CN104099389A

CN104099389A - 一种新的酪蛋白衍生物及其制备方法

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Publication number: CN104099389A
Application number: CN201410312926.4A
Authority: CN
Inventors: 张玉琼; 牛宇戈; 俞良莉
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2034-07-02
Also published as: CN104099389B

Abstract

本发明提供了一种酪蛋白衍生物的制备方法，包括步骤：(a)提供一含有酪蛋白的水相溶液，和一含有C6-C24的胺或其组合的有机相溶液；(b)将(a)中所述的水相溶液和有机相溶液接触，并在合成酶的作用下反应；(c)收集(b)反应后的反应液，从而获得所述的酪蛋白衍生物。本发明方法制备获得的含长烃基链的酪蛋白具有乳化活性高、热稳定性好的优势，且反应条件温和，副产物少，可广泛应用于食品及医药领域。

Description

一种新的酪蛋白衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质改造领域，尤其涉及一种新的酪蛋白衍生物及其制备方法。

背景技术

酪蛋白是哺乳类奶的主要成份，在牛奶中含量达80％。牛乳经脱脂、酸沉淀、脱水、干燥后制成粉末状制品即为酪蛋白，又称干酪素。酪蛋白及其制品有着较高的营养价值和良好的功能特性，适合作为乳化剂、增稠剂和营养强化剂等，广泛应用于食品、化学和医药工业。

为了提高酪蛋白的功能特性，扩大酪蛋白的应用范围，可以通过转谷氨酰胺酶的催化作用，将酪蛋白中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酰胺上的γ-酰胺基结合，从而导致酪蛋白质之间或者之内发生共价交联，形成相应的聚合物，修饰后的酪蛋白聚合物稳定性有所增强，粘度、乳化性、溶解性、发泡性、成膜性等功能性质也能得以改善。然而，以蛋白之间聚合形成的酪蛋白存在结构、功能单一的缺陷，而目前采用化学合成的酪蛋白轭合衍生物方法复杂，条件严苛，此外，由于化学合成方法中无法避免使用化学交联剂，造成了化学合成的酪蛋白可能存在潜在的安全性问题，在食品领域的应用存在着限制。

因此，本领域迫切需要开发一种乳化活性强、热稳定性高、功能多样化且可安全应用于食品领域的酪蛋白衍生物。

发明内容

本发明提供了一种将长链烃基引入酪蛋白的方法，以及该方法制备的酪蛋白衍生物。

本发明第一方面，提供了一种酪蛋白衍生物的制备方法，包括步骤：

(a)提供一含有酪蛋白的水相溶液，和一含有C6-C24的胺或其组合的有机相溶液；

(b)将(a)中所述的水相溶液和有机相溶液接触，并在转谷氨酰胺酶的作用下反应；

(c)收集(b)反应后的反应液，从而获得所述的酪蛋白衍生物。

在另一优选例中，所述的反应还在表面活性剂的作用下进行。

在另一优选例中，所述的C6-C24的胺为含有6-24个碳原子的伯胺，即为C8-C18的胺，更佳地，为C10-C14的胺。

在另一优选例中，所述的C6-C24的胺包括烷基胺、烯基胺和炔基胺，较佳地，为C8-C18的烷基胺。

在另一优选例中，所述的烷基胺包括辛胺、月桂胺(十二胺)。

在另一优选例中，所述的酪蛋白衍生物的反应结构如下式所示，其中R为C6-C24的烃基，优选为直链烷基：

在另一优选例中，所述的C6-C24的胺包括经取代的和非取代的C6-C24的胺。

在另一优选例中，所述的C6-C24的胺包括直链和支链胺，较佳地，为直链胺。

在另一优选例中，所述的接触为在恒温振荡下界面接触。

在另一优选例中，所述的反应温度为10-70℃，较佳地，为15-60℃，更佳地，为30-50℃，最佳地为45-55℃；和/或

所述的反应时间为0.5-24小时，较佳地为2-12小时；和/或

所述的反应在恒温振荡下完成。

在另一优选例中，所述振荡的速率为50-200r/min。

在另一优选例中，步骤(c)中刚还包括将反应液进行透析并冷冻干燥的步骤。

在另一优选例中，所述的透析为超纯水透析。

在另一优选例中，所述的透析时间为10-72小时。

在另一优选例中，所述的透析的截留分子量是3500Da。

在另一优选例中，所述水相溶液中含有水性溶剂包括缓冲范围为pH-5-8的缓冲盐溶液，和/或所述的有机相溶液中含有的有机溶剂包括能溶解C6-C24的胺但不溶于水的有机溶剂。

