CN104136420A - 作为tau病理学的成像探针的杂环化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了式I的哒嗪酮化合物或其放射性标记的衍生物，其中：R1为烷基或Ar，其任选被至少一个烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基、酰胺或烷氧基卤基取代；R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)n卤基、-C(=O)(CH2)n杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基；Ar为芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基；n为0-10的整数。所述化合物可用作在阿尔茨海默氏症(Alzheimer’sdisease)中的Tau病理学的成像探针。本发明还公开了组合物和制备这类化合物的方法。

Description

作为 TAU 病理学的成像探针的杂环化合物
发明的技术领域
本发明涉及放射性标记的哒嗪酮化合物，其组合物、制备所述化合物的方法及其作为Tau病理学的成像探针、特别作为涉及阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease)的Tau病理学的成像探针的用途。本发明的化合物可用于正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射计算机断层摄影(SPECT)成像。
相关技术描述
阿尔茨海默氏症(AD)是老年痴呆的最常见原因。其基于事后(post-mortem)神经病理学来作出决定性诊断并分级。AD的病理性特定为伴随着淀粉样蛋白斑的沉积和神经元纤维缠结(NFTs)的显著神经元损失。
NFTs由丝状聚集物组成，该聚集物由微管相关蛋白tau构成。许多文献提出，与淀粉样蛋白斑相比，tau聚集物(NFTs)或NFT形成与AD发展更紧密地相关(Braak, H.等，Neuropathological Staging of Alzheimer-related Changes. Acta Neuropathologica, 82, 239-259, 1991)。据报道在可检测到新皮层淀粉样沉积和痴呆病征之前数十年在区域(深颞叶)处出现tau聚集物或神经纤维性病变。tau病变在表现出痴呆的临床症状或病征之前出现且与痴呆的严重性相关。这些特性使得tau聚集物成为用于早期诊断AD的有潜力的优异方法。因此，体内检测这些病变或NFTs将证明可用于诊断AD且用于追踪疾病发展。
在发现NFT成像探针方面的挑战之一在于对于含有交叉β折叠构象的其他蛋白质聚集物(诸如，淀粉样蛋白斑)的选择性。Kudo等近来已经筛选了在体内对聚集tau的选择性超过对淀粉样蛋白的选择性的化合物。BF-170和BF-158被描述为对tau聚集物的选择性超过对Aβ1-42淀粉样蛋白的选择性约三倍：
(Kudo, Y.,等，J. Neuroscience, 2005, 25(47):10857-10862)。在现为US 7,118,730的US 2005/0009865中还将这些化合物及其他喹啉衍生物描述为用于其中tau蛋白聚集的疾病的成像诊断的诊断探针。这些探针可用放射性核素标记。
WO2011/037985描述了tau聚集(tau assembly)的氨基噻吩并哒嗪抑制剂。
然而，在本领域中仍然需要可用作用于NFTs的成像剂的其他化合物。下文描述的本发明解决了这一需要。
附图简述
图1为表示在12.8分钟洗脱的产物37*的制备型HPLC色谱图(顶部：在254nm下的UV通道(UV channel)，底部：放射性通道(radioactivity channel))。
图2为表示在7.2分钟洗脱的产物37*的分析型HPLC色谱图(顶部：在254nm下的UV通道，底部：放射性通道)。
图3为表示在6.8分钟洗脱的产物38*的分析型HPLC色谱图(顶部：在254nm下的UV通道，底部：放射性通道)。
图4为表示在6.8分钟洗脱的产物38*和在6.7分钟洗脱的示踪标准化合物19F-38的分析型HPLC色谱图(顶部：在254nm下的UV通道，底部：放射性通道)。
图5示出了人AD组织切片的组织学。在AD组织切片中观察到许多tau+ NFTs (A-B，箭头)和Aβ+蛋白斑(E-F，箭头)。另外，在用Gallyas银染色法标记的组织切片(E-F)中还观察到NFTs (C，箭头)和神经蛋白斑(neuritic plaque)(D，箭头)。10x：A、C、E，比例条100μM；20x：B、D、F，比例条：A，25μM。
图6示出了新化合物与AD组织中的NFTs和蛋白斑的结合。38 (A、B)在高试验浓度下结合NFTs (A)和蛋白斑(B)两者。类似地，105 (C, D)在高试验浓度下也结合NFTs (C, D)和蛋白斑(D)。在较低的浓度下，两种化合物优先结合NFTs (表3)。箭头 = NFTs、* = 蛋白斑。A和C：40x，B和D：20x。
发明概述
本发明提供了用作阿尔茨海默氏症中的Tau病理学的成像探针的新哒嗪酮化合物。本发明的化合物可被放射性标记，以使得它们可用于体外和体内成像目的。
本发明提供了式I化合物：
其中：
R1为烷基或Ar，其任选被至少一个烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基、酰胺或烷氧基卤基取代；
R2独立地为氢、烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、酰基、芳基、杂芳基；
Ar为芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基；
p为0-10、优选0-5、更优选0-3的整数；
或其放射性标记的衍生物。
本发明还提供了药用组合物，其包含式(I)化合物或其放射性标记的衍生物和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了制备式(I)化合物或其放射性标记的衍生物的方法。
本发明还提供了使用式(I)化合物的放射性标记的衍生物或其药用组合物成像的方法。
本发明还提供了使用式(I)化合物的放射性标记的衍生物或其药用组合物体外和/或体内检测tau聚集物的方法。
发明详述
本发明提供了如本文所述的式(I)的哒嗪酮化合物。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供了如上所述的式(I)化合物，其中Ar为：
。
在本发明的一个优选的实施方案中，提供了如上所述的式(I)化合物，其中R1的Ar为：
，优选为。
本发明提供了具有式(Ia)的式(I)化合物：
，
其中：
R1为烷基或Ar，其任选被至少一个烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基、酰胺或烷氧基卤基取代；
R2独立地为氢、烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、酰基、芳基、杂芳基；
Ar为芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基；
p为0-10、优选0-5、更优选0-3的整数；
或其放射性标记的衍生物。
本发明提供了具有式(Ib)的式(I)化合物：
，
其中：
R2、R3和R4各自如本文中对于式(I)化合物所定义；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
本发明提供了具有式(Ic)的式(I)化合物：
，
其中：
R2如本文中对于式(I)化合物所定义；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
本发明提供了具有式(Ida)、(Idb)或(Idc)的式(I)化合物：
，
其中：
R2、R3和R4各自如本文中对于式(I)化合物所定义；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
本发明提供了具有式(Iea)、(Ieb)或(Iec)的式(I)化合物：
，
其中：
R2如本文中对于式(I)化合物所定义；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
本发明提供了具有式(If)的式(I)化合物：
，
其中：
R3和R4各自如本文中对于式(I)化合物所定义；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；
n为0-5的整数；
R6和R7独立地为氢、烷基或炔基，或当与它们所连接的氮合在一起时形成任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、羟基、硝基、芳基、杂环烷基、杂芳基或杂芳基卤基取代的杂芳基或杂环烷基；
或其放射性标记的衍生物。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
，
其中I*为123I、124I或125I；更优选为123I或125I；更优选为123I。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述式(I)化合物为：
。
根据本发明，对于本文所述的本发明化合物，卤素选自F、Cl、Br和I；优选为F。
本发明提供了如本文所述的本发明化合物的放射性标记的衍生物。根据本发明，本发明化合物的“放射性标记的衍生物”或“其放射性标记的衍生物”为包含放射性核素的如本文所述的本发明化合物(即，用放射性核素放射性标记的本发明化合物)。例如，式(I)化合物的放射性标记的衍生物为如本文所述的式(I)化合物，其中R1、R2、R3、R4和Ar中的至少一个包含放射性核素。所述放射性核素是指本领域已知的任何放射性同位素。优选所述放射性核素为适合成像(例如，PET、SPECT)的放射性同位素。在一个实施方案中，所述放射性核素为适合PET成像的放射性同位素。甚至更优选所述放射性核素为11C、13N、15O、68Ga、62Cu、18F、76Br、124I或125I；甚至更优选所述放射性核素为18F。
在一个实施方案中，所述放射性核素为适合SPECT成像的放射性同位素。甚至更优选所述放射性核素为99mTc、111In、67Ga、201Tl、123I或133Xe；甚至更优选所述放射性核素为99mTc或123I。
中间体：
本发明提供了式II的前体或中间体化合物：
，
其中：
R1为烷基或Ar，其任选被至少一个烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基、酰胺、烷氧基卤基或烷氧基OPg取代；
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)pOPg、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被烷基、烷基卤基、烷基OPg、卤素、硝基、芳基、杂芳基、杂芳基(CH2)p卤基或杂芳基(CH2)pOPg取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基；
Ar为芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基；
p为0-10、优选0-5、更优选0-3的整数；
Pg为H、保护或离去基团。
