CN104111243B - 一种荧光比率测量系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光比率测量系统及方法，该系统基于典型的马赫‑曾德尔干涉仪光路采集样品受激发射时的荧光信号，由光路中的分光镜将样品受激发射的荧光信号分解为透射光束和反射光束，分别在两束光的传播光路中放置干涉滤光片和互补通光光栏，由单一CCD同时采集两束不同发射波长的荧光信号强度。通过标准样品组建立待测物理量与两束不同发射波长荧光信号强度比率之间的标准曲线，进而由待测样品测得的荧光比率，应用预先建立的标准曲线确定样品待测物理量。本发明适用于所有的基于荧光比率的测量系统，包括传统的单一CCD两次采集、双CCD同时采集获取荧光比率的情形。本发明在pH值、温度及厚度等测量领域具有广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于荧光分析技术领域，具体地说，涉及一种荧光比率测量系统及方法。
背景技术
荧光分析技术由于具有选择性好、灵敏度高、方便简单、准确快速、线性范围宽等优点，在生物、化学、医学和环境监测等领域得到了广泛应用。荧光分析法是根据单个荧光发射峰的荧光强度与待测物理量(如溶液pH值、样品的温度和样品中的光程)之间关系来分析检测待测物理量，但是该分析方法对环境因素敏感，容易受到较多外界因素干扰。而荧光比率法则是利用了不同位置的两个荧光发射峰的强度的比值来进行检测，能够很好的解决荧光分析法中的上述问题，从而可以提高该方法的选择性、灵敏度和检测范围。
荧光比率法中获得不同位置的两个荧光发射峰的强度的比值，通常有如下两种实现方法：方法一是通过切换单一光电传感器(如CCD)前面的荧光滤光片，使其中心波长分别对应两个不同的荧光发射峰，由分两次采集到的两个不同荧光发射峰的强度计算对应的荧光比率值；该方法在单一光电传感器采集单个荧光发射峰强度的过程中，易受光源强度变化和仪器的灵敏度影响、且整个测量过程耗时较长。方法二是使用两个光电传感器(如CCD)，且置于每个光电传感器前面的荧光滤光片的中心波长对应一个不同的荧光发射峰，由两个光电传感器同时采集到的两个不同荧光发射峰的强度计算对应的荧光比率值；方法二尽管克服了方法一中光源强度变化对荧光比率的影响，但需要使用两个光电传感器，而荧光强度图像采集中普遍使用高性能的科学级制冷CCD，双CCD测量系统不仅要考虑系统较高的投资成本，还需考虑两个CCD响应性能的差异对测量的影响；另外，方法二中用于荧光比率计算的两幅荧光强度图像来自两个光电传感器，在进行荧光比率计算之前，必须对两幅荧光强度图像上所选择的荧光比率计算区域进行图像相关处理，以保证两幅荧光强度图像上的荧光比率计算区域对应于测试样品上的同一目标区域，可见，复杂且耗时的图像相关处理操作也是采用方法二所要考虑的因素之一。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种不受光源强度变化影响、且耗时少、成本低的荧光比率测量系统及方法。其技术方案如下：
一种荧光比率测量系统，包括用于提供激发光波的光源1、准直扩束透镜组2、激发滤光片3、二色分光镜4、用于产生受激发射荧光的样品5中的第一种荧光染料6和第二种荧光染料7、用于分光的第一分光镜8和第二分光镜15、用于获得第一发射波长荧光的第一发射滤光片9和第二发射波长荧光的第二发射滤光片12、用于在单一CCD上获得两束荧光信号强度图像分布面积相等且对称的第一互补通光光栏11和第二互补通光光栏14；样品5受激发射荧光传播到第一分光镜8被分为透射光与反射光，沿透射光的传播方向依次放置有第一发射滤光片9、第一反射镜10、第一互补通光光栏11；沿第一分光镜8上反射光的传播方向依次放置有第二发射滤光片12、第二反射镜13、第二互补通光光栏14；通过第一互补通光光栏11后的第一发射波长荧光OⅠ经第二分光镜15的反射，通过第二互补通光光栏14后的第二发射波长荧光OⅡ经第二分光镜15的透射，反射和透射的荧光经置于第二分光镜15后调焦镜头16的聚焦，在CCD17上形成两幅分布面积相等且对称的荧光信号强度图像，并存储在计算机18上。