在另一优选例中，所述C6-C24的胺为直链烷基胺。

在另一优选例中，所述的水相溶液通过将酪蛋白溶于水性溶剂后获得。

在另一优选例中，所述的水性溶剂的pH值为6-7。

在另一优选例中，所述的有机相溶液通过将所述C6-C24的胺溶解于有机溶剂中获得。

在另一优选例中，所述的有机溶剂不溶于水。

在另一优选例中，所述的水性溶剂包括Tris·盐酸缓冲盐、磷酸缓冲盐；和/或所述的有机溶剂包括环己烷，正己烷，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳。

在另一优选例中，所述的转谷氨酰胺酶为非Ca²⁺依赖型酶，优选地，为从轮枝链霉菌属中提取到的微生物来源的非Ca²⁺依赖型酶。

在另一优选例中，所述的C6-C24的胺与酪蛋白的质量比为0.5-2：2-10，较佳地为1-1.5：5-8；和/或所述的转谷氨酰胺酶的加入量为2-50U/g·酪蛋白。

在另一优选例中，所述转谷氨酰胺酶的加入量为5-20U/g·酪蛋白，更佳地，为10-15U/g·酪蛋白。

在另一优选例中，所述酪蛋白的浓度为0.5mg/mL-10mg/mL。

在另一优选例中，所述的酪蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于人、牛、羊。

在另一优选例中，所述的酪蛋白衍生物的疏水性指数≥30；较佳地，为35-40；和/或

乳化活性指数≥35，较佳地为40-50。

本发明第二方面，提供了一种酪蛋白衍生物，所述的酪蛋白衍生物由第一方面所述方法制备获得。

乳化活性指数≥35，较佳地为40-50。

本发明第三方面，提供了本发明第二方面所述酪蛋白衍生物的用途，用于制备食品或药物组合物。

在另一优选例中，所述的食品或药物组合物包括本发明第二方面所述的酪蛋白和食品学或药学上可接受的载体。

本发明第四方面，提供了一种酪蛋白衍生物制备反应体系，所述的反应体系包括以下组分：(i)含有酪蛋白的水相溶液；(ii)含有C6-C24的胺或其组合的有机相溶液；(iii)转谷氨酰胺酶；

其中，所述的组分经混合或独立包装。

在另一优选例中，所述的反应体系还包括(iv)表面活性剂。

在另一优选例中，所述的表面活性剂包括双联离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、非离子表面活性剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的双链离子型表面活性剂包括琥珀酸二辛酯磺酸钠(AOT)；所述的阴离子表面活性剂包括十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠(DBS)；所述的阳离子表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；所述的非离子表面活性剂包括TritonX系列(聚氧乙烯醚类)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了轭合了辛基以后酪蛋白衍生物的核磁鉴定谱。酪蛋白衍生物中出现了一个新的峰B，这是酪蛋白和酪蛋白自身交联物所没有的。经过与辛胺的核磁谱图进行比较后，发现这是轭合到酪蛋白中的辛基的亚甲基质子峰。图1中峰A是由酪蛋白中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸残基和辛基上的甲基质子贡献的。

图2显示了与酪蛋白相比，辛基轭合的酪蛋白疏水性指数提高了36.54％，且与酪蛋白自身有显著性差异。

图3显示了与酪蛋白相比，辛基轭合的酪蛋白乳化活性指数提高了82.16％，且与酪蛋白自身有显著性差异。

图4显示了采用十六胺在不同轭合时段所获得的酪蛋白衍生物的核磁鉴定谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次采用酶反应合成法将疏水性长链烃基基团轭合入酪蛋白中，并通过双相反应克服了疏水性烃基链在水相中溶解度差进而影响反应效率的瓶颈。经实验证明，含有6-24，尤其8-18个碳原子数的疏水基团的酪蛋白衍生物，其具有更高的疏水性以及乳化活性，且热稳定性，盐稳定性显著高于酪蛋白。此外，根据所需要的目的产物，可对加入的疏水基团的组分、投料比、反应时间或酶的加入量进行调节，从而获得功能性不同的酪蛋白衍生物。因此，本发明方法制备获得的含长链疏水基团的酪蛋白具有乳化性高、热稳定性好的优势，且反应条件温和，副产物少。在此基础上，完成了本发明。

