CN104173294A - 基于微流控液滴生成技术的pva微球制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法，步骤如下：1）制作一个芯片，在芯片内设置一个Y型夹流通道、一个蛇形通道和一个光滑的椭圆形小室；2）使蛇形通道的一侧处于20℃的温度区，另一侧处于-20℃的温度区；3）装载了疫苗的纳米纤维将被分散在一种PVA水溶液中，微球形成过程中水相与油相先后通入芯片，并配合温控装置对芯片温度的控制确保胶原微球的形态及固化。该方法使用微流体技术来生产装载偶联了疫苗的纳米纤维微球，因为它能持续生产均一性好的微球，控制尺寸过大和控制成分。聚二甲基硅氧烷缩微成像将通过在微加工模板上使用一种反向三维图像印刻微流体使用通道来完成。

Description

基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法

技术领域

本发明涉及一种PVA微球制备方法，尤其涉及一种基于微流控液滴生成技术的PVA（聚乙烯醇，polyvinyl alcohol）微球制备方法。

背景技术

水凝胶由于其良好的生物相容性、高含水量、大表面体积比、结构可调、结合及传送分子的能力，已经被证实在药物载体方面具有较大利用价值。本项目选取已被FDA证实可用于人体临床的聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）作为水凝胶基质材料，形成水凝胶微球对装载疫苗的纳米纤维进行包载。PVA具有良好的生物相容性、高含水量和亲水性，这使其成为了大蛋白疫苗分子传送材料的一种较好选择。DC微球（DC beads, 英国Biocompatibles公司）是一种FDA认可的用于化疗药物传送的系统，它通过将药物分子附着在PVA表面进行化疗药物的传送。其他可用于药物传送应用的PVA凝胶珠和PVA复合磁珠也在研发中，其中包括蛋白药物的传送。此外，已有资料显示可将修饰后的PVA水凝胶用于传送pH依赖的维生素B12和水杨酸至胃肠道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法。该方法使用微流体技术来生产装载偶联了疫苗的纳米纤维微球，因为它能持续生产均一性好的微球，控制尺寸过大和控制成分。聚二甲基硅氧烷缩微成像（PDMS）将通过在微加工模板上使用一种反向三维图像印刻微流体使用通道来完成。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法，该方法包括如下步骤：

1）制作一个芯片，在芯片内设置一个Y型夹流通道、一个蛇形通道和一个光滑的椭圆形小室；所述Y型夹流通道的一端口与蛇形通道的一端连接，Y型夹流通道的另外两端口中的一端口作为水相输入口，另一端口作为油相输入口；所述椭圆形小室具有一进口和一出口，所述蛇形通道的另一端与椭圆形小室的进口连接，所述椭圆形小室的出口作为收集微球的出口；

2）使蛇形通道的一侧处于20℃的温度区，蛇形通道的另一侧处于-20℃的温度区；

3）装载了疫苗的NCC-BC纳米纤维将被分散在一种PVA水溶液中形成微球，微球形成过程中PVA水溶液通入水相输入口内，将油相通入油相输入口内，PVA水溶液和油相通过Y型夹流通道后进入蛇形通道内，在蛇形通道内接受-20℃到20℃的循环变温加热以促成交联反应和固化球形结构，然后在椭圆形小室内进行过滤洗涤，最后从收集微球的出口排出并收集PVA微球。

作为本发明的一种优选方案，将质量分数5%的PVA蒸馏水溶液加热2小时到90℃生产水凝胶，将装载了疫苗的NCC纤维素加入到PVA溶液中，超声处理以使溶液中的纤维素分布均匀，用注射泵向水相输入口内以2400 μL/h的流速汲取含有装载了疫苗的NCC-BC纤维素的PVA溶液（水相）；同时在垂直方向以24000 μL/h的流速汲取油相。

作为本发明的另一种优选方案，PVA溶液和油相在Y型夹流通道内的流动聚焦将会生产出均一的装载了疫苗的NCC液滴，液滴直径为10微米。

作为本发明的进一步改进方案，芯片的制作采用PDMS软刻蚀方法，利用SU-8负性光刻胶经甩胶、曝光、显影、坚膜过程制作微通道模板，在其上浇注PDMS单体/引发剂混合物，经热聚合得到芯片上层，该芯片上层经由氧离子体处理与玻璃基底封接，构成完整的PDMS芯片。

与现有技术相比，本发明的基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法具有如下优点：

1、该方法开发了一种物理交联法来制成一种多孔PVA基质，避免了额外加入化学物质到交联反应中，结果显示调整过程参数可以修饰PVA的扩散特性，调节其释放速率。同时成功实现了从PVA基质中的蛋白药物的控制释放。此外，还能够通过乳化技术成功地组装装载有细菌纤维素纤维的PVA微球。