优选地，所述第一互补通光光栏11和第二互补通光光栏14的结构相同且可同步旋转，不仅每个互补通光光栏上的白色通光部分和黑色挡光部分对称互补，而且第一互补通光光栏11上的白色通光部分和黑色挡光部分分别与第二互补通光光栏14上的黑色挡光部分与白色通光部分对应互补，保证第一发射波长荧光和第二发射波长荧光在CCD17上形成两幅分布面积相等且对称的荧光信号强度图像；所述第一互补通光光栏11和第二互补通光光栏14，还包括在单一通光光栏上通光部分和挡光部分对称且互补分布，但通光部分和挡光部分可以具有其它的几何形状和不同的空间相对位置。
优选地，光源1包括激光器、LED光源、UV光源。
基于附图所示系统的一种荧光比率测量方法，包括以下步骤：
第一步：样品5受入射光波激发时发射的荧光传播到第一分光镜8被分为透射光与反射光两束光；所述的透射光束通过第一发射滤光片9和第一互补通光光栏11后，作为用于荧光比率计算的第一发射波长荧光OⅠ；所述的反射光束通过第二发射滤光片12和第二互补通光光栏14后，作为用于荧光比率计算的第二发射波长荧光OⅡ；
第二步：第一发射波长荧光OⅠ经第二分光镜15的反射，第二发射波长荧光OⅡ经第二分光镜15的透射，反射和透射的荧光同方向平行传播，经由调焦镜头16在CCD17上形成分布面积相等且对称的两幅荧光信号强度图像，并存储在计算机18上；
第三步：将OⅠ与OⅡ在CCD17上相等且对称分布面积上的荧光强度平均值IⅠ与IⅡ的比值作为荧光比率，通过一组标准样品5建立荧光比率与待测物理量之间的标准曲线；
第四步：基于标准样品组预先建立的标准曲线，由所测得的待测样品5的荧光比率确定其对应的待测物理量。
本发明的有益效果：
1、通过采用典型的马赫-曾德尔干涉仪光路采集样品受激发射时的荧光信号，将样品光分解为两束光，便于在两束光的传播光路中放置干涉滤光片和互补通光光栏，获得荧光比率计算所需的两束不同发射波长荧光；2、本发明荧光比率测量系统采用在两束光的传播光路中放置相同但互补对称的通光光栏，可由单一CCD同时采集两幅用于荧光比率计算的两束不同发射波长的荧光信号强度图像；3、本发明荧光比率测量系统与单一CCD分两次采集两束不同发射波长的荧光信号强度图像相比，具有不受光源强度变化影响、且耗时少的优点；4、本发明荧光比率测量系统与双CCD同时采集两束不同发射波长的荧光信号强度图像相比，由于不必进行双CCD荧光信号强度图像之间的相关处理，操作过程简捷、且测量系统成本低；5、通过改变互补通光光栏上通光部分和挡光部分的面积大小、几何形状和空间相对位置，还能够实现对样品上不同目标区域的同时观测。因此，本发明系统应用领域广泛，具有很好的实用价值与经济价值。
附图说明
图1是本发明荧光比率测量系统的结构示意图，图中：1：光源；2：准直扩束透镜组；3：激发滤光片；4：二色分光镜；5：样品；6：第一种荧光染料；7：第二种荧光染料；8：第一分光镜；9：第一发射滤光片；10：第一反射镜；11：第一互补通光光栏(白色通光部分与黑色挡光部分对称互补)；12：第二发射滤光片；13：第二反射镜；14：第二互补通光光栏(白色通光部分和黑色挡光部分对称互补，而且分别与第一互补通光光栏上的黑色挡光部分与白色通光部分对应互补)；15：第二分光镜；16：调焦镜头；17：CCD；18：计算机；OⅠ：样品第一发射波长荧光；OⅡ：样品第二发射波长荧光。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
参照图1，一种荧光比率测量系统，包括用于提供激发光波的光源1、准直扩束透镜组2、激发滤光片3、二色分光镜4、用于产生受激发射荧光的样品5中的第一种荧光染料6和第二种荧光染料7，包括荧光染料6和染料荧光7用同一波长同时激发、或用单一波长先激发荧光染料6或荧光染料7，再由荧光染料6或荧光染料7的受激发射光激发染料7或染料6，用于分光的第一分光镜8和第二分光镜15、用于获得第一发射波长荧光的第一发射滤光片9和第二发射波长荧光的第二发射滤光片12、用于获得两束荧光信号强度图像分布面积相等且对称的第一互补通光光栏11和第二互补通光光栏14、用于进行图像采集的调焦镜头16和单一CCD17、用于进行图像存储及处理的计算机18；光源1发出的激发光波经准直扩束透镜组2的准直和扩束后，传向激发滤光片3，通过激发滤光片3的透射光经二色分光镜4的反射后，在标准样品5表面入射；标准样品5中分布的第一种荧光染料6和第二种荧光染料7，在入射光波的激发下受激发射的荧光作为携带样品测量信息的样品光；该样品光经二色分光镜4透射后沿水平方向传播到第一分光镜8被分为相互垂直的透射光束和反射光束；从第一分光镜8透射的光束，沿原来水平方向通过第一发射滤光片9，传播到第一反射镜10后，方向改变90°传播到第一互补通光