酪蛋白及酪蛋白衍生物

酪蛋白是哺乳动物中主要蛋白质成分，在牛奶中含量达80％。牛乳经脱脂、酸沉淀、脱水、干燥后制成粉末状制品即为酪蛋白，又称干酪素。酪蛋白及其制品有着较高的营养价值和良好的功能特性，适合作为乳化剂、增稠剂和营养强化剂等，广泛应用于食品、化学和医药工业。

可用于本发明的酪蛋白没有特殊限制，可以为任何天然的或经修饰的酪蛋白。例如，可用于本发明的酪蛋白可天然提取自大型哺乳动物，如牛、羊、人，也可以是经人工改造后或突变后的酪蛋白。

如本文所用，术语“酪蛋白衍生物”、“含有疏水基团的酪蛋白”、“经轭合的酪蛋白”可互换使用，均指采用本发明方法制备的轭合有长链烃基基团的酪蛋白。

在本发明中，所述的酪蛋白衍生物的结构式如下所示：

采用本发明方法制备的酪蛋白衍生物，其疏水性指数≥30；较佳地，较佳地，为35-40；和/或

乳化活性指数≥35，较佳地为40-50。

C6-C24的胺

如本文所用，术语“C6-C24的胺”、“本发明的胺”、“烃基胺”“含长链疏水基团的胺”、“长链烃基胺”可互换使用，均指含有6-24个碳原子的烃基伯胺，较佳地，为8-18个碳原子，更佳地，为10-14个碳原子。在本发明中，烃基胺可以为经取代的或非取代的，直链或支链的烃基胺。优选地，所述的经取代的烃基胺的取代基包括卤素基团、C1-C5的烷基。

通常，烃基胺与酪蛋白的通过共价键轭合而成，其反应结构如下式所示，其中R为C6-C24的烃基，优选为直链烷基：

优选地，可用于本发明C6-C24的胺优选为C8-C18的烷基胺，较佳地，包括己胺、辛胺、癸胺、月桂胺、肉豆蔻胺、油酸胺。

可用于本发明C6-C24胺的来源没有特别限制，可以为商业可获得的任何C6-C24的胺，也可以是通过化学合成反应获得的烃基胺。

此外，还可以采用其他与烷基胺性能类似的含伯胺疏水性基团与酪蛋白进行轭合。

转谷氨酰胺酶

转谷氨酰胺酶(TG)[EC2.3.2.13]，又称2.3.2.13]，又称谷氨酰胺-肽-γ-谷氨酰胺基转移酶，是一种催化酰基转移反应的转移酶。通过这些催化反应，可使各种蛋白质分子之间或者之内发生酰基转移反应，形成交联键。目前，谷氨酰胺转氨酶一般用于催化交联各种蛋白质，如，酪蛋白，大豆蛋白，谷蛋白，肌动蛋白，肌球蛋白，壳聚糖以及各种禽蛋蛋白、去骨禽肉蛋白和动物蛋白等等。转谷氨酰胺酶交联蛋白质反应条件温和，专一性强，价格低廉，安全性高，是一种常用食品添加剂，为食品蛋白质修饰首选酶制剂。

可用于本发明的转谷氨酰胺酶没有特殊限制，可以包括任何来源的转谷氨酰胺酶。

可用于本发明的转谷氨酰胺酶的量没有特殊限制，可根据所需获得的酪蛋白衍生物进行酶的量的调控。通常，可按照2-50U/g酪蛋白的量加入所需的合成酶，较佳地为5-20U/g酪蛋白，更佳地为10-15U/g酪蛋白。

通常，合成酶仅能在水相中进行反应，当溶于有机溶剂时，酶的活性大幅下降甚至完全失活。因此，本发明合成酶作用于水-有机相接触面，有效地催化酪蛋白和烷基胺的轭合反应，从而在有效维持酶活性的同时，完成轭合反应。

