实施例2:抗肝纤维化实验
1.动物实验条件:
饲养及实验人员进入动物实验室时必须严格遵守无菌实验室规章制度,穿隔离衣,戴无菌口罩及手套,并经消毒间和缓冲带方可进入实验区。
实验动物进入实验室后,由专人喂养,自由饮水、进食,定时光照,每日消毒,动物饲养适应一周后开始实验。
2.肝纤维化模型的建立:
每只大鼠腹腔注射CCl40.025ml(用花生油1:6稀释),每周3次,共14周。
3.实验分组及处理:
把SD大鼠适应饲养一周后,随机分为以下几组:
A组(正常对照组):20只大鼠,常规饲养,不作其它处理,于第8周结束后处死5只大鼠,其它大鼠共饲养14周。
B组(溶剂对照组):20只大鼠,腹腔注射花生油(0.15ml/只/次),每周3次,共14周,于第8周结束后处死5只大鼠。
C组(模型对照组):20只大鼠,腹腔注射CCl40.025ml(用花生油1:6稀释),每周3次,共14周,于第8周结束后处死5只大鼠。
D组(实施例1):15只大鼠,腹腔注射CCl40.025ml(用花生油1:6稀释),每周3次,共14周,于第9周起注射实施例1的注射液,每周3次,共6周。
E组(复方甘草酸单铵S):15只大鼠,腹腔注射CCl40.025ml(用花生油1:6稀释),每周3次,共14周,于第9周起注射市售的复方甘草酸单铵S,每周3次,共6周。
F组(复方鳖甲软肝片组):15只大鼠,腹腔注射CCl40.025ml(用花生油1:6稀释),每周3次,共14周,于第9周起按1ml/100g体重予以复方鳖甲软肝片胃液灌胃,每周3次,共6周。
动物实验共14周,留取标本后进行相关指标检测。
4.标本收集:
动物实验结束后,试管编号,采用摘眼球采血法最大量取血,并置于未加抗凝剂的普通干净玻璃试管中。静置使其充分凝固,离心分离血清,置于-20℃保存待检;剖开大鼠腹腔暴露肝脏,留取肝脏左叶,留取部分肝组织于4%中性福尔马林液固定,部分于-170℃液氮中保存待检。
5.血清学检测:
血清分离后于-80℃冰箱保存待测。
肝功能指标:ALT、AST及ALB采用全自动生化分析仪自动检测;
肝纤维化指标:HA、LN、PC-Ⅲ采用智能放免γ测量仪自动检测;
生长因子:TNF-α、TGF-β1采用双抗夹心ELISA方法检测;
6.新鲜肝组织MDA、SOD、Hyp检测:
参照测定试剂盒说明书进行测定;
7.肝脏病理学观察
7.1.HE及Masson胶原染色:
常规制作石蜡切片,厚度3μm,裱片于普通载玻片上常规行HE染色及Masson胶原染色,并各组大鼠肝纤维化程度评分,得分越高,表示纤维化程度越重;
7.2免疫组织化学染色:
采用SABC方法分别进行Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白免疫组织化学染色。
8.统计分析
数据采用Mean±SD表示,使用SPSS12.0统计软件统计分析。P<0.05为差异具有显著性。
9.造模结果
比较第8周末处死的正常组与模型组大鼠,模型组大鼠肝脏大体观色泽偏暗,表面油腻、欠光滑,体积未见明显变化,肝脏边缘变纯,质地较实,有结节感;血清ALT、AST、HA、LN、PC-Ⅲ明显升高;病理切片观察有较多纤维生成,证实肝纤维化形成,造模成功。
9.1血清学检测
9.1.1肝功能指标(ALT、AST及ALB)的变化(见表1)
表1各组大鼠血清ALT、AST活性及ALB含量的比较
与模型对照组比较,﹡P<0.05,※P<0.01;与正常对照组比较,﹟P<0.01;
结果显示:较之A组、B组,C组大鼠血清中ALT、AST活性含量明显升高,而ALB含量有所降低,差异具有统计学意义;D、E、F组与C组相比,升高的ALT、AST下降明显,D组(实施例1)的下降幅度明显大于E组(复方甘草酸单铵S),差异具有统计学意义。
9.1.2血清肝纤维化指标的变化(见表2)
表2各组大鼠血清HA、LN、PC-Ⅲ的比较
与模型对照组比较,﹡P<0.05,※P<0.01;与正常对照组比较,﹟P<0.01;
结果显示:较之A组、B组,C组大鼠血清中HA、LN、PC-Ⅲ水平明显升高,差异具有统计学意义;D、E、F与C组比较,升高的HA、LN、PC-Ⅲ呈不同程度地降低,其中D组(实施例1)的下降幅度明显大于E组(复方甘草酸单铵S),差异具有统计学意义。
9.2新鲜肝组织MDA、SOD、Hyp检测(见表3)
表3各组大鼠肝组织MDA、SOD及Hyp的的比较
与模型对照组比较,﹡P<0.05,※P<0.01;与正常对照组比较,﹟P<0.01;