光栏11，从第一互补通光光栏11透射的光束：OⅠ，作为荧光比率中的第一发射波长荧光；被第一分光镜8反射的光束沿垂直于原入射光的方向，传播到第二反射镜13后，方向改变90°传播到第二互补通光光栏14，从第二互补通光光栏14透射的光束：OⅡ，作为荧光比率中的第二发射波长荧光；OⅠ经第二分光镜15反射，OⅡ经第二分光镜15透射，反射光和透射光沿水平方向平行传播，通过调焦镜头16后由CCD17所采集；第一互补通光光栏11与第二互补通光光栏14相同，但两者的白色通光部分和黑色挡光部分互补且对称，第一发射波长荧光OⅠ与第二发射波长荧光OⅡ在CCD上的荧光强度图像分布面积相等且对称，OⅠ与OⅡ在CCD17上相等且对称分布面积上的荧光强度平均值IⅠ与IⅡ用于荧光比率的计算，进而由标准样品组建立待测物理量与荧光比率之间的标准曲线，并应用于其后待测样品5的相同物理量的确定，该过程在计算机18上通过软件完成。
所述第一互补通光光栏11和第二互补通光光栏14结构相同且可同步旋转，不仅每个互补通光光栏上的白色通光部分和黑色挡光部分对称互补，而且第一互补通光光栏11上的白色通光部分和黑色挡光部分分别与第二互补通光光栏14上的黑色挡光部分与白色通光部分对应互补，保证第一发射波长荧光和第二发射波长荧光在CCD17上形成两幅分布面积相等且对称的荧光信号强度图像；第一互补通光光栏11和第二互补通光光栏14，还包括在单一通光光栏上通光部分和挡光部分对称且互补分布，但通光部分和挡光部分可以具有其它的几何形状和不同的空间相对位置。
光源1包括激光器、LED光源、UV光源。
基于附图所示系统的荧光比率测量方法，包括以下步骤：
第一步：样品5受入射光波激发时发射的荧光传播到第一分光镜8被分为透射光与反射光两束光；所述的透射光束通过第一发射滤光片9和第一互补通光光栏11后，作为用于荧光比率计算的第一发射波长荧光OⅠ；所述的反射光束通过第二发射滤光片12和第一互补通光光栏14后，作为用于荧光比率计算的第二发射波长荧光OⅡ；
第二步：荧光OⅠ经第二分光镜15反射，荧光OⅡ经第二分光镜15透射，反射光和透射光同方向平行传播，经由调焦镜头16在CCD17上形成分布面积相等且对称的两幅荧光信号强度图像，并存储在计算机18上；
第三步：将OⅠ与OⅡ在CCD17上相等且对称分布面积上的荧光强度平均值IⅠ与IⅡ的比值作为荧光比率，通过一组标准样品5建立荧光比率与待测物理量之间的标准曲线；
第四步：基于标准样品组预先建立的标准曲线，由所测得的待测样品5的荧光比率确定其对应的待测物理量。
本发明在具体应用过程中：光源1发出的激发光波经准直扩束透镜组2准直和扩束后，传向激发滤光片3，通过激发滤光片3的透射光经二色分光镜4的反射后，在标准样品5表面入射；标准样品5中分布的第一种荧光染料6和第二种荧光染料7，在入射光波的激发下受激发射的荧光作为携带样品测量信息的样品光；该样品光经二色分光镜4透射后沿水平方向传播到第一分光镜8被分为相互垂直的透射光束和反射光束；从第一分光镜8透射的光束，沿原来水平方向通过第一发射滤光片9，传播到第一反射镜10后，方向改变90°传播到第一互补通光光栏11，从第一互补通光光栏11透射的光束：OⅠ，作为荧光比率中的第一发射波长荧光；被第一分光镜8反射的光束沿垂直于原入射光的方向，传播到第二反射镜13后，方向改变90°传播到第二互补通光光栏14，从第二互补通光光栏14透射的光束：OⅡ，作为荧光比率中的第二发射波长荧光；OⅠ经第二分光镜15反射，OⅡ经第二分光镜15透射，反射光和透射光沿水平方向平行传播，通过调焦镜头16后由CCD17所采集；第一互补通光光栏11与第二互补通光光栏14相同，但两者的白色通光部分和黑色挡光部分互补，保证第一发射波长荧光OⅠ与第二发射波长荧光OⅡ在CCD17上形成的两幅荧光强度图像分布面积相等且对称；OⅠ与OⅡ在CCD17上相等且对称分布面积上的荧光强度平均值IⅠ与IⅡ的比值作为荧光比率，用于建立由标准样品组获得的荧光比率与待测物理量之间的标准曲线，该标准曲线被应用于其后由待测样品5测得的荧光比率确定其对应物理量，该过程在计算机18上通过软件完成。
