CN104130983B

CN104130983B - 冬虫夏草中国被毛孢漆酶、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN104130983B
Application number: CN201410308600.4A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 郑裕国; 林善; 薛亚平; 吴晖; 李邦良; 许静; 许峰; 王鸿艳
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT; Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Sino American East China Pharmaceutical Jiangdong Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT; Hangzhou Zhongmei Huadong Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104130983A

Abstract

本发明涉及两个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解木质素、酚类中的漆酶(Laccase)，编码这个酶的基因及其应用。所述漆酶的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的蛋白具有90％以上同源性，其编码基因核苷酸序列与SEQ ID No.2所示序列具有90％以上同源性。本发明从原理上对酚类合成苯醌进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解酚类中的漆酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化酚类制备相应的苯醌的酶对应编码基因的表达，赋予宿主漆酶的高表达性，为扩大漆酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

Description

冬虫夏草中国被毛孢漆酶、编码基因及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解木质素、酚类中的漆酶(Laccase)，编码这个酶的基因及其应用。

(二)背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。

但是，对冬虫夏草中国被毛孢中漆酶的研究几乎为空白，尤其在参与中国被毛孢木质素、酚类降解中的漆酶的研究上。

漆酶(EC:1.10.3.2)是一种含铜的演化还原酶，学名应为对二酚：二氧氧化还原酶，属于氧化酶的蓝铜家族。它们广泛地存在于自然界中，植物中有，更是在几乎所有的真菌中都有。这一类酶最初发现于漆树的树脂中，也因此得名。迄今，在昆虫和原核生物中，都已经鉴定到这一类型的酶。它们可以是分泌的酶，也可以定位在细胞内，因物种而异。

漆酶在不同的物种发挥不同的功能：在昆虫中，它们参与甲壳的硬化；在植物中，参与细胞壁形成，还与木质素化和去木质素有关；在芽孢杆菌中，则是和抗紫外线的孢子组装有关；在一些植物致病性真菌利用这类酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用，因此，漆酶也可看成是许多真菌疾病的毒力因子。

漆酶合适的底物分子是酚类，以及芳香性和脂肪性的胺类。它们催化的过程是底物的单电子氧化，生成相应的活性自由基。酶分子中含有4个铜原子构成的簇作为催化核心，实施氧化还原过程。在催化核心中铜原子的相互作用引起了强烈的电子吸收，产生了典型的蓝色。漆酶催化的循环过程，1分子的氧被还原为2分子的水同时4个底物分子氧化产生4个自由基，这些活性的中间物随后转变为二聚体、寡聚体和高聚物。

漆酶催化的反应可以因为其他分子存在与否而分为3种不同的模式。最简单的模式是，只有一种底物分子，并不存在其它分子。在这样的情况下，酶直接催化底物的氧化，完成整个反应。第二种情况是，在酶和底物中存在着一个中介分子，通过中介分子的氧化还原过程，进行电子的传递。这种情况更常见，因为有时需要氧化的分子太大，无法与酶活性中心—铜簇接近，此时需要中介分子，或者因为底物分子的氧化还原电位太高，反应不能一次完成，此时也需要中介分子的帮助。

1996年，Debbie S.Yaver等人从白腐担子菌Trametes villosa分离到了3个漆酶的基因，它们所编码的氨基酸序列和之前克隆岛的两个漆酶基因具有63-71％的同源性，它们分别包含12、10、11个内含子。

1997年，L.J.等人通过RNA-PCR的方法从木质素分解真菌Trametesversicolor中分离到了一个编码漆酶的cDNA，该cDNA编码一个498个氨基酸残基之前有一个22个残基的信号肽的漆酶同工酶。并且将该cDNA克隆到pHIL-D2载体上在AOX1启动子控制下的毕赤酵母中实现了表达。

2004年，张银波等人综合运用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNAEnds,RACE)和基因组步行等技术克隆到一个金针菇(Flammulina velutipes)的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA，经测序和BLAST比对分析表明该基因属于多铜氧化酶基因家族，与已发表的漆酶基因(AF176230)的同源性最高。