所述保护或离去基团可为本领域已知的任何保护或离去基团。合适的保护或离去基团的实例包括但不限于甲苯磺酸酯(OTs)、BOC、Fmoc、Cbz、乙酰基(Ac)和对甲氧基苄基(PMB)。
本发明的前体或中间体化合物的实例包括：
。
本发明还提供了下式的前体或中间体化合物：
。
药用或放射性药用组合物
本发明提供了药用或放射性药用组合物，其包含如本文所述的本发明化合物以及药学上可接受的载体、赋形剂或生物相容性载体。根据本发明，当本发明的化合物为放射性标记的衍生物时，所述药用组合物为放射性药用组合物。
本发明还提供了适合哺乳动物施用的药用或放射性药用组合物，其包含如本文所述的本发明化合物以及药学上可接受的载体、赋形剂或生物相容性载体。
本领域技术人员应理解，所述药学上可接受的载体或赋形剂可为本领域已知的任何药学上可接受的载体或赋形剂。
“生物相容性载体”可为本发明的化合物可悬浮或溶解于其中使得药用组合物生理学耐受，例如可施用到哺乳动物体而没有毒性或过度不适的任何流体，特别是液体。所述生物相容性载体合适地为可注射的载液，诸如无菌无热原的注射用水；水溶液，诸如盐水(可将其有利地平衡以使得用于注射的最终产物为等渗的或非低渗的)；一种或多种张力调节物质(例如，血浆阳离子与生物相容的反荷离子的盐)、糖(例如，葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如、山梨糖醇或甘露糖醇)、二醇(例如，甘油)或其他非离子多元醇材料(例如，聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。所述生物相容性载体还可包括生物相容性有机溶剂，诸如乙醇。这类有机溶剂可用于溶解更亲油的化合物或制剂。优选所述生物相容性载体为无热原的注射用水、等渗盐水或乙醇水溶液。用于静脉内注射的生物相容性载体的pH合适地在4.0-10.5范围内。
所述药用或放射性药用组合物可经肠胃外施用，即通过注射施用，且其最优选为水溶液。这类组合物可任选含有其他成分，诸如缓冲剂；药学上可接受的溶解剂(例如，环糊精或表面活性剂，诸如普卢兰尼克(Pluronic)、吐温(Tween)或磷脂)；药学上可接受的稳定剂或抗氧化剂(诸如，抗坏血酸、龙胆酸或对氨基苯甲酸)。在本发明的化合物作为放射性药用组合物提供时，制备所述化合物的方法还可包括获得放射性药用组合物所需要的步骤，例如除去有机溶剂、加入生物相容性缓冲剂和任何任选的其他成分。对于肠胃外施用，还需要采用确保所述放射性药用组合物无菌且不致热的步骤。所述步骤为本领域技术人员所公知。
制备本发明的化合物
本发明的化合物可通过本领域已知的任何方法制备，这些方法包括但不限于亲核性芳族取代、亲核性脂族取代和点击化学。
在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物可通过用所要卤素或放射性核素亲核性芳族取代或亲核性脂族取代适当的离去基团而用放射性核素卤代或放射性标记。用于亲核性芳族取代的合适离去基团的实例包括但不限于Cl、Br、F、NO2、ArI+和+N(R)4。用于亲核性脂族取代的合适离去基团的实例包括但不限于I、Br、Cl、OTs (甲苯磺酸酯)、OTf (三氟甲磺酸酯)、BsO (对溴苯磺酸酯)、OMs (甲磺酸酯)和NsO (间硝基苯磺酸酯)。
在本发明的一个实施方案中，本发明的化合物可经由活化芳族环用18F直接标记。该方法需要在放射性标记期间保护必需的氨基。
在一个实施方案中，本发明的化合物可根据以下方案I制备：
方案 I
。
在一个实施方案中，本发明的化合物可根据以下方案II制备：
方案 II
。
在一个实施方案中，本发明的化合物可根据以下方案III制备：
方案 III
。
在一个实施方案中，本发明的化合物可根据以下方案IV制备：
方案 IV
。
例如，放射性同位素[18F]-氟离子(18F-)通常自核反应18O(p,n)18F作为水溶液获得且通过加入阳离子反荷离子且随后除去水来使其具有反应性。合适的阳离子反荷离子在无水反应溶剂内应当具有足够溶解性以维持18Fֿ的溶解性。因此，已经使用的反荷离子包括诸如铷或铯的大且软的金属离子、与诸如KryptofixTM的穴状配体络合的钾、或四烷基铵盐。优选反荷离子为与诸如KryptofixTM的穴状配体络合的钾，因为其在无水溶剂中具有良好的溶解性和增强的18Fֿ反应性。18F也可通过亲核置换诸如卤素或甲苯磺酸酯基团的合适离去基团来引入。公知的18F标记技术的更详细论述可在“Handbook of Radiopharmaceuticals (放射性药物手册)” (2003; John Wiley and Sons: M.J. Welch和C.S. Redvanly编)的第6章中见到。可使用类似的方法来用包括本文所述的PET和SPECT放射性同位素的其他放射性同位素放射性标记本发明的化合物。
自动合成
在一个实施方案中，各自如本文所述的制备本发明的放射性标记衍生物的方法为自动的。例如，本发明的[18F]-标记化合物可借助于自动放射性合成设备以自动方式方便地制备。存在这类平台设备的多个市售实例，包括TRACERlabTM (例如，TRACERlabTM MX)和FASTlabTM (均得自GE Healthcare Ltd.)。这类设备通常包括在其中进行放射性化学的通常为一次性的“盒”，将该盒装配到所述设备以进行放射性合成。所述盒通常包括流体路径、反应容器和用于接收试剂小瓶的开口以及在放射性合成后清除步骤中使用的任何固相萃取柱。任选在本发明的另一实施方案中，所述自动放射性合成设备可与高效液相色谱仪(HPLC)相连。本发明因此提供了用于自动合成本发明化合物的盒。
成像方法
如本文所述的本发明的放射性标记衍生物可与NFTs或tau聚集物结合且帮助确定NFTs/tau聚集物的存在量，该存在量又可与AD的分级相关联。
本发明因此提供了成像的方法，其包括以下步骤：将本文所述的本发明的放射性标记衍生物施用到受试者并检测在所述受试者中的本发明的所述放射性标记衍生物。本发明还提供了使用本文所述的本发明的放射性标记衍生物体外或体内检测tau聚集物的方法。因此，本发明提供了早期检测和诊断阿尔茨海默氏症的较好的工具。本发明还提供了用于监测阿尔茨海默氏症的进程和治疗效果的较好的工具。
本领域技术人员应当了解，成像的类型(例如，PET、SPECT)将由放射性同位素的性质决定。例如，如果本发明的放射性标记衍生物含有18F，则其将适合PET成像。
因此，本发明提供了体外或体内检测tau聚集物的方法，其包括以下步骤：
i) 将如本文定义的本发明的放射性标记衍生物施用到受试者；
ii) 使本发明的所述放射性标记衍生物与在所述受试者体内的NFTs结合；
iii) 检测由在本发明的所述结合的放射性标记衍生物中的所述放射性同位素发出的信号；
iv) 产生表示所述信号的位置和/或量的图像；和
v) 确定所述tau聚集物在所述受试者体内的分布和程度。
“施用”本发明的放射性标记衍生物的步骤优选经肠胃外进行，且最优选静脉内进行。静脉内路径代表将化合物传遍受试者身体的最有效的方法。静脉内施用既不代表显著的物理干预，也不代表对受试者的显著健康危险。本发明的放射性标记衍生物优选作为如本文定义的本发明的放射性药用组合物施用。施用步骤对于本发明的成像方法的完整定义是不需要。因而，本发明的成像方法还可理解为包括对已经预施用本发明的放射性标记衍生物的受试者进行的上文定义的步骤(ii)-(v)。
在所述施用步骤之后且在所述检测步骤之前，使本发明的放射性标记衍生物与tau聚集物结合。例如，当受试者为完整的哺乳动物时，本发明的放射性标记衍生物将动态地穿过哺乳动物身体，与其中的各种组织接触。本发明的放射性标记衍生物一旦接触到tau聚集物，其就将与tau聚集物结合。
本发明方法的“检测”步骤包括借助于例如PET照相机的对由在本发明的放射性标记衍生物中包含的放射性同位素发出的信号敏感的检测器检测所述信号。该检测步骤还可理解为获取信号数据。
本发明方法的“产生”步骤通过对获取的信号数据应用重建算法以产生数据组的计算机来进行。随后处理该数据组以产生表示由所述放射性同位素发出的信号的位置和/或量的图像。所发出的信号与酶或肿瘤组织的量直接相关联，因此“确定”步骤可通过评价所产生的图像来进行。
本发明的“受试者”可为任何人类或动物受试者。优选本发明的受试者为哺乳动物。最优选所述受试者为完整的哺乳动物身体体内。在一个特别优选的实施方案中，本发明的受试者为人类。
“与tau聚集物相关的疾病病况”可为MCI (轻度认知损伤)、痴呆或阿尔茨海默氏症。
实施例
除非提到其他情况，否则所有材料都是市售的。缩写具有以下意义：
BINAP　　　1,2-二(萘-2-基)-1,1,2,2-四苯基二膦
BOP　　　　六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲氨基)鏻
DCM　　　　二氯甲烷
DIPEA　　　　N,N-二异丙基乙胺
DMF　　　　　二甲基甲酰胺
DMSO　　　　二甲亚砜
HPLC　　　　高效液相色谱
Kryptofix　　　4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷
PBS　　　　　磷酸盐缓冲盐水
QC HPLC　　质量控制高效液相色谱
TLC　　　　　薄层色谱
TFA　　　　　三氟乙酸
实施例 1
方案 A. 放射性合成 18 F-37 或 37* 。
氟-18在回旋加速器中使用18O(p,n)18F核反应经由质子照射含有富集的[18O]H2O的目标物而生成。将Wheaton小瓶(3mL)装上Kryptofix (5mg，13.3μmol)、碳酸钾(1mg，7.2μmol)、乙腈(1mL)和含18F的水(100μL、335MBq)。将该小瓶加热到100℃且使用氮气流(100mL/min)除去溶剂。加入乙腈(0.5mL)且再次使用氮气流蒸发至干。重复该程序两次。将该小瓶冷却到室温且加入甲苯磺酸酯38 (2.0mg，3.6μmol)在无水DMSO (0.2mL)中的溶液(方案A)。将反应混合物在100℃下加热15分钟。通过制备型HPLC (Luna C18 Phenomenex，5μ，50×4.6mm，溶剂A：H2O/0.1% TFA，溶剂B：MeCN/0.1% TFA，流速3.0mL/min，UV：254nm，梯度：20-90% B，在15分钟内)纯化。将分离的产物(图1，未校正的放射性化学产率 = 19%)用水(3mL)稀释且使其通过已经通过用乙醇(5mL)和水(10mL)冲洗活化的tC18 SepPak Light柱(Waters)。将该柱用水(5mL)洗脱且用氮气(1分钟，100mL/min)冲洗。用乙醇洗脱到PBS溶液中提供18F-37或37* (50 MBq)，制剂回收率89%(对于衰减校正)。QC HPLC (Kinetex C18 Phenomenex，2.6μ，50×4.6mm，溶剂A：H2O/0.1% TFA，溶剂B：MeCN/0.1% TFA，流速1.0mL/min，UV：254nm，梯度：20-90% B，在15分钟内)表明具有98%的放射性化学纯度的18F-37或37*(图2)。
实施例 2
方案 B. 放射性合成 18 F-38 或 38* 。
如在实施例1中所述，将[18F]氟化物在Wheaton小瓶中共沸干燥。将该小瓶冷却到室温且加入甲苯磺酸酯39 (2.0mg，3.7μmol)在无水DMSO (0.2mL)中的溶液(方案B)。将反应混合物在100℃下加热15分钟。在1分钟、5分钟和15分钟之后，将粗反应混合物的等分试样(10μL)猝灭到HPLC流动相(100μL，35%溶剂B)中。分析型HPLC (Kinetex C18 Phenomenex，2.6μ，50×4.6mm，溶剂A：H2O/0.1% TFA，溶剂B：MeCN/0.1% TFA，流速1.0mL/min，UV：254nm，梯度：20-90%B，在15分钟内)表明18F-38或38*形成(图3)。注入冷的参考化合物证实作为产物18F-38或38*的放射性信号(图4)。