2、在该方法中，装载了疫苗的纳米晶体细菌纤维素（NCC-BC）纤维将被嵌入水凝胶微球。此纳微米系统的效益相当重大。首先，由于比表面积高，PVA基质内的NCC纤维提供的每单位质量的疫苗装载度将会很高。其次，疫苗蛋白将免于在其被包覆的水凝胶基质中降解。另外，疫苗释放到系统中不仅通过结合咕啉-维生素B12连接体的降解促进其从NCC纤维素解离来进行控制，也通过多孔水凝胶微球扩散来进行控制。此外，纳米载体装载到一种微载体为治疗学提供了更简便可行的应用。

3、微球制造使用了许多技术，包括乳化、溶剂蒸发、喷雾干燥和膜乳化。在这些可能用到的多种方法中，本发明使用微流体技术来生产装载偶联了疫苗的纳米纤维微球，因为它能持续生产均一性好的微球，控制尺寸过大和控制成分。聚二甲基硅氧烷缩微成像（PDMS）将通过在微加工模板上使用一种反向三维图像印刻微流体使用通道来完成。

4、能持续生产均一性好的微球，控制微球的尺寸过大和控制成分；生产出的微球具有微尺度、单分散的较好特性。微流控芯片具有低消耗，低成本，可控性强，操作简便、安全，快捷高效、便携，而且便于实验观察。

附图说明

图1为芯片的结构示意图。

附图中： 1—Y型夹流通道； 2—蛇形通道； 3—椭圆形小室； 4—水相输入口； 5—油相输入口； 6—收集微球的出口； 7—20℃的温度区； 8—-20℃的温度区。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法，该方法包括如下步骤：

1）制作一个芯片，如图1所示，在芯片内设置一个Y型夹流通道1、一个蛇形通道2和一个光滑的椭圆形小室3。Y型夹流通道1的一端口与蛇形通道2的一端连接，Y型夹流通道1的另外两端口中的一端口作为水相输入口4，另一端口作为油相输入口5。椭圆形小室3具有一进口和一出口，蛇形通道2的另一端与椭圆形小室3的进口连接，椭圆形小室3的出口作为收集微球的出口6。

整个芯片设计分为三部分：微球的形成、固化区域及收集区域。微球形成部分是Y型夹流通道设计，固化区域是保证微球固化进程的蛇形通道设计，固化区域后端的收集部分采用光滑的椭圆形小室。其中，装载了疫苗的NCC-BC纤维将被分散在一种PVA水溶液中，微球形成过程中PVA水溶液（水相）与油相先后通过芯片，并配合温控装置对芯片温度的控制确保胶原微球的形态及固化。芯片功能的实现主要考虑对各相流动的控制，需要在流动控制速度及各微通道尺寸及结构设计上开展深入研究。首先需要采用AutoCAD等计算机辅助设计软件进行各种单元构件和功能化微流控芯片的整体设计，然后利用Comsol Multiphysics等软件进行流动分析，并通过一系列实验结果优化芯片微尺度。

芯片制作采用PDMS 软刻蚀技术，利用SU-8负性光刻胶经甩胶、曝光、显影、坚膜等过程制作微通道模板，在其上浇注PDMS单体/引发剂混合物，经热聚合得到芯片上层。该芯片上层可经由氧等离子体处理与玻璃基底封接，构成完整的PDMS 芯片。芯片整体性考察优化：这部分工作主要是优化芯片上各部分微尺寸参数及整合效果，芯片制作将用到多种生物学及微流体控制的常用设备，如荧光显微镜、实时观测细胞培养工作台、精密注射泵等，将该部分装置有机整合、系统组建；拟采用荧光显微镜，SEM等方法对芯片的通道表面、芯片封接与接口等进行性能考察；并结合肝细胞胶原微球形成区Y型通道的尺寸，弯曲区域的长度以及培养微室的大小和阻碍隔断的尺寸，通过各部件尺寸的调控并配合实验中细胞、胶原溶液浓度和流动速度等参数，评价功能化集成芯片的优化效果以保证微流控芯片体系的稳定性和重复性。

2）使蛇形通道2的一侧处于20℃的温度区7，蛇形通道2的另一侧处于-20℃的温度区8。

3）装载了疫苗的NCC-BC纤维将被分散在一种PVA水溶液中形成微球，微球形成过程中PVA水溶液通入水相输入口4内，将油相通入油相输入口5内，PVA水溶液和油相通过Y型夹流通道1后进入蛇形通道2内，在蛇形通道2内接受-20℃到20℃的循环变温加热以促成交联反应和固化球形结构，然后在椭圆形小室3内进行过滤洗涤，最后从收集微球的出口6排出并收集PVA微球。

