:1。
实施例4
取70g植物提取用酶和40gβ-葡萄糖苷酶加入2L水配制成含酶水溶液,将500g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在37℃下酶解24hr。加95%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以70%乙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量85%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为3:1。
实施例5
取150gβ-葡萄糖苷酶和250g淀粉酶加入8L水配制成含酶水溶液,将2000g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在30℃下酶解48hr。加70%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以95%乙醇两次重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量98%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为9:1。
实施例6
取5g纤维素酶加入1L水配制成含酶水溶液,将250g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在40℃下酶解72hr。加80%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。以90%乙醇对沉淀重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量90%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为7:1。
实施例7
取25g纤维素酶和55gβ-葡萄糖苷酶加入4L水配制成含酶水溶液,将1000g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在37℃下酶解72hr。加60%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以无水乙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量85%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为5.5:1。
实施例8
取60g糖化酶和80g纤维素酶加入2L水配制成含酶水溶液,将500g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在45℃下酶解48hr。加80%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以丁醇重结晶,所得沉淀继续以90%甲醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量96%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为1:1。
实施例9
取180gβ-葡萄糖苷酶加入6L水配制成含酶水溶液,将1500g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在37℃下酶解72hr。加70%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以80%乙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量89%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为4.5:1。
实施例10
取40g植物提取用酶和50g纤维素酶加入3L水配制成含酶水溶液,将800g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在40℃下酶解48hr。加50%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以95%乙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量91%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为2.5:1。
实施例11
取20g纤维素酶和25g糖化酶加入4L水配制成含酶水溶液,将1000g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在30℃下恒温酶解24hr,加50%甲醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以正丁醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量50%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为30:1。
实施例12
取80g植物提取用酶,60g淀粉酶和60g糖化酶加入2L水配制成含酶水溶液,将500g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在30℃下酶解24hr。加70%异丙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以80%乙醇重结晶,所得沉淀继续以异丙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量99%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为8:1。
实施例13
取80g淀粉酶,120gβ-葡萄糖苷酶和120g糖化酶加入8L水配制成含酶水溶液,将2000g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在40℃下酶解72hr。加70%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以85%乙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量93%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为4:1。
实施例14
取30g植物提取用酶,30g纤维素酶和40g糖化酶加入6L水配制成含酶水溶液,将1500g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在45℃下恒温酶解36hr,加50%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以70%甲醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量72%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为1:10。
实施例15
取90g糖化酶,90g淀粉酶,30g植物提取用酶和30g纤维素酶加入4L水配制成含酶水溶液,将1000g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在30℃下酶解24hr。加70%甲醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以80%甲醇重结晶,所得沉淀继续以戊醇重结晶二次,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量99%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为6:1。
实施例16
取50g植物提取用酶,40g糖化酶,40g淀粉酶,30gβ-葡萄糖苷酶和20g纤维素酶加入2L水配制成含酶水溶液,将600g穿龙薯蓣饮片完全浸润,在40℃下酶解48hr。加50%乙醇加热回流提取,提取液减压浓缩至无醇,加适量水,放冷,待析出大量粉末状沉淀,滤得沉淀,适量水洗涤,干燥。粗品以70%乙醇重结晶,滤过,得白色粉末,为终产物,其中含薯蓣皂苷和纤细皂苷总量90%,薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为10:1。
Claims (10)
1.一种抗血栓形成药物组合物,其特征在于,所述组合物中薯蓣皂苷和纤细皂苷总重量百分比为50—99%;薯蓣皂苷和纤细皂苷重量比为1:10-30:1。
2.根据权利要求1所述抗血栓形成药物组合物,其特征在于所述组合物中薯蓣皂苷与纤细皂苷总重量百分比为85—99%。
3.根据权利要求1所述抗血栓形成药物组合物,其特征在于所述组合物中薯蓣皂苷与纤细皂苷重量比为1:1-10:1。
4.根据权利要求1-3任一项所述抗血栓形成药物组合物,其特征在于所述组合物是按照以下工艺步骤制备:
a.配制水解酶水溶液,将穿龙薯蓣药材浸润,在30-45℃下放置24-72h;
b.浸润后的药材以含水低级醇加热回流提取,提取液浓缩,加水稀释,放置,析出沉淀,滤得沉淀,以水洗涤,干燥,得类白色粉末;所述低级醇选自碳数为1-3的一元醇;
c.以低级醇或含水低级醇对所得类白色粉末进行重结晶,得终产物;所述低级醇选自碳数为1-5的一元醇。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a水解酶选自:植物提取用酶、纤维素酶、淀粉酶、糖化酶、β-葡萄糖苷酶中的一种或多种酶的混合物;优选为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶,或这两种酶分别与植物提取用酶组成的混合酶。
6.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤a水解酶水溶液中酶的浓度为100ml水中含水解酶的量为0.5-10g。
7.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤b中提取用低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇;优选乙醇。
8.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述步骤b中提取用含水低级醇的浓度为体积分数50-95%的醇。
9.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于所述步骤c重结晶用低级醇选自甲醇、乙醇;含水低级醇浓度为体积分数70-95%的醇。
10.权利要求1-3任一项所述药物组合物在抗血栓形成药物制备中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20141203 |