实施例 3
如在实施例1中所述，氟-18在Wheaton小瓶中生成并将其共沸干燥。供选的相转移系统如[18F]四丁基氟化铵碳酸氢盐(TBAF)和[18F] F-/KHCO3/Kryptofix与溶解于无水DMSO (0.2mL)中的甲苯磺酸酯39 (2.0mg，3.7μmol)一起施用。将反应混合物加热到100℃或用微波(50W，设定温度90℃)照射。表1汇总了用于放射性化学优化的时间进程研究。
表 1. 比较在不同反应条件下18F-38或38*的分析放射性化学产率。
实施例 4. 制备化合物 57
方案 5
4a. 制备化合物55
将54 (250mg，0.788mmol)(根据以下实施例13d制备)、2-(哌啶-4-基)乙醇(122mg，0.94mmol)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)-鏻试剂(523mg，1.18mmol)的混合物溶解于无水DMSO (10mL)中且将DIPEA (204mg，1.576mmol，0.27mL)加入其中。将反应混合物在室温下搅拌16小时。将该反应混合物用水(100mL)稀释且将所得混合物用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将有机层用盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发。将残留物与乙醚一起搅拌过夜。将沉淀物过滤并使其干燥以得到300mg (85%)作为黄色固体的55。
LC-MS：m/z C21H24N4O4S，计算值：428，实验值：429.5 (M+H)+。
。
4b. 制备化合物56
将55 (300mg，0.7mmol)溶解于无水氯仿(20mL)中且在0℃下经10分钟逐滴加入用CHCl3 (5mL)稀释的三氟化二乙氨基硫(113mg，0.7mmol)。通过TLC每10分钟监测该反应。此后，将反应混合物用过量的CHCl3 (100mL)稀释，用饱和NaHCO3 (20mL)洗涤且用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将有机层过滤、干燥(Na2SO4)并浓缩以产生粗产物。该粗产物通过半制备型HPLC使用乙腈:甲醇(50:50)和20%乙酸铵(pH 4.3)纯化。向汇合的级分中加入1% HCl溶液(5mL)，之后冷冻干燥，产生40mg (13%)黄色固体。
LC-MS：m/z C21H23FN4O3S，计算值：430.50，实验值：431.4 (M+H)+。
。
4c. 制备化合物57
将55 (450mg，1.05mmol)溶解于DCM和二噁烷的1:1混合物(20mL)中且加入N,N-二甲氨基吡啶(256mg，2.1mmol)。经1小时的时间加入用二氯甲烷(10mL)稀释的甲磺酰氯(120mg，1.05mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。此后，将反应混合物用DCM (100mL)稀释，用水(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到90mg (17%)的所要产物。
LC-MS：m/z C22H26N4O6S2，计算值：506.60，实验值：506.9 (M+H)+。
。
实施例 5. 制备化合物 59
方案 6
5a. 制备化合物59
将58 (100mg，0.29mmol) (根据实施例13f制备)溶解于DMF (10mL)中，加到1N NaOH溶液(17.4mg，0.43mmol)和表氟醇(epiflurohydrin)(26mg，0.348mmol)中。将该反应混合物在100℃下在微波中搅拌3小时。此后，将反应混合物用水稀释且用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过硅胶色谱纯化以得到32mg (26%)的所要产物。
LC-MS：m/z C19H21FN4O4S，计算值：420.46，实验值：420.9 (M+H)+。
。
实施例 6. 制备化合物 60
方案 7
将58 (600mg，1.74mmol) (根据实施例13f制备)溶解于DMF (15mL)中，加入碳酸铯(848mg，2.61mmol)和甲苯磺酸缩水甘油酯(397.3mg，1.74mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15小时。此后，将反应混合物用水稀释且用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到80mg (11%)的所要产物。
LC-MS：m/z C19H20N4O4S，计算值：400.12，实验值：401.2 (M+H)+。
。
实施例 7. 制备化合物 61
方案 8
将58 (400mg，1.16mmol)(根据实施例13f制备)溶解于DMF (15mL)中，加入碳酸铯(568mg，1.74mmol)和溴氟丙烷(162mg，1.16mmol)。将反应混合物搅拌15小时。此后，将反应混合物用水稀释且用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到85mg (18%)的98.3%的所要产物。
LC-MS：m/z C19H21FN4O3S，计算值：404.46，实验值：405.2 (M+H)+。
。
实施例 8. 制备化合物 62
方案 9
将58 (300mg，0.87mmol) (根据实施例13f制备)溶解于DMF (10mL)中，加入碳酸铯(283mg，0.87mmol)和1,3-丙二醇二对甲苯磺酸酯(335mg，0.87mmol)。将反应混合物搅拌15小时。此后，将反应混合物用水稀释且用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到110mg (23%)的所要产物。
LC-MS：m/z C26H28N4O6S2，计算值：556.65，实验值：557.2 (M+H)+。
。
实施例 9. 制备化合物 64
方案 10
9a. 制备化合物63
将58 (400mg，1.16mmol) (根据实施例13f制备)溶解于二噁烷和氯仿的1:1混合物(25mL)中且加入二甲基氨基吡啶(221mg，1.74mmol)、二碳酸二叔丁酯(253mg，1.16mmol)。将反应混合物搅拌2小时。此后，将反应混合物用水稀释且用二氯甲烷(2×150mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到300mg (58%)的所要产物。
LC-MS：m/z C21H24N4O5S，计算值：444.50，实验值：444.3 (M+)+。
。
9b. 制备化合物64
将63 (30mg，0.067mmol)溶解于乙腈(15mL)中，加入碳酸铯(33mg，0.101mmol)和甲苯磺酸氟乙酯(15mg，0.067mmol)。将反应混合物搅拌15小时。此后，将反应混合物用水稀释且用乙酸乙酯(2×150mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到10mg的所要产物。
LC-MS：m/z C23H27FN4O5S，计算值：490.55，实验值：491.0 (M+)+。
。
实施例 10. 制备化合物 67
方案 11
10a. 制备化合物65
将5-溴-2-氟吡啶(1.5g，8.52mmol)和叔丁醇钠(1.22g，12.79mmol)溶解于1,4-二噁烷(30mL)中，加入哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.58g，8.52mmol)，将氮气吹扫穿过该反应混合物历时5分钟，加入BINAP (0.318g，0.511mmol)，接着加入乙酸钯(II) (0.038g，0.17mmol)。将反应混合物在回流下搅拌6小时。此后，将反应混合物用水稀释且用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到1.0g的所要产物。
LC-MS：m/z C14H20FN3O2，计算值：281.33，实验值：281.9 (M+H)+。
。
10b. 制备化合物66
将65 (650mg，2.31mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中并冷却到5℃。将5mL 20% TFA在DCM中的溶液逐滴加入反应物质中。将反应混合物搅拌3小时。此后，将反应混合物用过量的DCM (100mL)稀释且用水洗(2×50mL)洗涤，接着用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并在真空下浓缩以得到500mg的所要产物。
LC-MS：m/z C9H12FN3，计算值：181.21，实验值：181.7 (M+H)+。
。
10c. 制备化合物67
向54 (300mg，0.945mmol)、66 (171mg，0.945mmol)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧代-三(二甲氨基)-鏻试剂(627mg，1.418mmol)在无水DMSO (10mL)中的混合物中加入DIPEA (244mg，1.891mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应物质的进程通过LCMS监测。将该反应混合物用水(100mL)稀释且将所得混合物用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将有机层用盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发。将残留物与乙醚一起搅拌过夜。将沉淀物过滤并使其干燥以得到60mg (13%)作为黄色固体的67。
LC-MS：m/z C23H21FN6O3S，计算值：480.51，实验值：481.0 (M+H)+。
。
实施例11. 制备化合物70
方案 12
11a. 制备化合物68
将5-溴-2-硝基吡啶(1.0g，4.92mmol)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.1g，5.91mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮中并在120℃下搅拌18小时。此后，将反应混合物冷却到30℃，用水稀释且用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥且在真空下浓缩以得到粗产物。该粗产物通过柱色谱纯化以得到400mg的所要产物。
LC-MS：m/z C14H20N4O4，计算值：308.33，没有离子化。
。
11b. 制备化合物69
将68 (400mg，1.29mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中，冷却到5℃。逐滴加入5mL 20% TFA在DCM中的溶液。将反应混合物搅拌3小时。此后，将反应混合物用过量的DCM(100mL)稀释且用水洗(2×50mL)洗涤，接着用盐水(50mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥并在真空下浓缩以得到200mg (74%)的所要产物。