2008年，郭梅等人以白腐菌杂色云芝RNA为模板，通过RT-PCR获得不带自身信号肽漆酶Lccl基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pMETαA-Lccl，并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16，PCR结果表明Lccl基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上。

2011年，Fangfang Fan等人从一种白腐真菌Trametes.sp中克隆和表征到了一个漆酶基因lac48424-1的全长cDNA序列。它具有高产漆酶和脱色不同染料的能力，这个全长1563bp的cDNA编码一个全长499个氨基酸的成熟漆酶蛋白，并且前面含有的21个氨基酸的信号肽，这个推导出来的蛋白序列显示出和其他已知的酵母漆酶有很高的相似性，含有4个铜离子结合的保守位点。

2012年，华欣春等人通过反转录反应从Coprinopsis cinerea okayama中克隆得到一个漆酶laccase1，应用SignalP3.0Server软件分析其氨基酸序列后，设计不含信号肽序列的新引物扩增得到漆酶基因，构建重组酵母表达载体pPIC9K-lac1，电击转化毕赤酵母GS1115，并用甲醇诱导表达,之后研究重组酶的酶学性质。克隆得到的laccase1碱基数为1593bp，编码530个氨基酸,其中信号肽包含18个氨基酸。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示重组蛋白的大小约为65kDa。

2012年，张永亮等人利用RT-PCR方法，克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因，获得了其cDNA序列。该序列长2317bp，含有一个2295bp的完整开放阅读框，有8个外显子，7个内含子，编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质，其蛋白质的分子量和等电点分别为84.3kDa和6.61。推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫漆酶基因相应氨基酸序列有较高的同源性，该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征。

2012年，马文寅等人比较了几种不同真菌DNA提取方法对血红密孔菌基因组的提取的影响，根据genbank中真菌漆酶氨基酸保守序列设计的简并引物，以血红密孔菌基因组总DNA为模板，扩增到一条长度为1084bp的DNA片段。通过blast比对，其基因序列与密孔菌属同源性最高为99％，氨基酸同源性为88％，说明扩增的片段确为密孔菌漆酶基因。

2013年，Lin-Feng You等人从一个白腐真菌Ganoderma lucidum TR6中克隆岛了一个基因组的漆酶基因，它包含有2086bp的内含子，包含1563bp的开放读码框，推测成熟的蛋白由520个氨基酸组成，并且它的cDNA序列在毕赤酵母中实现了表达。

2013年，Lei Lu等人从从地衣芽孢杆菌中克隆到了一个热碱稳定性的漆酶基因，并且在毕赤酵母中实现了表达，该重组的漆酶分泌到培养基中的最大的酶活达到了227.9U/L。

但是，目前NCBI数据库中目前还检索不到中国被毛孢中漆酶的基因相关信息。

(三)发明内容

本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢降解木质素、酚类中的酶及其编码基因进行深入研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢降解木质素、酚类中的一种漆酶、以及编码的基因及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种参与中国被毛孢降解木质素、酚类中的漆酶，所述漆酶的氨基酸序列与SEQID No.1所示序列具有90％以上同源性。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

优选的，所述漆酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(记为lacA蛋白)；该酶可催化苯二酚制备相应的苯醌。

本发明述漆酶来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢。

由苯二酚经过漆酶的催化获得对应苯醌的路径如下所示：

本发明还涉及所述的漆酶在生物催化苯二酚制备相应的苯醌中的应用，所述应用为：以本发明漆酶催化苯二酚制备相应的苯醌。具体的，所述的应用为：将含漆酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)悬浮，超声细胞破碎后，取上清液作为催化剂，以0.1M的2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐水溶液为底物，于pH值为4.6的醋酸缓冲液中，37℃下水浴反应，反应结束后，将反应液离心，获得含苯醌的混合液，将混合液分离纯化，即获得苯醌(所述分离纯化的方法为本领域公知，通常采用分馏的方法，即利用苯二酚和苯醌的沸点不同来分离)。

所述底物(底物浓度为0.1M)的用量以2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐质量计，所述2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐的初始浓度为0.02M(终浓度)，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为4.8g/L(终浓度)。

