CN104130219A - 红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法 - Google Patents

红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法 Download PDF

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Abstract

红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，本发明红豆杉枝叶为原料，对紫杉醇及其它三种紫杉烷的提取、分离及结构修饰进行了研究。利用树脂层析法对四种物质进行了高效快速的分离。并将其他三种紫杉烷转化成为抗癌药物紫杉醇或多西紫杉醇。所得结论如下：确立了四种物质的检测、提取、树脂层析以及纯化条件，并将纯化后的其他三种紫杉烷进行结构修饰，使之转化成紫杉醇或多西紫杉醇。

Description

红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法
技术领域
本发明以红豆杉枝叶为原料，对紫杉醇及其它三种紫杉烷的提取、分离及结构修饰进行了研究。
背景技术
目前，在紫杉醇及其它紫杉烷类化合物的提取分离、半合成研究中，研究最多的是从红豆杉植物中提取和分离紫杉醇。而对其它紫杉烷类化合物只进行了结构鉴定，并未进行深入研究。其中，提取方法报道的最多，几乎所有的提取方法均被用于紫杉烷的提取研究中，包括溶剂冷浸法，热回流法、索氏提取法等传统方法，以及后出现的超优势，但仅限于实验室研究，难以实现工业化生产。
此外，对紫杉烷类化合物的分离方法主要集中在萃取、硅胶柱层析、固相萃取和树脂吸附分离等几个方面，但是这些方法分别具有分离选择性差、使用有毒试剂、成本昂贵和分离效率低等制约性因素。在紫杉醇的研究领域中，美国最早发现并分离得到紫杉醇，对紫杉烷类化合物的研究起步最早，工艺和理论水平较为领先。对该类产品的推广使用普及率较高。无论是在提取分离方面、化学合成方面还是在抗癌活性方面，美国无疑是研究最早、最深入的国家。在1994年，美国科学家R.A.Holton和K.C.Nicolaou几乎同时宣布成功地合成了紫杉醇。然而，由于全合成步骤多、收率低、成本高等诸多限制因素，难以实现工业化生产，没有从根本上解决紫杉醇临床药源的问题。
我国拥有接近世界50％以上的红豆杉资源储量，从全球范围看，虽然红豆杉在美国、加拿大、法国、印度及中国都有分布，但亚洲的红豆杉储量最多。其中，在全球的11个品种中中国就有5种。虽然我国的红豆杉资源丰富，但对紫杉醇的规摸性提取发展较晚，直到90年代才开始。而且主要是为发达国家的临床用紫杉醇提供原料药，工艺水平薄弱，理论尚不完善。在实际应用中，生产规模小，市场普及率低。对资源利用造成了很严重的浪费、难以实现最大附加值。因此，从大规模工业生产和市场推广应用的现实角度长远考虑，生产工艺的环保化、低成本化与资源的合理利用显得尤为重要。总之，目前世界范围内对紫杉醇的需求仍是供不应求的，而临床用紫杉醇主要是通过植物提取和化学半合成而来。因此，对紫杉醇的提取分离、以及将其它在红豆杉中含量较大的紫杉醇类似物转化成为紫杉醇或者多西紫杉醇进行深入研究，不仅可以提高我国紫杉醇的发展步伐，增加农民收入，而且可以从很大程度上，为临床提供紫杉醇用药，为更多癌症患者解决药源缺少的问题。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明的目的是实现一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，利用树脂柱层析技术对红豆杉中紫杉醇等四种紫杉烷进行绿色高效分离，并采用结构修饰将传统工艺中被废弃的其他三种紫杉烷转化为抗癌药物紫杉醇或多西紫杉醇，增加了资源利用率。内容包括：利用树脂层析法对红豆杉粗提物中包括紫杉醇在内的四种紫杉烷类化合物进行快速高效的分离；采用正相-反相硅胶柱层析技术对四种紫杉烷进行进一步的纯化；将其它三种紫杉烷类物质通过系列结构修饰合成多西紫杉醇或紫杉醇。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
本发明以东北红豆杉枝叶为原料，对抗癌药物紫杉醇及其它三种重要的紫杉烷类化合物——10-脱乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇和三尖杉宁碱的提取、分离、纯化工艺进行了研究。在分离过程中，采用了新型树脂层析法对四种物质进行了高效快速的分离。并将10-脱乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇和三尖杉宁碱通过化学手段进行了结构改造，合成了抗癌药物紫杉醇和多紫杉醇，并得出以下结论：
一、确立了用于四种紫杉烷类物质定性和定量检测的HPLC条件：色谱柱Curosil-PFP 5μ(4.6mm×250mm)，检测波长234nm，流速1mL/min，进样量10μL，流动相为1-17min乙腈-水(25/75)，18-58min乙腈-水(37/63)体系，柱温保持为35℃。结果表明，在此色谱条件下对四种紫杉烷类物质进行检测，精密度高，重现性好，准确度高，适用于红豆杉及其他制剂中四种紫杉烷类化合物的质量分析检验。
二、确立了东北红豆杉枝叶中四种紫杉烷类化合物的最佳提取工艺参数：提取方法为超声提取；提取溶剂为80％乙醇溶液；提取固液比为1∶30；提取时间为30min；提取次数为3次。
三、确立了一种简单、成本低廉的循环分离与富集四种紫杉烷类化合物的树脂层析法：分别用30％、45％及60％的乙醇溶液进行梯度洗脱，所用体积分别为：20BV、30BV、10BV；流速为6BV/h；
四、确立了利用正相硅胶柱层析纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法；以及先经正相硅胶柱层析，后经反相硅胶柱层析纯化紫杉醇及三尖衫宁碱的方法。正相层析填料为300～400目硅胶；洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝3∶2(V/V)；反相层析填料为ODS(C18)，洗脱剂为35％乙睛-水溶液。
五、以纯化后三种紫杉烷类物质为底物，利用对活泼羟基的保护、与侧链的酯化缩合、肼解、氧化以及脱保护和乙酰化等手段，将抗癌活性较差的紫杉烷类物质转化成了紫杉醇或多西紫杉醇。并对合成得到的物质利用1H-NMR，13C-NMR等手段进行了结构鉴定。
综上，本发明充分利用了植物资源，提高了工艺附加值。为紫杉烷的产业化提供了强有力的技术支持和保障。发明采用的树脂层析-结构修饰技术可推广至植物活性成份研究的诸多领域，为其提供理论基础和积极的示范作用。
具体实施方式
首先，利用超声提取的方法，从红豆杉枝叶中提取四种紫杉烷类化合物，主要指标为：提取溶剂为80％乙醇溶液；提取固液比为1∶30；提取时间为30min；提取次数为3次。
将上述提取物经过循环分离与富集四种紫杉烷类化合物的树脂层析法分离得到的10-去乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱和紫杉醇的含量分别为5.12％，6.23％，15.97％和3.85％，分别是传统树脂分离方法所得各物质含量的13.54倍、12.19倍、10.41倍和20.48倍。四种化合物的回收率分别为94.96％、77.32％、88.09％和95.25％。
分离后的四种化合物利用正相硅胶柱层析纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法；以及先经正相硅胶柱层析，后经反相硅胶柱层析纯化紫杉醇及三尖衫宁碱的方法纯化后，10-去乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇、三尖杉宁碱和紫杉醇的纯度分别为90％，94％，93％和91％，收率分别为86.74％，85.12％，72.72％和43.02％。
纯化后三种紫杉烷类物质为底物，利用对活泼羟基的保护、与侧链的酯化缩合、肼解、氧化以及脱保护和乙酰化等手段，将抗癌活性较差的紫杉烷类物质转化成了紫杉醇或多西紫杉醇。
最后用四种紫杉烷类物质定性和定量检测的HPLC条件对四种紫杉烷类物质进行检测，生产合格的成品。
综上，本发明充分利用了植物资源，提高了工艺附加值。为紫杉烷的产业化提供了强有力的技术支持和保障。发明采用的树脂层析-结构修饰技术可推广至植物活性成份研究的诸多领域，为其提供理论基础和积极的示范作用。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但本发明并不限制于以上描述的具体实施例，其只是作为范例。对于本领域技术人员而言，任何对该进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作出的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (7)