LC-MS：m/z C9H12N4O2，计算值：208.22，实验值：208.7 (M+H)+。
11c. 制备化合物70
向54 (305mg，0.96mmol)、69 (200mg，0.96mmol)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)-鏻试剂(637mg，1.44mmol)在无水DMSO (10mL)中的混合物中加入DIPEA (0.67mL，3.84mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌12小时。反应物质的进程通过LCMS监测。将该反应混合物用水(100mL)稀释且将所得混合物用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。将有机层用盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发。该粗产物通过柱色谱纯化以得到40mg的所要产物。
LC-MS：m/z C23H21N7O5S，计算值：507.52，实验值：508.0 (M+H)+。
。
实施例12. 制备化合物74
方案 13
12a. 制备化合物71
将4-氨基苯酚(5g，45.87mmol)溶解于37%盐酸(7mL)、乙醇(15mL)和水(20mL)的混合物中。将反应混合物在冰水浴中冷却到0℃，之后逐滴加入亚硝酸钠(3.21g，45.87mmol)在水(10mL)中的溶液中。将所得混合物在0℃下搅拌20分钟。加入在水(50mL)中的乙酸钠(24.95g，183.49mmol)和乙酰乙酸乙酯(5.96g，45.87mmol，5.84mL)且将反应混合物在0℃下搅拌2小时。将沉淀的固体过滤，用水洗涤且在高真空下干燥以提供6g (52%)的作为棕色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C12H14N2O4，计算值：250.1，实验值：250.6 (M+H)+。
。
12b. 制备化合物72
将71 (2.0g，8mmol)、氰乙酸乙酯(1.81g，16mmol，1.70mL)和乙酸铵(2.46g，31.91mmol)在乙酸(6mL)中的混合物在微波下在120℃下加热45分钟。将所得混合物用水(50mL)稀释且用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将合并的有机萃取物用水(30mL)、盐水(30mL)洗涤，经硫酸钠干燥且在真空下蒸发。将粗化合物用己烷(3×50mL)洗涤且过滤以获得1.8g (78%)棕色固体。
LC-MS：m/z C15H13N3O4，计算值：299.0，实验值：298.5 (M-H)-。
。
12c. 制备化合物73
将71 (2g，6.38mmol)、硫(0.30g，9.24mmol)和吗啉(1.1g，12.67mmol，1.1mL)在乙醇(6mL)中的混合物在微波中加热到120℃历时30分钟。在将混合物冷却之后，过滤所形成的沉淀物。自热乙醇中重结晶产生1.3g (59%)浅褐色固体。
LC-MS：m/z C15H13N3O4S，计算值：331.0，实验值：331.9 (M+H)+。
。
12d. 制备化合物74
将氢氧化锂单水合物(0.1g，4.33mmol)加到73 (2g，6.03mmol)在四氢呋喃(20mL)和水(20mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应的进程通过LCMS监测。此后，使用1N HCl将反应物质的pH调节到6且将水层用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层分离，经硫酸钠干燥且蒸发以产生1.2g (66%)作为黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C13H9N3O4S，计算值：303.3，实验值：303.9 (M+H)+。
。
实施例13. 制备化合物79
方案 14
13a. 制备化合物75
将对甲氧基苯胺(2g，16.23mmol)溶解于37%盐酸(3mL)、乙醇(5mL)和水(3mL)的混合物中。将反应混合物在冰水浴中冷却到0℃，之后逐滴加入亚硝酸钠(1.12g，16.23mmol)在水(7mL)中的溶液。将所得混合物在0℃下搅拌20分钟。加入在水(20mL)中的乙酸钠(8.61g，63.27mmol)和乙酰乙酸乙酯(2.1g，16.13mmol，2mL)且将反应混合物在0℃下搅拌2小时。随后，将沉淀的固体过滤，用水洗涤且在高真空下干燥以提供4g (93%)黄色固体。
LC-MS：m/z C13H16N2O4，计算值：264.1，实验值：265.1 (M+H)+。
。
13b. 制备化合物76
将75 (2.0g，7.57mmol)、氰乙酸乙酯(1.71g，15.11mmol，1.61mL)和乙酸铵(2.33g，30.22mmol)在乙酸(5mL)中的混合物在微波中在120℃下照射45分钟。将所得混合物用水(100mL)稀释且用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将合并的有机萃取物用水(30mL)、盐水(30mL)洗涤，干燥(Na2SO4)且在真空下蒸发。将粗化合物在乙醇中加热并热过滤以产生2g (86%)暗黄色固体。
LC-MS：m/z C16H15N3O4，计算值：313.3，实验值：312.5 (M-H)+。
。
13c. 制备化合物77
。
将76 (2g，6.38mmol)、硫(0.30，9.24mmol)和吗啉(1.1g，12.67mmol，1.1mL)在乙醇(7mL)中的混合物在微波中加热到130℃历时25分钟。反应物质的进程通过HPLC监测。此后，冷却混合物并过滤所形成的沉淀物。将粗产物从乙醇中重结晶以得到0.530g (24%)作为淡褐色固体的产物。
LC-MS：m/z C16H15N3O4S，计算值：345.0，实验值：346.0 (M+H)+。
。
13d. 制备化合物54
将氢氧化锂单水合物(0.1g，4.33mmol)加到77 (0.50g，1.44mmol)在四氢呋喃(10mL)和水(10mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应物质的进程通过HPLC监测。此后，使用1N HCl将反应物质的pH调节到6且用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机层分离、干燥(Na2SO4)并蒸发以产生0.35g (77%)作为黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C14H11N3O4S，计算值：317.3，实验值：318.6 (M+H)+。
。
13e. 制备化合物78
向54 (0.35g，1.10mmol)、异丙胺(0.13g，2.19mmol，0.18mL)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)-鏻试剂(0.73g，1.65mmol)在无水DMSO (5mL)中的混合物中加入DIPEA (0.28g，2.16mmol，0.38mL)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应物质的进程通过LCMS监测。将反应混合物用水(25mL)稀释且将所得混合物用二氯甲烷(3×75mL)萃取。将有机层用盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发。将残留物与乙醚一起搅拌过夜。将沉淀物过滤并使其干燥以产生0.30g (90%)棕色固体。
LC-MS：m/z C17H18N4O3S，计算值：358.1，实验值：359.1. (M+H)+。
。
13f. 制备化合物58
向78 (0.22g，0.61mmol)中加入甲烷磺酸(4mL)和蛋氨酸(0.27g，1.81mmol)且将反应混合物搅拌3天。反应物质的进程通过LCMS监测。此后，将反应物质倾入冰中且沉淀的固体通过离心分离回收。将产物溶解于乙酸乙酯中并用碳酸氢盐水溶液(50mL)洗涤。将有机层分离，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发以产生160mg (80%)棕色固体。
LC-MS：m/z C16H16N4O3S，计算值：344.0，实验值：345.0 (M+H)+。
。
13g. 制备化合物79
向在无水乙腈(20mL)中的58 (0.30g，0.08mmol)中加入碳酸铯(0.42g，1.29mmol)和二甲苯磺酸乙二醇酯(0.39g，1.02mmol)。将反应混合物加热到60℃历时16小时。将反应混合物用水(25mL)稀释且将所得混合物用二氯甲烷(2×100mL)萃取。将有机层用盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发。粗化合物使用半制备型色谱(semi-prep)用水和乙酸铵作为梯度溶剂来纯化。将级分冷冻干燥以产生77mg (16%)黄色固体。
LC-MS：m/z C25H26N5O6S2，计算值：542.1，实验值：542.9 (M+H)+。
。
实施例14. 制备化合物81
方案15
14a. 制备化合物80
将4-(羟甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(50mg，0.23mmol)溶解于乙醚和甲醇的50:50混合物(10ml)中且经10分钟的时间将浓盐酸(1mL)逐滴加入其中。将反应混合物搅拌1小时。蒸发溶剂。水作为与无水乙腈(3×20mL)的共沸物除去以得到作为盐酸盐的游离胺。将54 (50mg，0.15mmol) (根据实施例13d制备)溶解于DMSO (2mL)中，且加入哌啶-4-基甲醇盐酸盐(36mg，0.23mmol)、DIPEA (40.7mg，0.31mmol，0.05mL)和六氟磷酸((1H-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)氧基)三-(二甲氨基)鏻(V) (105mg，0.23mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应物质的进程通过LCMS监测。将反应混合物用水(50mL)稀释且用乙酸乙酯(2×15mL)萃取。将有机层过滤，干燥(Na2SO4)并浓缩以产生35mg (46%)作为棕色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C20H22N4O4S，计算值：414.1，实验值：415.1 (M+H)+。
14b. 制备化合物81
将80 (350mg，0.84mmol)溶解于无水氯仿(20mL)中且在0℃下经10分钟逐滴加入用CHCl3 (5mL)稀释的三氟化二乙氨基硫(0.11mL，0.84mmol)。通过TLC每10分钟监测该反应。此后，将反应混合物用饱和NaHCO3 (20mL)洗涤且用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将有机层过滤，干燥(Na2SO4)并浓缩以产生粗产物。粗产物通过半制备型HPLC使用乙腈:甲醇(50:50)和20%乙酸铵(pH 4.3)纯化。将1% HCl溶液(5mL)加到汇合的级分中，之后冷冻干燥以产生50mg (13%)作为黄色固体的所需要的产物。
LC-MS：m/z C20H21FN4O3S，计算值：416.1，实验值：417.1 (M+H)+。
.