所述催化剂按如下方法制备：将含漆酶基因的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取1mL培养物，将其转接(接种量：体积浓度为2％)于50mL含有终浓度50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s条件下超声破碎(优选3次，每次5min)，离心，取上清液即为催化剂。

本发明所述漆酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(记为lacA基因；lacA基因编码lacA蛋白)。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

所述的漆酶基因可用于构建能够生物催化苯二酚制备相应的苯醌的基因工程菌，以扩大漆酶的应用，具体为：构建含有所述漆酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌(优选E.coli BL21(DE3))中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有漆酶基因的菌体细胞。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

能够提供本发明所述冬虫夏草漆酶及其编码基因的菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)L0106，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

本发明的有益效果主要体现在：本发明从原理上对催化苯二酚制备相应的苯醌进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与降解木质素、酚类中的漆酶及其编码基因，本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节催化苯二酚制备相应的苯醌的酶对应编码基因的表达，赋予宿主漆酶的高表达性，为扩大漆酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。

(四)附图说明

图1为“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的甲醛变性凝胶电泳图；

图2为中国被毛孢漆酶催化循环过程注释图；

图3为漆酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图；

图4为克隆载体pMD18-T Vector与表达载体pET-28a物理图谱；

图5为重组克隆质粒pMD18-T/lacA物理图谱；

图6为重组表达质粒pET-28a/lacA构建过程示意图；

图7为重组表达质粒pET-28a/lacA物理图谱；

图8为漆酶蛋白的SDS-PAGE图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的培养

菌株来源：首先从青海采集天然冬虫夏草，并将其带回杭州进行分离筛选，得到了L0106菌株，并经菌种鉴定该菌株为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)，该菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2011278，已在先前申请的专利CN102373190A中披露。

将该菌种接种于斜面，培养基配方(此为固化之前的液体配方，按下述比例配制好之后再制成斜面)为：葡萄糖2.0％(w/v，1％表示100mL培养基中含有1g，下同)、玉米粉1.0％、土豆汁0.5％、糊精0.5％、酵母粉0.5％、麸皮1.0％、蚕蛹粉2.0％、蛋白胨1.0％、硫酸镁0.05％、磷酸二氢钾0.05％、琼脂粉1.0％，余量为水；在12～16℃培养25天；然后将菌种接种于发酵培养基，培养基配方为葡萄糖1.0％、糖蜜1.0％、蚕蛹粉0.5％、黄豆饼粉1.0％、酵母膏0.5％、硫酸镁0.01％、磷酸二氢钾0.02％，余量为水；置于摇床上，温度12～16℃培养25天，培养结束后在无菌条件下，进行固液分离，并将固体置于无菌器具，备用。

实施例2：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢总RNA的提取

用TRIzol试剂提取总RNA，步骤具体为：

1)液氮研磨：取1g新鲜菌体放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状，分装到预冷的1.5mL离心管中，加入1mL TRIzol试剂，混匀，冰上静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。

2)RNA分离：加入0.2mL氯仿，用力震荡混匀15s，冰上静置2～3min，4℃、12000rpm离心15min，分层，取上层水相，约600μL。

3)RNA沉淀：加入500μL异丙醇，在冰上静置10min，4℃、12000rpm离心10min，弃上清。

4)RNA洗涤：加入1mL75％(v/v)乙醇，将沉淀悬起，冰上静置10min，4℃、7500rpm离心15min；重复上面洗涤步骤，再洗一遍。

5)溶解RNA：将离心管置于冰上敞开干燥5～10min，加适量DEPC水溶解。

实施例3：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA样品测序

提取样品总RNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段(200～700bp)，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成第一条cDNA链，然后合成第二条cDNA链，再经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增，建好的测序文库用Illumina GA IIx进行测序。测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。除去原始测序reads中只含adaptor序列的reads，备以后续分析。