双相反应体系

如本文所用，术语“水-有机相体系”、“双相反应体系”可互换使用，均指本发明方法中含有酪蛋白的水相及含有烃基胺的有机相反应体系。其中，可用于本发明的有机相反应体系中含有有机溶剂，所述的有机溶剂可溶解烃基胺，但与水性溶剂互不相容。

优选地，可用于本发明水相的水性溶剂没有特殊限制，可以为任何溶解酪蛋白的缓冲盐溶液，优选缓冲范围为pH5-8的缓冲溶液，较佳地，包括Tris·盐酸缓冲盐、磷酸缓冲盐；可用于本发明有机相的有机溶剂包括环己烷，正己烷，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳。

制备方法

本发明方法为了获得具有更高疏水性的酪蛋白衍生物，利用双相反应体系中有机相和水相的接触界面的酶催化反应，具体地，本发明方法包括步骤：

(b)将(a)中所述的水相溶液和有机相溶液接触，并在合成酶的作用下反应；

(c)收集(b)反应后的反应液，从而获得所述的酪蛋白衍生物。

在另一优选例中，所述的烃基胺为C6-C24的胺，较佳地，为C8-C18的胺，更佳地，为C10-C14的胺；此外所述的烃基胺包括经取代的和非取代的烃基胺，和/或所述的烃基胺包括直链和支链烃基胺，优选为直链的烷基胺，例如C6-C24的烷基胺。

可用于本发明方法的反应条件优选在恒温振荡下进行，例如，反应温度为10-70℃，较佳地，为15-60℃，更佳地，为30-50℃，最佳地，为45-55℃；所述的反应时间为0.5-24小时，较佳地为2-12小时。优选的振荡速率为50-200r/min。

此外，步骤(c)中刚还包括将反应液进行透析并冷冻干燥的步骤。通常，可通过超纯水透析进行所述的透析步骤。透析时间为10-72小时，透析袋的截留分子量是3500Da。

在另一优选例中，所述的水相溶液通过将酪蛋白溶于水性溶剂后获得；所述的有机相溶液通过将所述C6-C24的胺溶解于有机溶剂中获得。

为了加快反应速率，通常，还可以在反应物中加入表面活性剂。

一种优选的本发明方法包括步骤：

(1)将酪蛋白置于反应玻璃器皿中，加入水性溶剂搅拌，待其彻底溶解后，得到质量浓度为0.05％-1％(w/v)的酪蛋白溶液；加入相同体积溶解了烃基胺的有机相，形成水相——有机相双相反应体系。加入转谷氨酰胺酶，在温度为15-60℃条件下，恒温振荡开始反应；

(2)将步骤(1)中的玻璃反应器，在不同的反应时间点取出，弃去有机相，将存留水相的反应器放入80℃恒温水浴中5-10分钟，灭活转谷氨酰胺酶，终止反应；将得到的反应液室温冷却后倒入透析袋中，在超纯水中透析10-72小时后，冷冻干燥，得到酪蛋白衍生物固体物。

组合物

本发明提供一种组合物，以所述组合物总重量计，它含有重量百分比为1-99wt％的本发明提供的酪蛋白衍生物作为活性成分和药学上或食品学上可接受的载体。

在本发明中，各种组合物可以按本领域熟知的方法配制，可以将酪蛋白衍生物与药学上或食品学上可接受的载体混合配制。药学上或食品学上可接受的载体的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述的有药学上或食品学上可接受的载体中还可以包含甘草提取物等天然提取物、维生素和微量元素等营养强化剂及膳食纤维、糊精。

“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋型剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。

在本发明的另一优选方式中，所述的食品学上可接受的载体或赋形剂可含有：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓释剂。

对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂、霜剂、乳剂、水剂或膏体等。

本发明的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物、食品配料组合物、膳食补充剂组合物、天然药物原料组合物、或化妆品功能成分组合物；也可以是保健饮料、酒类等。只要它们含有或基本上由酪蛋白衍生物组成即可。

反应体系

本发明还提供了一种酪蛋白衍生物制备反应体系，所述的反应体系包括以下组分：(i)含有酪蛋白的水相溶液；(ii)含有C6-C24的胺或其组合的有机相溶液；(iii)转谷氨酰胺酶；