实施例15. 制备化合物82
方案 16
将78 (50mg，0.14mmol)溶解于5mL无水二甲基甲酰胺中且将碳酸铯(90mg，0.28mmol)加入其中。将反应混合物维持在0℃下且将碘甲烷(39mg，0.28mmol，0.017mL)溶解于DMF (3mL)中并经10分钟逐滴缓慢加入。使反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物用水(30mL)稀释且用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)且在真空下蒸发。纯化在中性氧化铝上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-30%) (B)，8g，12mL/min洗脱来进行以得到19mg (35%)作为浅黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C19H22N4O3S，计算值：386.1，实验值：386.9 (M+H)+。
。
实施例16. 制备化合物87
方案 17
16a. 制备化合物83
将77 (100mg，0.28mmol)溶解于二噁烷(7mL)中且将4-二甲氨基吡啶(0.35mg，0.02mmol)加入其中。在室温下将溶解于二噁烷(3mL)中的Boc酸酐(69mg，0.32mmol)逐滴加入该反应混合物中且使其搅拌4小时。反应物质的进程通过HPLC监测，蒸馏出二噁烷且将粗反应混合物用水(15mL)稀释且用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)且真空蒸馏以获得粗化合物。纯化在中性氧化铝上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-15%) (B)，8g，12mL/min洗脱来进行以得到55mg (43%)作为浅黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C21H23N3O6S，计算值：445.3，实验值：445.9 (M+H)+。
。
16b. 制备化合物84
将83 (55mg，0.12mmol)溶解于2mL无水二甲基甲酰胺中且将碳酸铯(48mg，0.15mmol)加入其中。在0℃下将溶解于1mL DMF中的碘甲烷(19mg，0.13mmol，0.008mL)逐滴加到该反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物用水(3×20mL)稀释且用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(Na2SO4)且真空蒸馏以获得粗化合物。纯化在中性氧化铝上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-25%) (B)，8g，12mL/min洗脱来进行以得到30mg (53%)作为浅黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C22H25N3O6S，计算值：459.1，实验值：459.9 (M+H)+。
。
16c. 制备化合物85
将84 (30mg，0.06mmol)溶解于水和四氢呋喃的混合物(3mL，(1:1))中且将氢氧化锂(4.7mg，0.19mmol)加入其中。使反应混合物在室温下搅拌16小时。反应物质的进程通过HPLC监测。蒸馏出四氢呋喃且将1N HCl加入其中直至达到pH 6。将水层用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)且蒸镏以获得22mg (78%)作为浅黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C20H21N3O6S，计算值：431.1，实验值：431.9 (M+H)+。
。
16d. 制备化合物86
将85 (22mg，0.05mmol)、异丙胺(4.5mg，0.07mmol，0.006mL)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)-鏻试剂(45mg，0.10mmol)悬浮在无水DMSO (2mL)中且将DIPEA (13mg，0.10mmol，0.017mL)加入其中。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应物质的进程通过LCMS监测。将反应混合物用水(10mL)稀释且将所得混合物用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。将有机层用盐水(10mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发。将残留物与乙醚一起搅拌过夜。将19mg (91%)粗化合物直接用于下一反应。
LC-MS：m/z C23H28N4O5S，计算值：472.1，实验值：472.9 (M+H)+。
。
16e. 制备化合物87
将86 (19mg，0.04mmol)溶解于10mL无水二氯甲烷中且将1mL三氟乙酸加入其中。使反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物用水(10mL)猝灭且用二氯甲烷(5mL)萃取。将水层用饱和碳酸氢钠溶液中和且用二氯甲烷(2×45mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)且蒸馏以获得12mg粗化合物。使用乙酸乙酯和己烷重结晶以得到9mg (58%)的所要产物。
LC-MS：m/z C18H20N4O3S，计算值：372.1，实验值：372.9 (M+H)+。
。
实施例 17. 制备化合物 91
方案 18
17a. 制备化合物88
将1-Boc-哌嗪(1g，5.37mmol)和2,6-二氟吡啶(0.61g，5.37mmol)溶解于无水DMF (20mL)中且加入三乙胺(0.81g，8.05mmol，1.12mL)。将该混合物在回流下加热16小时。在冷却时，将反应物用饱和碳酸氢钠溶液(15mL)猝灭。在10分钟之后，将其用水(60mL)稀释且将混合物用乙酸乙酯(3×60mL)萃取。将合并的有机层用水(2×50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤且蒸发。将深色的油置于高真空下过夜以除去残留的DMF，之后进行色谱法在硅胶柱上用己烷(A):EtOAc (B) (0-15% (B)，12g，12mL/min)洗脱，以得到0.8g (53%)作为粘性黄色油的所要产物。
LC-MS: m/z C14H20FN3O2，计算值：281.2；实验值：282.1 (M+H)+。
17b. 制备化合物89
将88 (700mg，2.49mmol)溶解于无水二氯甲烷(30mL)中且将三氟乙酸(10mL)加入其中。使反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应用水猝灭，用饱和碳酸氢钠溶液中和。将水层用DCM (2×50mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发以获得330mg (73%)作为黄色油的所要产物。
LC-MS: m/z 计算值：C9H12FN3, 181.1；实验值：181.9 (M+H)+.
17c. 制备化合物90
向54 (0.39g，1.23mmol) (根据实施例13d制备)、89 (0.33g，1.84mmol)和六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)-鏻试剂(0.81g，1.84mmol)在无水DMSO (mL)中的混合物中加入DIPEA (0.32g，2.45mmol，0.43mL)，且将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应的进程通过LCMS监测。将反应混合物用水(25mL)稀释且将所得混合物用二氯甲烷(2×50mL)萃取。将有机层用盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下蒸发。纯化在中性氧化铝上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-40%) (B)，8g，12mL/min洗脱来进行以得到0.29g (47%)作为黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C23H21FN6O3S，计算值：480.1，实验值：480.9 (M+H)+。
。
17d. 制备化合物91
将90 (60mg，0.12mmol)溶解于二噁烷(5mL)中且将4-二甲氨基吡啶(1.2mg，0.012mmol)加入其中。将溶解于二噁烷(3mL)中的Boc酸酐(30mg，0.13mmol)逐滴加入该反应混合物中且在50℃下加热2小时。蒸馏出二噁烷且将粗反应混合物溶解于二氯甲烷(50mL)中并用水(15mL)、盐水(5mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)且在真空下蒸发以获得粗化合物。纯化在中性氧化铝上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-20%) (B)，8g，12mL/min洗脱来进行以得到10mg (13%)作为浅黄色固体的所要产物。
LC-MS：m/z C28H29 FN6O5S，计算值：580.1，实验值：580.9 (M+H)+。
。
实施例18. 制备5-氨基-N-(2-氟乙基)-3-(4-甲氧基苯基)-4-氧代-3,4-二氢噻吩并[3,4-d]哒嗪-1-甲酰胺(92)
将5-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-4-氧代-3,4-二氢噻吩并[3,4-d]哒嗪-1-甲酸(75mg，0.24mmol)、BOP (157mg，0.36mmol)和氯化2-氟乙铵(47.1mg，0.47mmol)溶解于无水DMSO (1.5mL)中且加入DIPEA (0.17mL，0.95mmol)。将该溶液在20℃下搅拌24小时。加入水(20mL)且用DCM (3×10mL)萃取。用盐水(10mL)洗涤合并的DCM，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残留物通过色谱法在硅胶上用二氯甲烷(A):甲醇(B) (0.5-10% B，10g，25CV，30mL/min)洗脱来纯化以得到作为黄色固体的产物(50mg，58%)。
LC-MS：C16H15FN4O3S，计算值：362.1；实验值：363.3 (M+H)+。
。
实施例19. 制备(R)-7-氨基-4-(3-氟吡咯烷-1-羰基)-2-(4-甲氧基苯基)噻吩并[3,4-d]哒嗪-1 (2H)-酮(93)
将5-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-4-氧代-3,4-二氢噻吩并[3,4-d]哒嗪-1-甲酸(75mg，0.24mmol)、BOP (157mg，0.36mmol)和(R)-3-氟吡咯烷-1-鎓氯化物(29.7mg，0.24mmol)溶解于无水DMSO (1.5mL)中且加入DIPEA (0.17mL，0.95mmol)。将该溶液在20℃下搅拌24小时。加入水(20mL)且用DCM (3×10mL)萃取。用盐水(10mL)萃取洗涤的合并的DCM，经无水硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残留物通过色谱法在硅胶上用二氯甲烷(A):甲醇(B) (0.5-10%B，25g，25CV，40mL/min)洗脱来纯化以得到作为黄色固体的产物(60mg，65%)。