实施例4：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢RNA短读序列组装

使用短reads组装软件SOAPdenovo(Li,Zhu et al.De novo assembly of humangenomes with massively parallel short read sequencing[J].Genome Res,2010,20:265-272.)做转录组从头组装。SOAPdenovo首先将具有一定长度overlap的reads连成更长的不含N的Contig片段。然后将reads比对回Contig，通过paired-end reads确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，SOAPdenovo将这些Contig连在一起，中间未知序列用N表示，这样就得到Scaffold。进一步利用paired-end reads对Scaffold做补洞处理，最后得到含N最少，两端不能再延长的Unigene序列。最后，将Unigene序列与蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比对(evalue<0.00001)，取比对结果最好的蛋白确定Unigene的序列方向。如果不同库之间的比对结果有矛盾，则按nr、Swiss-Prot、KEGG和COG的优先级确定Unigene的序列方向，跟以上四个库皆对比不上的Unigene用软件ESTScan(Iseli,Jongeneel et al.ESTScan:a program for detecting,evaluating,andreconstructing potential coding regions in EST sequences[J].In Proceedingsof9th International Conference on Intelligent Systems for MolecularBiology.AAAIPress,Menlo Park,CA,pp.1999,138-148.)预测其编码区并确定序列的方向。对于能确定序列方向的Unigene给出其从5'到3'方向的序列，对于无法确定序列方向的Unigene给出组装软件得到的序列。

实施例5：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢Unigene功能注释

功能注释信息给出Unigene的蛋白功能注释、Pathway注释、COG功能注释和GeneOntology(GO)功能注释。首先，通过blastx将Unigene序列比对到蛋白数据库nr、Swiss-Prot、KEGG和COG(evalue<0.00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。根据KEGG注释信息能进一步得到Unigene的Pathway注释。将Unigene和COG数据库进行比对，预测Unigene可能的功能并对其做功能分类统计。根据nr注释信息，使用Blast2GO软件(Conesa,Gotz et al.Blast2GO:a universal toolfor annotation,visualization and analysis in functional genomics research[J].Bioinformatics,2005,21(18):3674-3676.)得到Unigene的GO注释信息。得到每个Unigene的GO注释后，用WEGO软件(Ye,Fang et al.WEGO:a web tool for plotting GOannotations[J].Nucleic Acids Research,2006,34:293-297.)对所有Unigene做GO功能分类统计，从宏观上认识该物种的基因功能分布特征。

实施例6：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢漆酶催化的循环过程的分析

图2是中国被毛孢漆酶催化的循环过程图。漆酶是一种典型的含铜糖蛋白，通常认为每个漆酶蛋白分子中含有4个铜离子。铜离子是漆酶催化反应的活性中心，在催化氧化过程中起决定作用。漆酶的催化氧化反应需要氧气作催化反应的中间物，同时分子氧被还原成水。在实际应用中，漆酶的氧化还原电势较低(300～800mV)，需要加入一些低分子质量化合物作为中介体(如l-羟基苯并三唑、4-羟基苯磺酸、3,5-二甲氧基苯甲醛等)，在氧化还原过程中起传递电子的作用漆酶一介体体系氧化机。从中国被毛孢转录组测序以及注释信息中检测到了漆酶的Unigene。通过NCBI中的ORF Finder软件在线检测，找出了这个基因的开放阅读框(SEQ ID No.2)并得到了相应的蛋白质序列(SEQ ID No.1)。

实施例7：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢漆酶基因引物设计

运用GENE RUNNER引物设计软件根据预测得到的各基因开放阅读框DNA序列设计引物，用于克隆“百令”生产菌中国被毛孢降解木质素、酚类的漆酶基因，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列如下所列：

lacA基因：正向引物5’AGAGAATTCATGTACATCCTCCACGAAGG3’

反向引物5’ATAGCGGCCGCTTACAGCCCACTGTCAA3’

lacA基因长度为318bp。

实施例8：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的制备

先按照实施例1提供的方法培养出中国被毛孢发酵菌丝体后，再按照实施例2所提供的方法对中国被毛孢进行总RNA的提取，得到总RNA后按下述进行“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢cDNA第一链的合成，用于后续各基因克隆实验。

采用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)从Total RNA中反转录合成cDNA第一链，实验步骤如下：