1.一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，其特征在于，以东北红豆杉枝叶为原料，对抗癌药物紫杉醇及其它三种重要的紫杉烷类化合物：10-脱乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇和三尖杉宁碱的提取、分离、纯化并将10-脱乙酰基巴卡亭III、7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇和三尖杉宁碱通过化学手段进行了结构改造。
2.根据权利要求1所述的一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，其特征在于，所述提取技术最佳提取工艺参数：提取方法为超声提取；提取溶剂为80％乙醇溶液；提取固液比为1∶30；提取时间为30min；提取次数为3次。
3.根据权利要求1所述的一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，其特征在于，所述分离采用树脂层析法：分别用30％、45％及60％的乙醇溶液进行梯度洗脱，所用体积分别为：20BV、30BV、10BV；流速为6BV/h。
4.根据权利要求1所述的一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，其特征在于，所述纯化方法利用正相硅胶柱层析纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法；以及先经正相硅胶柱层析，后经反相硅胶柱层析纯化紫杉醇及三尖衫宁碱的方法。
5.根据权利要求1或4所述的一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，其特征在于，所述正相层析填料为300～400目硅胶；洗脱剂为乙酸乙酯∶石油醚＝3∶2(V/V)；反相层析填料为ODS(C18)，洗脱剂为35％乙睛-水溶液。
6.根据权利要求1所述的一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，其特征在于，利用对活泼羟基的保护、与侧链的酯化缩合、肼解、氧化以及脱保护和乙酰化等手段，将抗癌活性较差的紫杉烷类物质转化成了紫杉醇或多西紫杉醇。
7.根据权利要求1或6所述的一种红豆杉中抗癌成分的绿色分离及结构方法，其特征在于，所述合成得到的物质利用1H-NMR，13C-NMR等手段进行了结构鉴定。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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