本发明在基于荧光比率的测量方面具有广泛的实用价值与应用前景，特别是在pH值、温度及厚度等测量领域。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种荧光比率测量系统，其特征在于：包括用于提供激发光波的光源(1)、准直扩束透镜组(2)、激发滤光片(3)、二色分光镜(4)、用于产生受激发射荧光的样品(5)中的第一荧光染料(6)和第二种荧光染料(7)、用于分光的第一分光镜(8)和第二分光镜(15)、用于获得第一发射波长荧光的第一发射滤光片(9)和第二发射波长荧光的第二发射滤光片(12)、用于获得两束荧光信号强度图像分布面积相等且对称的第一互补通光光栏(11)和第二互补通光光栏(14)；用于进行图像采集的调焦镜头(16)和单一CCD(17)、用于进行图像存储及处理的计算机(18)；光源(1)发出的激发光波经准直扩束透镜组(2)的准直和扩束后，传向激发滤光片(3)，通过激发滤光片(3)的透射光经二色分光镜(4)的反射后，在标准样品(5)表面入射；样品(5)受激发射荧光透过二色分光镜(4)传播到第一分光镜(8)被分为透射光与反射光，沿透射光的传播方向依次放置有第一发射滤光片(9)、第一反射镜(10)、第一互补通光光栏(11)；沿第一分光镜(8)的反射光传播方向依次放置有第二发射滤光片(12)、第二反射镜(13)、第二互补通光光栏(14)；通过第一互补通光光栏(11)后的第一发射波长荧光OⅠ经第二分光镜(15)的反射，通过第二互补通光光栏(14)后的第二发射波长荧光OⅡ经第二分光镜(15)的透射，反射和透射的荧光经置于第二分光镜(15)后调焦镜头(16)的聚焦，在CCD(17)上形成两幅荧光信号强度图像，并存储在计算机(18)上。
2.根据权利要求1所述的荧光比率测量系统，其特征在于：所述第一互补通光光栏(11)和第二互补通光光栏(14)结构相同且可同步旋转，不仅每个互补通光光栏上的白色通光部分和黑色挡光部分对称互补，而且第一互补通光光栏(11)上的白色通光部分和黑色挡光部分分别与第二互补通光光栏(14)上的黑色挡光部分与白色通光部分对应互补，保证第一发射波长荧光和第二发射波长荧光在CCD(17)上形成两幅分布面积相等且对称的荧光信号强度图像；所述第一互补通光光栏(11)和第二互补通光光栏(14)，还包括在单一通光光栏上通光部分和挡光部分对称且互补分布，但通光部分和挡光部分具有其它的几何形状和不同的空间相对位置。
3.根据权利要求1所述的荧光比率测量系统，其特征在于：光源(1)包括激光器、LED光源、UV光源。
4.一种基于权利要求1-3任一项所述的荧光比率测量系统的荧光比率测量方法，其特征在于：包括以下步骤：
第一步：样品(5)受入射光波激发时发射的荧光传播到第一分光镜(8)被分为透射光与反射光两束光；所述的透射光束通过第一发射滤光片(9)和第一互补通光光栏(11)后，作为用于荧光比率计算的第一发射波长荧光OⅠ；所述的反射光束通过第二发射滤光片(12)和第二互补通光光栏(14)后，作为用于荧光比率计算的第二发射波长荧光OⅡ；
第二步：荧光OⅠ经第二分光镜(15)反射，荧光OⅡ经第二分光镜(15)透射，反射和透射的荧光同方向平行传播，经由调焦镜头(16)在CCD(17)上形成分布面积相等且对称的两幅荧光信号强度图像，并存储在计算机(18)上；
第三步：将OⅠ与OⅡ在CCD(17)上相等且对称分布面积上的荧光强度平均值IⅠ与IⅡ的比值作为荧光比率，通过一组标准样品(5)建立荧光比率与待测物理量之间的标准曲线；
第四步：基于标准样品组预先建立的标准曲线，由所测得的待测样品(5)的荧光比率确定其对应的待测物理量。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 212013 Zhenjiang City, Jiangsu Province University Road, No. 301 Applicant after: Jiangsu University Address before: 212000 No. 301, Xuefu Road, Yangzhou, Jiangsu Applicant before: Jiangsu University |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Hua Shiqun Inventor after: Ruan Xiaoxia Inventor after: Luo Ying Inventor before: Hua Shiqun |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170104 Termination date: 20170711 |