1)在Microtube管中配制下列混合液。

2)变性、退火操作有利于模板RNA的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转录反应效率，所以在PCR仪上进行变性、退火反应，条件设置如下：

65℃，5min

3)退火结束后离心数秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底部。

4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

5)在PCR仪上按下列条件进行反转录反应。

42℃ 15～30min

70℃ 15min

一般情况，在真核生物mRNA3’末端都有一个PolyA结构，A碱基的数量在十至几百个不等，利用这一结构可以利用Oligo(dT)引物，在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA第一链，本发明采用由TaKaRa独自开发的dT区域的序列(PrimeScript1st StrandcDNA Synthesis Kit中提供)为引物，如果获得的mRNA完整性较好，那么通过逆转录过程可以得到物种中所有酶蛋白编码基因的cDNA第一链。

实施例9：“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢漆酶基因的克隆、表达以及蛋白活力的检测

1、漆酶基因的PCR扩增

以实施例8中得到的cDNA第一链为模板，用实施例7中合成的漆酶基因引物：5’AGAGAATTCATGTACATCCTCCACGAAGG3’和5’ATAGCGGCCGCTTACAGCCCACTGTCAA3’进行Pfu DNA聚合酶PCR扩增反应，条件设置如下：

Pfu PCR扩增反应体系：

Pfu DNA Ploymerase PCR扩增条件：

2、漆酶基因PCR产物凝胶电泳检测

具体检测方法为：

1)将配制好的0.9％的琼脂糖凝胶用微波炉加热使其溶解均匀；

2)取15mL凝胶，待琼脂糖凝胶冷却至50℃左右时，加入1μL染色液Gold view，混合均匀后倒入电泳琼脂糖凝胶板上，除去气泡后插入点样梳；

3)琼脂糖凝胶板上凝胶凝固后，小心取出点样梳，将胶板放入电泳槽中(点样孔一端靠近电泳槽的负极)，在电泳槽中加入TAE电泳缓冲液；

4)取5μL样品然后加入6×Loading Buffer1.5μL和ddH₂O4μL混合后用移液枪上样，上样量为10μL；

5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色；

6)开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm；

7)当样品跑过琼脂糖凝胶板的2/3时可终止电泳；

8)切断电源后，将琼脂糖凝胶板上凝胶取出放入凝胶成像仪中观察、拍照。

转录组测序预测漆酶基因的大小为318bp，琼脂糖凝胶电泳结果表明已成功扩增出了漆酶基因，大小约为300bp。图3为“百令”生产菌中国被毛孢漆酶功能基因PCR产物凝胶电泳图。

3、漆酶基因PCR产物的加碱基A处理以及纯化

由于Pfu DNA聚合酶PCR产物末端为平端，所以在胶回收后还需进行加碱基A处理、纯化后才可用于T载体连接。胶回收产物加碱基A体系如下：

PCR仪中72℃加A碱基20min，最后用AxyPrep PCR清洁试剂盒纯化。

4、漆酶基因与克隆载体的连接

克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司(TaKaRa code D101A)，其物理图谱见图4，将步骤3分离纯化的漆酶基因与克隆载体连接构建重组质粒pMD18-T/lacA，，物理图谱见图5，连接体系和连接条件如下。

连接体系：

连接条件：16℃，16h；灭活：65℃，15min。

5、漆酶重组质粒pMD18-T/lacA的转化

将重组质粒pMD18-T/lacA转入大肠杆菌E. coli JM109中，构建携带漆酶基因的重组菌E. coli JM109/pMD18-T/lacA，具体步骤为：1)将10μL反应体系(步骤4的连接产物)转至感受态细胞E. coli JM109中，冰浴30min；2)热击：42℃，90s；3)冰浴：2-3min；4)加入800μL液体LB，37℃，250rpm，1h；5)涂布平板(含Amp抗性，终浓度50 μg/ml)；6)37℃培养箱培养过夜。