LC-MS：计算值：C18H17FN4O3S, 388.1；实验值：389.2 (M+H)+。
实施例20. 制备(S)-7-氨基-4-(3-氟吡咯烷-1-羰基)-2-(4-甲氧基苯基)噻吩并[3,4-d]哒嗪-1 (2H)-酮(94)
将5-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-4-氧代-3,4-二氢噻吩并[3,4-d]哒嗪-1-甲酸(75mg，0.24mmol)、BOP (157mg，0.36mmol)和(S)-3-氟吡咯烷-1-鎓氯化物(29.7mg，0.24mmol)溶解于无水DMSO (1.5mL)中且加入DIPEA (0.17mL，0.95mmol)。将该溶液在20℃下搅拌24小时。加入水(20mL)且用DCM (3×10mL)萃取。用盐水(10mL)洗涤合并的DCM，经硫酸钠干燥，过滤并蒸发。残留物通过色谱法在硅胶上用二氯甲烷(A):甲醇(B) (0.5-10%B，25g，25CV，40mL/min)洗脱来纯化以得到作为黄色固体的产物(50mg，55%)。
LC-MS：C18H17FN4O3S，计算值：388.1；实验值：389.2 (M+H)+。
实施例21. 制备化合物99
方案19
21a. 制备化合物95
将76 (4g，12.7mmol) (根据实施例13b制备)悬浮在乙醇(66mL)和水(25mL)的混合物中。将0.511g (12.7mmol)氢氧化钠加到该反应物质中。将反应物在室温下搅拌16小时。将反应物质在真空下浓缩以除去乙醇。将残留物溶解于水(100mL)中且用乙酸乙酯(100mL)洗涤以除去杂质。通过加入1N HCl将水性反应物质的pH调节到pH 2。将所获得的沉淀物过滤并保持在60℃烘箱下以得到2.4g (63%)的所要产物。
LC-MS: m/z C14H11N3O4，计算值：285.1；实验值：285.8 (M+H)+。
。
21b. 制备化合物96
将95 (2g, 7.01mmol)悬浮在叔丁醇:DMF的混合物(40mL，(1:1))中。向该反应物质中加入三乙胺(1.06g，10.52mmol，1.458mL)。将该反应物质冷却且加入叠氮化磷酸三苯酯(2.31g，8.41mmol)。将该反应物质在0℃下再搅拌10分钟且开始在100℃下再加热5小时。将反应物质用水(30mL)猝灭且用乙酸乙酯(5×30mL)萃取。将有机层用水(3×20mL)洗涤且经无水Na2SO4 (15g)干燥。将有机层蒸发且经色谱法在氧化铝柱上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-40% (B)，8g，12mL/min)洗脱以得到1.0g (40%)作为黄色固体的纯产物。
LC-MS: m/z C18H20N4O4，计算值：356.1；实验值：357.15 (M+H)+。
。
21c. 制备化合物97
将96 (0.50g，1.4mmol)溶解于无水二甲基甲酰胺(10mL)中，加入氢化钠(0.04g，1.54mmol)，接着加入甲苯磺酸氟乙酯(0.46g，2.11mmol)。将该反应物质加热到95℃历时12小时。此后，将反应物质用水(10mL)猝灭且用乙酸乙酯(4×20mL)萃取。将有机层用水(3×20mL)洗涤且经无水Na2SO4 (15g)干燥并在真空下蒸发。粗物质通过色谱法在氧化铝柱上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-50% (B)，8g，12mL/min)洗脱以得到0.30g (53%)作为棕色液体的纯产物。
LC-MS: m/z C20H23FN4O4，计算值：402.1；实验值：402.9 (M+H)+。
。
21d. 制备化合物98
将97 (0.29g，0.716mmol)悬浮在乙醇(5mL)中，将硫(0.03g，1.07mmol)和吗啉(0.14g，1.43mmol，0.14mL)加入其中。随后将反应物质在微波中在100℃下加热35分钟。从该反应物质中蒸出乙醇且随后在乙酸乙酯(3×10mL)和水(3×10mL)之间分配。随后将合并的有机层经无水Na2SO4 (10g)干燥并蒸发至干。粗物质通过色谱法在氧化铝柱上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-60% (B)，8g，12mL/min)洗脱来纯化以得到0.15g (48%)作为淡褐色液体的纯产物。
LC-MS: m/z 计算值：C20H23FN4O4S, 434.14；实验值：434.9 (M+H)+
。
21e. 制备化合物99
将98 (0.150g，0.345mmol)溶解于无水二氯甲烷(1.5mL)中，使用冰-盐混合物冷却到0℃。向该反应物质中加入三氟乙酸:二氯甲烷(5mL，1:1)。将反应物质在室温下搅拌12小时。用水(5mL)猝灭且用饱和NaHCO3溶液(5mL)碱化。将有机层用DCM (4×5mL)萃取且经无水Na2SO4 (5g)干燥并蒸发至干。粗物质随后通过色谱法在氧化铝柱上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-60% (B)，8g，12mL/min)洗脱来纯化以得到0.06g (54%)作为灰白色固体的纯产物。
LC-MS: m/z C15H15FN4O2S，计算值：334.1；实验值：334.8 (M+H)+。
。
实施例22. 制备化合物100
方案 20
将96 (0.2g，0.561mmol)溶解于乙醇(2mL)中，加入硫(0.027g，0.84mmol)和吗啉(0.098g，1.12mmol，0.098mL)。随后将反应物质在微波中在100℃下加热35分钟。从该反应物质中蒸出乙醇且随后在乙酸乙酯(3×15mL)和水(3×15mL)之间分配。随后将合并的有机层经无水Na2SO4 (10g)干燥并蒸发至干。粗物质通过色谱法在氧化铝柱上用己烷(A):乙酸乙酯(B) (0-60% (B)，8g，12mL/min)洗脱来纯化以得到0.07g (32%)作为棕色固体的纯产物。
LC-MS: m/z C18H20N4O4S，计算值：388.1；实验值：388.9 (M+H)+。
。
实施例23. 制备化合物104
方案 21
23a. 制备化合物101
将对甲氧基苯胺(2g，16.23mmol)溶解于37%盐酸(3mL)、乙醇(5mL)和水(3mL)的混合物中。将反应混合物冷却到0℃，且逐滴加入亚硝酸钠(1.12g，16.23mmol)在水(7mL)中的溶液。将所得混合物在0℃下搅拌20分钟。加入在水(20mL)中的乙酸钠(8.61g，63.27mmol)和乙酰乙酸叔丁酯(2.56g，16.23mmol，2mL)且将反应混合物在0℃下搅拌2小时。将所形成的沉淀物过滤，用水洗涤且在高真空下干燥以得到4.08g (80%)棕色固体。
LC-MS：m/z C13H16N2O4，计算值：278.2，实验值：277 (M-)。
。
23b. 制备化合物102
将101 (4.0g，14.39mmol)、氰乙酸乙酯(3.25g，28.78mmol，1.61mL)和乙酸铵(4.43g，57.56mmol)在叔丁醇(5mL)中的混合物在微波中在100℃下照射45分钟。蒸馏所得混合物以除去叔丁醇且随后用水(100mL)稀释且用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。将合并的有机萃取物用水(30mL)、盐水(30mL)洗涤，经硫酸钠干燥且在真空下蒸发。将粗化合物在乙醇中加热并热过滤以产生2.8g (60%)暗黄色固体。
LC-MS：m/z C16H15N3O4，计算值：327.12，实验值：328.1 (M+H)+。
。
23c. 制备化合物103
将102 (2.8g，8.56mmol)、硫(0.42g，12.40mmol)和吗啉(1.3g，17.12mmol，1.1mL)在叔丁醇(7mL)中的混合物在微波中加热到100℃历时30分钟。在将混合物冷却之后，将所形成的沉淀物冷却且使用乙醇洗涤以产生0.76g (25%)淡褐色固体。
LC-MS：m/z C16H15N3O4S，计算值：359.09，实验值：360.09(M+H)+。
。
23d. 制备化合物104
将103 (0.76g，2.12mmol)、甲苯磺酸氟乙酯(0.92g，4.24mmol)和碳酸铯(1.22g，6.35mmol)在DMF (10mL)中的混合物在周围温度下搅拌16小时。将反应物在25mL水中猝灭且使用二氯甲烷(25mL×2)萃取。有机层经硫酸钠干燥并浓缩至干以产生0.42g粗产物。
LC-MS：m/z C19H20FN3O4S，计算值：405.12，实验值：406.12 (M+H)+。
。
实施例 24. 制备化合物 105
化合物105使用与在实施例13中所示相同的路径，从4-硝基苯胺而不是从对甲氧基苯胺开始来制备。
实施例 25. 制备化合物 [18F]56
方案 22
如实施例1中所述，将[18F]氟化物在Wheaton小瓶中共沸干燥。将该小瓶冷却到室温并加入甲磺酸酯57 (2.0mg，3.9μmol)在无水DMSO (0.2mL)中的溶液。将反应混合物在100℃下加热15分钟。如在实施例1中所述，分离并配制反应产物[18F] 56。
实施例 26. 制备化合物 [18F]59
方案 23
化合物[18F] 59按照公开的方案(R. Schirrmacher等，Tetr. Lett. 52 (2011) 1973-1976)使用[18F]氟化物/Kryptofix在叔戊醇中通过环氧化物60的亲核开环反应来获得。。
实施例 27. 制备化合物 [18F]106
方案 24
将[18F] 2-氟乙胺(100μL乙腈；根据M. Glaser等，J. Label. Compd. Radiopharm. 2012, 55, 326-331的方法获得)的溶液加到酸54 (2.0mg，6.3μmol)、BOP (4.2mg，9.4μmol)、DIPEA (57μL，325μmol)的混合物中。在室温下培育30分钟之后，酰胺[18F] 106通过制备型HPLC分离。
实施例 28. 制备化合物 [18F]67 和 [18F]90
方案 25
化合物[18F] 90通过使硝基前体70与K[18F]F-K222-碳酸酯复合物在DMSO中遵循如Maisonial等(J. Med. Chem. 54, 2011, 2745-2766)所述的程序反应来获得。化合物[18F]67以类似方式制备。
实施例 29. 制备化合物 [18F]92
方案 26
标记试剂[18F]甲苯磺酸氟乙酯遵循如W. Wadsak等(Nucl. Med. Biol. 34, 2007, 1019-1028)公开的协定获得。随后的N-烷基化和去保护以如E. Schirrmacher等(Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 2003, 2687-2692)所述类似的方式提供[18F] 92。
实施例 30. 制备化合物 [18F]93 和 [18F]94
方案 27
化合物[18F] 93和[18F] 93由相应的甲磺酸酯前体遵循如由X.-S. He等(J. label. Cpd. Radiopharm. 33, 1993, 573-581)所述的程序通过与K[18F]F-K222-碳酸酯复合物在DMSO中反应来获得。
方案 27
化合物[18F] 93和[18F] 93由相应的甲磺酸酯前体遵循如由X.-S. He等(J. label. Cpd. Radiopharm. 33, 1993, 573-581)所述的程序通过与K[18F]F-K222-碳酸酯复合物在DMSO中反应来获得。
实施例 31.