装载疫苗的NCC纤维素的PVA微球制备：将质量分数5%的PVA蒸馏水溶液加热2小时到90℃生产水凝胶。将装载了疫苗的NCC纤维素加入到PVA溶液中，超声处理以使溶液中的纤维素分布均匀。用注射泵通过Y型夹流通道1的一个通道以2400 μL/h的流速汲取含有装载了疫苗的NCC-BC纤维素（水相）的PVA溶液，同时在垂直方向以24000μL/h的流速汲取己烷和表面活性剂（油相）。水相和油相在Y型夹流通道1内的流速对焦将会生产出均一的装载了疫苗的NCC液滴，液滴直径为10微米。这些微球被收集起来之后将立即接受-20℃到20℃的循环变温加热以促成交联反应和固化球形结构，然后过滤洗涤。可以使用荧光标记疫苗分子和共聚焦显微镜观察到PVA微球中装载了疫苗的NCC纤维素。将会进行释放研究以确定疫苗在不同pH水平的释放动力学。微球将被置于模拟胃肠环境的介质中，并采用荧光光谱进行测量。伴随着这些实验，也会使用动物模型来表征微球的体内特性。

液滴微流控肝细胞胶原微球的形成：液滴微流控肝细胞胶原微球的形成与操控肝细胞胶原微球的形成是实现细胞自组装体系的基础和关键。本发明利用微流控芯片两相流原理和夹流方式来生成胶原液滴，第一步：将肝细胞与胶原基质及相关细胞因子（如肝细胞生长因子和血管内皮生长因子）的混合物作为分散相，矿物油为连续相，首先形成均匀一致的肝细胞胶原微球液滴并通过弯曲的通道固化，最后收集在长方形小室中培养。本实施例中拟采用生物相容性和粘附性良好且为细胞间质成分之一的胶原为三维基质，形成肝细胞微球。利用胶原的温敏特点，在微球形成初期，可通过控制芯片的温度（37℃），实现微球的非聚合状态，使得不理想的微球能以液体形态从出口排出，当形态良好的微球形成稳定后，通过降低芯片温度（0℃），使肝细胞胶原微球聚合、固化、收集于培养池中。由于肝细胞胶原微球的形成过程中引入生物相容性良好的油相，待肝细胞微球填充培养小室后采用培养基灌流替换油相，用以保证肝细胞良好的生长。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (4)

1.基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1）制作一个芯片，在芯片内设置一个Y型夹流通道（1）、一个蛇形通道（2）和一个光滑的椭圆形小室（3）；所述Y型夹流通道（1）的一端口与蛇形通道（2）的一端连接，Y型夹流通道（1）的另外两端口中的一端口作为水相输入口（4），另一端口作为油相输入口（5）；所述椭圆形小室（3）具有一进口和一出口，所述蛇形通道（2）的另一端与椭圆形小室（3）的进口连接，所述椭圆形小室（3）的出口作为收集微球的出口（6）；

2）使蛇形通道（2）的一侧处于20℃的温度区（7），蛇形通道（2）的另一侧处于-20℃的温度区（8）；

3）装载了疫苗的纳米纤维将被分散在一种PVA水溶液中形成微球，微球形成过程中PVA水溶液通入水相输入口（4）内，将油相通入油相输入口（5）内，PVA水溶液和油相通过Y型夹流通道（1）后进入蛇形通道（2）内，在蛇形通道（2）内接受-20℃到20℃的循环变温加热以促成交联反应和固化球形结构，然后在椭圆形小室（3）内进行过滤洗涤，最后从收集微球的出口（6）排出并收集PVA微球。

2.根据权利要求1所述的基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法，其特征在于，将质量分数5%的PVA水溶液加热2小时到90℃生产水凝胶，将装载了疫苗的NCC纤维素加入到PVA溶液中，超声处理以使溶液中的纤维素分布均匀，用注射泵向水相输入口（4）内以2400 μL/h的流速汲取含有装载了疫苗的NCC-BC纤维素的PVA溶液；同时在垂直方向以24000 μL/h的流速汲取油相。

3.根据权利要求2所述的基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法，其特征在于，PVA溶液和油相在Y型夹流通道（1）内的流动聚焦将会生产出均一的装载了疫苗的NCC液滴，液滴直径为10微米。

4.根据权利要求1、2或3所述的基于微流控液滴生成技术的PVA微球制备方法，其特征在于，芯片的制作采用PDMS软刻蚀方法，利用SU-8负性光刻胶经甩胶、曝光、显影、坚膜过程制作微通道模板，在其上浇注PDMS单体/引发剂混合物，经热聚合得到芯片上层，该芯片上层经由氧离子体处理与玻璃基底封接，构成完整的PDMS 芯片。