6、漆酶E.coli JM109 /pMD18-T/lacA阳性重组菌的筛选

菌落PCR可不必提取基因组DNA，而直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，该方法操作简便、快捷、可以快速鉴定菌落是否为含有目的质粒的阳性菌落，在转化鉴定中较为常见。实验中，将接种到液体培养基中对应的单菌落进行菌落PCR，以验证是否转入目的基因。首先，用牙签挑取单菌落加入含50μL无菌水的1.5mL离心管中，沸水浴30min，然后离心以上清作为模板，进行PCR扩增，PCR程序设定为Taq酶扩增一般程序。最后采用0.9％的琼脂糖凝胶电泳检测菌落PCR产物。

7、漆酶重组质粒pMD18-T/lacA的测序

对菌落PCR检测出的阳性重组菌接种至液体LB培养基，37℃、150rpm培养过夜后，取4mL菌液提取质粒，方法按AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提供的操作说明。测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。经测序验证，序列SEQ ID No.2已重组至pMD18-T/lacA中。

8、漆酶重组表达质粒pET-28a/lacA的构建

实验根据外源基因在大肠杆菌中表达的原则，以及表达载体pET-28a和漆酶基因酶切位点比对情况，确定了lacA用EcoRⅠ/NotⅠ双酶切位点，并对重组大肠杆菌E.coliJM109/pMD18-T/lacA进行液体LB试管摇床培养、重组质粒提取。

漆酶基因的重组质粒pMD18-T/lacA及表达载体pET-28a分别用EcoRⅠ/NotⅠ限制性内切酶在37℃分别酶切处理6h，酶切体系如下所示：

EcoRⅠ/NotⅠ双酶切体系：

酶切结束后，65℃灭活15min，然后分别用Axygen DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。

漆酶基因及表达载体pET-28a经双酶切、纯化后再用T4连接酶16℃连接过夜，构建重组表达质粒pET-28a/lacA，其构建过程见图6，构建得到的重组表达质粒pET-28a/lacA图谱见图7。连接体系组成如下：

连接体系：

9、漆酶重组表达质粒的转化以及阳性单克隆的筛选

将构建好的表达质粒热激转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中，然后涂布到含有卡那霉素(Kan)抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。从平板上随机挑选单菌落，以步骤7中合成的漆酶基因引物进行PCR扩增，挑选阳性克隆。

10、漆酶重组菌的诱导表达

将鉴定为阳性的单克隆接种于5mL含有Kan抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜。取1mL培养物，将其转接于50mL含有Kan抗性(终浓度50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600约为0.6～0.8左右。向培养物中分别加入一定浓度的IPTG(终浓度0.05mmol/L)诱导培养8h。收集菌体供电泳分析以及酶活检测。

11、漆酶重组菌表达产物SDS-PAGE分析

以转入空载体的E.coli BL21(DE3)菌及未加入诱导剂IPTG的重组菌作为对照。鉴定为阳性的重组菌经IPTG诱导培养7h后，取0.5mL诱导培养物，离心收集菌体，重悬于50μL蒸馏水中，加入50μL上样缓冲液，混匀后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，图8中的“A”泳道为大肠杆菌BL21(DE3)空细胞的SDS-PAGE图，“B”泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a加IPTG诱导后的SDS-PAGE图，“C”泳道为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/lacA未加IPTG的对照SDS-PAGE图，“D”泳道即为重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/lacA诱导表达的漆酶(经测序验证其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)的SDS-PAGE图。

12、漆酶重组菌的蛋白活力检测

ABTS，是测定漆酶酶活常用的底物。ABTS法测定漆酶酶活，通常采用醋酸钠溶液作为缓冲溶液，在反应体系内的终浓度常为0.02、0.05或0.10mol/L，pH主要在4～5之间。反应体系内ABTS的浓度在0.1～5mmol/L，常用终浓度为0.5mmol/L。测定反应一般在室温下进行，但有时为了避免H₂O₂的影响，选择在较高的温度进行，以去除H₂O₂。ABTS经漆酶作用后形成ABTS自由基，在420nm处ABTS自由基的吸光系数远大于底物ABTS，随着ABTS自由基浓度的增加，吸光度值变大，因此一般在420nm处检测OD值的变化。