概要
针对结合阿尔茨海默病脑组织中的tau+神经元纤维缠结的能力、体内ADME性质和体内脑摄取筛选许多新化合物。总体而言，结果表明本发明化合物的选择优先结合缠结，体内新陈代谢稳定，可被放射性标记且在啮齿动物模型中具有高脑摄取。因此，这类化合物表现出用于tau成像剂的所要特性。
1 材料和方法
1.1 人类组织
来自患有阿尔茨海默氏症(AD)的患者和健康对照物的嗅内区皮层的人类脑组织样品自Tissue Solutions (Tissue Solutions Ltd, Glasgow, UK)获得。在通知书面同意之后收集组织样品，且在组织库解剖试样并在死后3-18小时的时间间隔速冻深低温保藏。将冷冻的组织包埋在TissueTek® (VWR)中并使用Microm HM560低温箱(Thermo Scientific)切片。将连续的12μm切片安装到SuperFrost®+载玻片(VWR)上并在-70℃下储存。
1.2 免疫组织化学
为了证明tau+神经元纤维缠结(NFTs)和β-淀粉样蛋白(Aβ)+蛋白斑在人类组织切片中的存在和位置，将整个试样中每第二十个组织切片加工以用针对聚集和超磷酸化tau及聚集Aβ产生的抗体免疫组织化学标记。
简要地讲，将组织切片解冻并固定在冰冷的70%乙醇中。在固定之后和在所有随后培育步骤之间用PBS漂洗所有组织切片。在固定之后，首先将组织切片用H2O2 (EnVision™试剂盒，Dako)培育。将欲加工用于Aβ免疫组织化学的组织切片通过在70%甲酸(Sigma-Aldrich)中培育10分钟进一步处理以便抗原复原。随后将所有组织切片用10%标准山羊乳清(Vector Labs)培育以阻断非特异性标记。在阻断步骤之后，用针对tau产生的一次抗体(AT8，小鼠单克隆抗体，1:20稀释度，Invitrogen)或针对Aβ产生的一次抗体(4G8，小鼠单克隆抗体，1:100稀释度，Covance)在室温(RT)下将组织切片培育1小时。
在用一次抗体培育之后，在室温下将组织切片用与针对小鼠IgG的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二次抗体培育30分钟。随后用色原3,3'-二氨基联苯胺(DAB)培育2-3分钟。对于二次标记(Dako)使用EnVision™ HRP试剂盒。最后，将切片用苏木精(Merck)复染，脱水且安装在DPX封固剂(VWR)中。用tau和Aβ标记的组织切片的图像使用连接到Leica显微镜的Nikon数字照相机且使用NIS Elements D软件(Nikon)捕集。用Photoshop®软件(Adobe)进一步加工图像。
1.3 Gallyas 银染色法
常规免疫组织化学依赖于通过一次抗体进行的特异性抗原的存在和检测。例如，在1.2章节中用于NFTs的免疫组织化学检测的tau抗体(AT8)检测超磷酸化tau聚集物的特定构象，但不会检测不太成熟的tau聚集物(Augustinack等，2002)。同样，进一步磷酸化引起AT8特异性tau抗原的构象变化和损失(Augustinack等，2002, Jeganathan等，2008)。因此，已提出使用不依赖于一种抗原的诸如Gallyas银染色法的不同方法是检测和标记NFTs的更灵敏且精确的方法(Rosenwald等，1993, Cullen等，1996, Uchihara等，2001, Uchihara, 2007)。因此，除了tau+和Aβ+免疫组织化学之外，将邻近载片的组织切片用于免疫组织化学，其中将其加工以用于Gallyas银染色法。
简要地讲，将组织切片解冻并在中性缓冲福尔马林(formalin)(VWR)中固定10分钟且首先在PBS中洗涤，随后在dH2O中洗涤。除非另有说明，否则在各个随后的培育步骤之间将组织切片在dH2O中漂洗。首先，将组织切片在5%高碘酸中培育5分钟，随后在碱性碘化银溶液中培育1分钟。随后在0.5%乙酸中洗涤10分钟，且随后将组织切片在显影溶液中培育5-30分钟。随后将组织切片在0.5%乙酸中洗涤并在dH2O中漂洗。随后在0.1%氯化金溶液中培育5分钟，且随后在1%硫代硫酸钠溶液中培育5分钟。随后将组织切片在自来水中漂洗且用0.1%核固红(nuclear fast red)复染2分钟。
最后，将组织切片在自来水中漂洗，脱水并安装在DPX封固剂(VWR)中。除非另有说明，否则用于Gallyas银染色法的所有试剂均自Sigma-Aldrich获得。用tau和Aβ标记的组织切片的图像使用连接到Leica显微镜的Nikon数字照相机且使用NIS Elements D软件(Nikon)捕集。用Photoshop®软件(Adobe)进一步加工图像。
1.4 组织结合测定
基于荧光评价化合物与人类AD组织中的tau+ NFTs和Aβ+蛋白斑的结合。所有试验化合物都具有固有荧光，且因此可使用荧光显微镜检测这些化合物与AD组织中的NFTs/蛋白斑的结合。在筛选中包括两种参考化合物：PiB (匹兹堡(Pittsburgh)化合物B (PiB)和FDDNP (荧光探针2-(1-(2-(N-(2-氟乙基)-N-甲基氨基)-萘-6-基)-乙叉基)-丙二腈)。已经报道PiB优选与Aβ+蛋白斑结合(Ikonomovic等，2008)，而FDDNP结合NFTs和蛋白斑两者(Agdeppa等，2001)。另外，还对组织筛选了氨基噻吩并哒嗪化合物(ATPZ)，由Ballatore等(Ballatore等，2010)首先报道的tau聚集抑制剂。
简要地讲，将组织切片解冻并固定在冰冷的70%乙醇中。在固定之后和在所有随后培育步骤之间用PBS漂洗所有组织切片。为了猝灭自发荧光，将组织切片首先在PBS中用0.25% KMnO4 (Sigma-Aldrich)培育12分钟，随后在PBS中用0.1% K2S2O5/0.1%乙二酸(两种试剂都来自Sigma-Aldrich)培育1分钟。将组织切片用在PBS中的2% BSA阻断10分钟，随后在室温下用100µM浓度的试验化合物培育1小时。在随后的测定中使用较低的试验浓度10µM和1µM进一步试验在100µM下具有阳性结合的化合物。最后，将组织切片在PBS中漂洗，且将其安装在SlowFade®封固剂(Invitrogen)中。标记的组织切片的图像使用连接到Leica显微镜的Nikon数字照相机且使用NIS Elements D软件(Nikon)捕集。用Photoshop®软件(Adobe)进一步加工图像。
1.5 体外 ADME 筛选
使用体外ADME测定组筛选试验化合物以便预测体内性质。使用以下测定：平行人工膜渗透性测定(PAMPA)，以测定细胞膜通道、在存在人类或大鼠血浆的情况下化合物的稳定性、在存在人类或大鼠肝微粒体的情况下化合物的稳定性并测定与人类血浆和大鼠脑匀浆中的蛋白质的结合。为了能够与据报道具有高体内脑摄取的两种化合物比较，在该筛选中包括PiB (Ikonomovic等，2008)和ATPZ (Ballatore等，2010)。
1.5.1 PAMPA
使用PAMPA测定来通过测量其穿过磷脂酰胆碱屏障的通道而确定化合物如何较好地穿过细胞膜。渗透系数>-6表明穿过脂膜的强渗透性且表示化合物能够穿过血脑屏障。
在室温下将10µM溶液在涂布有2%磷脂酰胆碱溶液的PDVF膜上培育5小时。使用LC-MS测量膜渗透率。
1.5.2 蛋白结合测定
蛋白结合测定提供了在体内化合物在血液或脑中的游离(未结合)分数的估计。在血液内高蛋白结合的化合物表明其潜在地不可用于穿过血脑屏障且可损害其新陈代谢或排泄，而与脑中的蛋白高度结合表明非特异性结合和缓慢排泄。该测定的期望标准为结合< 99%的试验化合物。
首先将试验化合物溶解于DMSO中，达到50μM的浓度。随后在人类血浆和大鼠脑匀浆的样品中培育(最后试验浓度1µM)。化合物与蛋白质在样品中的结合在培育5分钟和30分钟之后通过快速平衡透析测定。
1.5.3 肝微粒体稳定性测定
肝微粒体稳定性测定提供了体内化合物稳定性和新陈代谢速度的评估。该测定的期望标准是在30分钟之后有> 50%母体化合物。
将1μM化合物溶液在37℃下用大鼠或人类肝微粒体(20mg/mL)培育，在培育5分钟和30分钟之后使用LC-MS测定在培育之后剩余的母体化合物的量。
1.6 体内不带放射性的生物分布 (cold bio-distribution)
所有动物研究都遵循当地的规章制度。试验化合物通过静脉内(i.v)注射经未试验过的雄性Wistar大鼠的尾部静脉施用(50µg试验化合物/大鼠)。这些动物通过在注射(p.i)后2、10、30、60分钟使颈部脱位而处死。自各动物收集脑和血浆。试验化合物在血浆和脑匀浆中的浓度使用LS-MS测量，且计算为%化合物/g (%ID/g)。
1.7 用放射性标记的化合物的体内生物分布
所有动物研究都遵循当地的规章制度。将[18F]-放射性标记的化合物经未试验过的雄性C57Bl/6小鼠 (2MBq/小鼠)的尾部静脉静脉内注射。这些动物通过在注射(p.i)后2、10、30和60分钟使颈部脱位而牺牲。紧接着，解剖动物且使用Wallac γ计数器(Perkin-Elmer)测定器官、组织和血液的放射性。在试样中的样品浓度计算为%ID/g。
2 结果
2.1 人类 AD 组织的组织学
对每第20个切片做tau或Aβ标记以证实在人类组织切片中tau+ NFTs和Aβ+蛋白斑的存在和程度。邻近的组织切片使用Gallyas银染色法加工，该方法为用于标记NFTs和神经蛋白斑而不依赖于用于检测的抗体的灵敏方法。
在所有AD试样中观察到许多tau+ NFTs和神经蛋白斑以及Aβ+蛋白斑。相比之下，在来自对照受试者的组织切片中没有观察到NFTs或蛋白斑。在用Gallyas银染色法标记的组织切片中也观察到了NFTs和神经蛋白斑。与tau+免疫组织化学相比较，更成熟的NFTs用Gallyas银染色法检测。NFTs和蛋白斑的典型形态表示在图5中。
2.2 筛选与人类 AD 组织结合的化合物
基于荧光评估化合物与在人类AD组织中的tau+ NFTs和Aβ+蛋白斑的结合。所有试验化合物都具有固有荧光，且因此可使用荧光显微镜检测这些化合物与AD组织中的NFTs/蛋白斑的结合。组织测定的结果汇总在表2、表3和表4中。
在高试验浓度下，检测到两种参考化合物(PiB和FDDNP)与NFTs和蛋白斑两者的结合(表2)。在较低试验浓度下，PiB仅与蛋白斑结合。这些结果正如所料且由在文献(Agdeppa等，2001, Ikonomovic等，2008, Thompson等，2009)中的报道所支持。
观察到某些试验新化合物与NFTs结合(表2、表3和表4)。最值得注意的是试验化合物38和105 (表1、图6 (38 A-B、105 C-D))，它们在高试验浓度下与NFTs和蛋白斑两者结合，但在较低试验浓度下，优先与NFTs结合。
2.3 体外 ADME 筛选
使用多个体外测定筛选所选择的化合物以便预测体内性质。
结果汇总于表3中。数据表明，大多数来自该类别的筛选的新颖化合物满足用于成像剂的所期望体外标准，且预测这些化合物穿过血脑屏障且在体内新陈代谢稳定。
2.4 不带放射性的生物分布
使用在大鼠中的不带放射性的生物分布筛选所选择的化合物以测定脑摄取。结果汇总于表6中。数据证明，对于38和99，在2分钟p.i下摄取> 0.2% ID/g，这表明显著的脑摄取，但106具有低脑摄取。另外，38和99的清除率表明迅速脑摄取之后迅速清除。对于在大鼠中的不带放射性的生物分布，用于成像剂的基准标准为在2分钟p.i下的脑摄取> 0.2% ID/g和清除率>2。
2.5 用 [18F]- 放射性标记的化合物的生物分布
将所选择的化合物放射性标记且用于在小鼠中生物分布以测定脑摄取。结果汇总于表7中。数据表明对于[18F]-38(即，38*)在2分钟p.i下摄取> 1% ID/g。另外[18F]-38 (即，38*)的清除率证明迅速脑摄取之后迅速清除。对于放射性标记的化合物在小鼠中的生物分布，成像剂所需要的最低标准为在2分钟p.i下脑摄取> 1%ID/g和清除率>2。
表2. 组织结合测定的结果
- 没有染色； + 微弱染色； ++ 中等染色； +++ 强烈染色
表3. 组织结合测定的结果
1 由于试验化合物在UV范围内的荧光而无法测定结合
- 没有染色；+ 微弱染色；++ 中等染色；+++ 强烈染色
表4. 组织结合测定的结果
- 没有染色；+ 微弱染色；++ 中等染色；+++ 强烈染色