结果显示:较之A组、B组,C组大鼠血清中MDA、Hyp水平明显升高,SOD活性明显下降,差异具有统计学意义;D、E、F与C组比较升高的MDA、Hyp水平不同程度地降低,降低的SOD含量不同程度升高,D组(实施例1)的MDA、Hyp下降幅度和SOD升高幅度明显大于E组(复方甘草酸单铵S),差异具有统计学意义。
9.3肝脏病理学观察
9.3.1肝脏大体观察
处死动物后取得肝脏,吸干表面血液,肉眼下观察各组肝脏。
A、B组无明显差别,肝脏颜色鲜红,表面光滑,边缘锐利,与周围组织无粘连、易分离,质地软、脆,触之易碎;
C组体积多无明显改变,部分有明显增大,颜色呈暗红,表面有泥沙样结节,肝脏边缘明显变钝、厚,质地较实,触之硬、韧,不易碎,多与大网膜粘连,不易分离。
E组外观好于C组,颜色偏暗,部分体积增大明显;D和F组接近正常组肝组织;
9.3.2HE染色
A组、B组肝小叶结构完整,肝细胞大小均匀,无变性、坏死,无炎细胞浸润,肝索排列整齐;
C组肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,有炎细胞浸润,肝细胞气球样变性、脂肪变性明显,多分布于界板周围,可见较多双核肝细胞,汇管区纤维组织明显增生,部分可见假小叶形成。
E组与C组比较,无明显差异;D、F组可见汇管区有少量的纤维组织增生,未见假小叶形成,可见少量炎细胞浸润,肝细胞气球样变性、脂肪变性较C组明显减轻;
9.3.3Masson胶原染色
A、B组仅在血管壁、汇管区有极少量胶原纤维存在,肝小叶间未见纤维组织增生,无假小叶形成;
C组见汇管区大量胶原纤维增生,分布广泛,增生的胶原纤维形成纤维分隔,部分相互连接形成较粗大的纤维间隔,可破坏肝小叶结构,分割、包绕肝小叶,有假小叶形成。
E组与C组比较,胶原纤维减少;有差异。D、F组胶原纤维明显减少,与C组有显著差异。只见汇管区有较多的纤维组织增生,少部分亦见胶原向周边延伸,无假小叶存在;
9.3.4肝纤维化半定量评分(SSS)
综合HE及Masson染色的镜下表现,按照肝纤维化半定量评分方法,进行单盲读片并予以评分。各组得分结果见表4。结果显示:A、B组得分无统计学差异;C组肝纤维化评分明显升高;D、E、F组得分呈不同程度降低,与C组比较,差异均具有统计学意义。
表4各组SSS评分结果比较
组别 |
SSS得分 |
A:正常组 |
0.143±0.242 |
B:溶剂组 |
0.120±0.316 |
C:模型组 |
21.722±7.488﹟ |
D:实施例1 |
7.824±1.683※◇ |
E:复方甘草酸单铵S |
16.313±6.676※ |
F:复方鳖甲组 |
7.250±1.676※ |
与模型对照组比较,﹡P<0.05,※P<0.01;与正常对照组比较,﹟P<0.01。
9.3.5Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白免疫组织化学染色
阴性对照片未见阳性表达,阳性对照片可见阳性表达。A、B组肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性染色有少量表达,Ⅰ型胶原主要分布于汇管区的结缔组织和中央静脉管壁,Ⅲ型胶原主要在大血管管壁。C组肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性染色表达显著增加,广泛存在于纤维间隔及肝细胞内;Ⅰ型胶原为宽而粗大的纤维条索,免疫组化强阳性,相比之下,Ⅲ型胶原为较纤细条索;与C组相比,D、F组病变程度显著减轻,Ⅰ、Ⅲ型胶原的量增加逐渐减少;E组仍见到有部分的纤维存在。
通过彩色图像分析软件自动分析得出阳性部分所占面积比,结果如表5结果显示:比较A、B两组,阳性染色所占面积比例无统计学差异;C组阳性染色所占面积比例明显升高;D、E、F组的阳性表达面积比例均有不同程度降低,各组与C组相比差异均有统计学意义。
表5各组免疫组化图像分析面积百分比(%)
组别 |
Ⅰ型胶原 |
Ⅲ型胶原 |
A:正常组 |
0.739±0.452 |
0.712±0.345 |
B:溶剂组 |
0.872±0.469 |
0.804±0.469 |
C:模型组 |
13.041±1.346﹟ |
11.637±1.654﹟ |
D:实施例1 |
3.153±0.822※◇ |
3.296±1.349※◇ |
E:复方甘草酸单铵S |
9.756±1.306※ |
9.796±1.452﹡ |
F:复方鳖甲组 |
3.328±0.861※ |
3.699±1.093※ |
与模型对照组比较,﹡P<0.05,※P<0.01;与正常对照组比较,﹟P<0.01。