(1)漆酶的蛋白活力检测

①0.1M的醋酸钠缓冲液：称取13.6g三水乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)于100mL的容量瓶中，并加水至刻度线处，保存于棕色瓶备用，用洁净的橡皮塞将瓶口盖严。

②1M2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐底物(ABTS)溶液：称取54.867g的ABTS用水溶于100mL的容量瓶中，并加水至刻度线处，保存于棕色瓶备用，用洁净的橡皮塞将瓶口盖严。

③ABTS自由基的标准溶液：ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS⁺·，能溶于水相或酸性乙醇介质中，将1mM的ABTS溶液经完全氧化后即可制备相应的ABTS自由基的标准溶液。按表1制作标准曲线，方程为：y＝3.9365x+0.016，R²＝0.9986，其中y为420nm下的吸光值，x为标准品的浓度。

表1 ABTS自由基的标准曲线

酶液制备：称取步骤10收集的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a/lacA湿菌体2g，用磷酸盐缓冲液(50mM、pH8.0)100mL悬浮，高压破碎仪(型号FS-600，上海生析超声仪器有限公司)在功率40％、破1s停1s条件下破碎3次(35Kpa)，每次5min，破碎混合液12000rpm离心10min后，取上清液即为粗酶液82.5ml。

漆酶转化体系：底物1mM的ABTS溶液预先37℃温度下预热，在50mL转化瓶中加入1mL的漆酶粗酶液、0.1M的醋酸钠缓冲液(pH值为4.6)1mL和0.1M的ABTS溶液3mL。37℃水浴反应10min后，12000r/min离心5min，终止反应。

测定上清液中ABTS自由基的量，漆酶分解ABTS为ABTS自由基，随着ABTS自由基的增加，A_420nm也逐渐变大，从ABTS自由基浓度一吸光度值曲线上可以得到任一吸光度值对应的ABTS自由基浓度。

一个漆酶单位(U)定义为：37℃、1min催化ABTS产生1μmol产物ABTS自由基所需要的酶量。

检测漆酶酶活的空白对照为煮沸20min后失活的粗酶液替代酶液。另外，同样条件下也检测了E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21(DE3)/pET-28a诱导后的粗酶液的活力，均未检测到漆酶酶活。

利用考马斯亮蓝法测得漆酶粗酶液中的蛋白含量为0.182mg/mL，通过Bandscan软件，对SDS-PAGE中的粗酶液条带含量进行分析，漆酶占总蛋白的15.6％，故参与催化反应的漆酶为0.182mg/mL×1mL×0.156＝0.028mg。根据酶活定义，漆酶的最大比酶活为：20.19μmol/(0.028mg×10min)＝72.1μmol/mg/min＝72.1U/mg。因此，漆酶重组菌所表达的漆酶的最大比酶活为72.1U/mg，上述反应的转化率为6.73％。比酶活计算公式为：比酶活＝酶活/漆酶的蛋白总量。转化率计算公式为：转化率＝(初始浓度-平衡浓度)/初始浓度。

Claims

1.一种冬虫夏草中国被毛孢漆酶，其特征在于所述漆酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的漆酶在生物催化苯二酚制备苯醌中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含漆酶基因的重组工程菌经诱导培养获得湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，离心，取上清液作为催化剂，以0.1M的2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐水溶液为底物，于pH值为4.6的醋酸缓冲液中，37℃下反应，反应结束后，将反应液离心，获得含苯醌的混合液。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述底物的用量以2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐质量计，所述2,2'-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐的初始浓度为0.02M，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计为4.8g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含漆酶的重组工程菌接种于含终浓度50μg/ml的Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养过夜，取培养物，以体积浓度2％接种量转接于含有50μg/ml Kan抗性的LB液体培养基中，37℃、250r/min培养至菌体浓度OD600为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.05mmol/L的IPTG诱导培养8h，收集湿菌体，将湿菌体在功率40％、破1s停1s条件下超声破碎，离心，取上清液即为催化剂。

6.一种权利要求1所述漆酶的编码基因。

7.如权利要求6所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

8.如权利要求6或7所述的编码基因在构建能够生物催化苯二酚制备苯醌的基因工程菌中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述漆酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有漆酶基因的菌体细胞。