表5. 体外ADME筛选的结果汇总
表6. 在大鼠中不带放射性的生物分布的结果
表7. 放射性标记的化合物在小鼠中的生物分布的结果
参考文献
Agdeppa ED, Kepe V, Liu J, Flores-Torres S, Satyamurthy N, Petric A, Cole GM, Small GW, Huang SC, Barrio JR (2001) Binding characteristics of radiofluorinated 6-dialkylamino-2-naphthylethylidene derivatives as positron emission tomography imaging probes for beta-amyloid plaques in Alzheimer's disease (作为用于阿尔茨海默氏症中β-淀粉样蛋白斑的正电子发射断层摄影成像探针的放射氟化的6-二烷基氨基-萘基乙叉基衍生物的结合特征)。J Neurosci 21:RC189；
Augustinack JC, Schneider A, Mandelkow EM, Hyman BT (2002) Specific tau phosphorylation sites correlate with severity of neuronal cytopathology in Alzheimer's disease (与阿尔茨海默氏症中神经元细胞病理学的严重性相关的特定tau磷酸化)。Acta Neuropathol 103:26-35；
Ballatore C, Brunden KR, Piscitelli F, James MJ, Crowe A, Yao Y, Hyde E, Trojanowski JQ, Lee VM, Smith AB, 3rd (2010) Discovery of brain-penetrant, orally bioavailable aminothienopyridazine inhibitors of tau aggregation (脑渗透口服生物可利用氨基噻吩并哒嗪tau聚集抑制剂的发现)。J Med Chem 53:3739-3747；
Cullen KM, Halliday GM, Cartwright H, Kril JJ (1996) Improved selectivity and sensitivity in the visualization of neurofibrillary tangles, plaques and neuropil threads (在神经纤维缠结、蛋白斑和神经纤维丝的可视化中改进的选择性和灵敏性)。Neurodegeneration 5:177-187；
Ikonomovic MD, Klunk WE, Abrahamson EE, Mathis CA, Price JC, Tsopelas ND, Lopresti BJ, Ziolko S, Bi W, Paljug WR, DebnathmL, Hope CE, Isanski BA, Hamilton RL, DeKosky ST (2008) Post-mortem correlates of in vivo PiB-PET amyloid imaging in a typical case of Alzheimer's disease (在典型阿尔茨海默氏症中体内PiB-PET淀粉样蛋白成像的事后相关性)。Brain: a journal of neurology 131:1630-1645；
Jeganathan S, Hascher A, Chinnathambi S, Biernat J, Mandelkow EM, Mandelkow E (2008) Proline-directed pseudo-phosphorylation at AT8 and PHF1 epitopes induces a compaction of the paperclip folding of Tau and generates a pathological (MC-1) conformation (在AT8和PHF1表位脯氨酸引导的假性磷酸化引发Tau的纸用回形针折叠的压实并产生病理学(MC-1)构象)。J Biol Chem 283:32066-32076；
Rosenwald A, Reusche E, Ogomori K, Teichert HM (1993) Comparison of silver stainings and immunohistology for the detection of neurofibrillary tangles and extracellular cerebral amyloid in paraffin sections(用于检测石蜡切片中神经纤维缠结和胞外大脑淀粉样蛋白的银染色和免疫组织学的比较)。Acta Neuropathol 86:182-186；
Thompson PW, Ye L, Morgenstern JL, Sue L, Beach TG, Judd DJ, Shipley NJ, Libri V, Lockhart A (2009) Interaction of the amyloid imaging tracer FDDNP with hallmark Alzheimer's disease pathologies (淀粉样蛋白成像示踪剂FDDNP与阿尔茨海默氏症病理学标志的相互作用)。J Neurochem 109:623-630；
Uchihara T (2007) Silver diagnosis in neuropathology: principles, practice and revised interpretation (在神经病理学中的银诊断：原理、实践和修正的解释)。Acta Neuropathol 113:483-499；
Uchihara T, Nakamura A, Yamazaki M, Mori O (2001) Evolution from pretangle neurons to neurofibrillary tangles monitored by thiazin red combined with Gallyas method and double immunofluorescence (Evolution from pretangle neurons to neurofibrillary tangles monitored by thiazine red combined with Gallyas method and double immunofluorescence通过噻嗪红并结合Gallyas法和双重免疫荧光法监测预缠结的神经元到神经纤维缠结的进展)。Acta Neuropathol 101:535-539。
上文论述并提到的所有专利、杂志文章、公告及其他文献都通过引用结合到本文中。

Claims (23)

1.式I的化合物：
，
其中：
R1为烷基或Ar，其任选被至少一个烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基、酰胺或烷氧基卤基取代；
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)n卤基、-C(=O)(CH2)n杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基；
Ar为芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基；
n为0-10的整数；
或其放射性标记的衍生物。
2.权利要求1的化合物，其中Ar选自：
、 和。
3.式(Ia)的化合物：
，
其中：
R1为烷基或Ar，其任选被至少一个烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基、酰胺或烷氧基卤基取代；
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基；
Ar为芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基；
p为0-10的整数；
或其放射性标记的衍生物。
4.式(Ib)的化合物：
，
其中：
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基；
Ar为芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基；
p为0-10的整数；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
5.式(Ic)的化合物：
，
其中：
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)n卤基、-C(=O)(CH2)n杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
6.式(Ida)、(Idb)或(Idc)的化合物：
，
其中：
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
7.式(Iea)、(Ieb)或(Iec)的化合物：
，
其中：
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、硝基、芳基、杂芳基或杂芳基(CH2)p卤基取代；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；且
n为0-5的整数；
或其放射性标记的衍生物。
8.式(If)的化合物：
，
其中：
R3和R4各自如本文中对于式(I)化合物所定义；
R5为氢、烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基或酰胺；
n为0-5的整数；
R6和R7独立地为氢、烷基或炔基，或当与它们所连接的氮合在一起时形成任选被至少一个烷基、烷基卤基、卤素、羟基、硝基、芳基、杂环烷基、杂芳基或杂芳基卤基取代的杂芳基或杂环烷基；
或其放射性标记的衍生物。
9.下式的化合物：
。
10.下式的化合物：
。
11.下式的化合物：
。
12.下式的化合物：
，
其中I*为123I、124I或125I。
13.下式的化合物：
。
14.下式的化合物：
。
15.下式的化合物：
。
16.下式的化合物：
。
17.组合物，其包含权利要求1-16中任一项的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
18.制备权利要求1-16中任一项的化合物的方法。
19.使用权利要求1-16中任一项的化合物或其药用组合物成像的方法。
20.使用权利要求1-16中任一项的化合物或其药用组合物体外和/或体内检测tau聚集物的方法。
21.式(II)的化合物：
，
其中：
R1为烷基或Ar，其任选被至少一个烷基、卤素、羟基、烷氧基、卤烷氧基、酸、酯、氨基、硝基、酰胺、烷氧基卤基或烷氧基OPg取代；
R2独立地为烷基、炔基、酯、氨基、酰胺、酸、芳基、杂芳基、氨基烷基、-C(=O)烷基、-C(=O)芳基、-C(=O)杂芳基、-C(=O)杂环烷基、-C(=O)杂环烷基Ar、-C(=O)(CH2)pOpg、-C(=O)(CH2)p卤基、-C(=O)(CH2)p杂环基或-SO2Ar，其任选被烷基、烷基卤基、烷基OPg、卤素、硝基、芳基、杂芳基、杂芳基(CH2)p卤基或杂芳基(CH2)pOPg取代；
R3和R4独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基或杂芳基；
Ar为芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基；
p为0-10的整数；
Pg为H或保护或离去基团。
22.下式的化合物：
。
23.下式的化合物：
。
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