其中，所述的组分经混合或独立包装。

较佳地，所述的反应体系还包括(iv)表面活性剂；其中，所述的表面活性剂包括双联离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、非离子表面活性剂、或其组合。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)本发明以转谷氨酰胺酶催化反应，以市售的牛酪蛋白和烃基胺为原料，反应条件温和，操作简单，适宜推广，可广泛应用于食品及医药领域。

(2)本发明采用水相——有机相双相反应体系，克服了烃基胺在水相中溶解度差，均相反应效率低的瓶颈，通过恒温振荡，使得酪蛋白和烃基胺在水相——有机相界面碰撞反应，得到各种烃基链轭合的酪蛋白衍生物。

(3)通过调控反应中酪蛋白浓度、烃基胺的种类、酪蛋白与烃基胺投料比、反应时间和酶加入量，可以得到不同烃基链轭合的，且轭合程度不等的酪蛋白衍生物，反应调控性强，可满足食品和医药领域不同的功能需求。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1 酪蛋白衍生物的制备

称取0.15g酪蛋白置于锥形瓶中，加入120mL0.5M Tris·HCl(pH7.5)搅拌，待其彻底溶解后，得到质量浓度为0.125％(w/v)的酪蛋白溶液；加入120mL溶解了0.03g辛胺的环己烷，形成水相-环己烷双相反应体系。加入15mg/mL转谷氨酰胺酶1mL(酶活力100U/g)，在温度为37℃条件下，恒温振荡(振荡速率为60r/min)开始反应；反应6h后取出锥形瓶，弃去有机相，将存留水相的锥形瓶放入80℃恒温水浴中10分钟，灭活转谷氨酰胺酶，终止反应；将得到的反应液室温冷却后倒入透析袋中(截留分子量3500Da)，在超纯水中透析48h后，冷冻干燥，得到酪蛋白衍生物固体物。图1显示了轭合后的酪蛋白衍生物的核磁鉴定谱。

实施例2 酪蛋白衍生物的制备

称取0.60g酪蛋白置于锥形瓶中，加入120mL0.5M Tris·HCl(pH8)搅拌，待其彻底溶解后，得到质量浓度为0.5％(w/v)的酪蛋白溶液；加入120mL溶解0.12g月桂胺(十二胺)的正己烷，形成水相-正己烷双相反应体系。加入30mg/mL转谷氨酰胺酶2mL(酶活力100U/g)，在温度为50℃条件下，恒温振荡(振荡速率为100r/min)开始反应；反应2h后取出锥形瓶，弃去有机相，将存留水相的锥形瓶放入80℃恒温水浴中10分钟，灭活转谷氨酰胺酶，终止反应；将得到的反应液室温冷却后倒入透析袋中(截留分子量3500Da)，在超纯水中透析48h后，冷冻干燥，得到酪蛋白衍生物固体物。

实施例3 酪蛋白衍生物的制备

用Tri·HCl缓冲溶液(pH7.5)溶解酪蛋白酸钠，配置成浓度为0.625、1.25、2.5、5mg/mL的酪蛋白酸钠溶液，形成水相。用环己烷溶解十八胺(十八胺与酪蛋白质量比为1：5)，形成有机相。将相同体积的水相和有机倒入锥形瓶中，置于37℃恒温水域摇床(转速为60rpm/min)中，以10U/g·酪蛋白酸钠的量加入微生物来源的转谷氨酰胺酶溶液，开始反应。在不同的反应时间(2h、4h、6h、8h、10h)将锥形瓶取出，弃去有机相，并将锥形瓶放置在85℃水浴中10min，灭火酶终止反应，待冷却后，将水相转移至透析袋中，在超纯水中透析48h，冷冻干燥保存于-20℃冰箱中。

实施例4 酪蛋白衍生物的性质鉴定1

本实施例测定了酪蛋白和辛基轭合的酪蛋白衍生物的疏水性指数、乳化活性、热稳定性和盐稳定性。

4.1 疏水性指数测定

方法如下：

称取10mg样品，溶于1mL磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.0)，在20000×g下离心15min，取上清液。将上清液分别稀释10、20、50、80、100倍，得到一系列稀释的蛋白样品，与等体积的100μg/mL的ANS染液混合，25℃下孵育1h。利用酶标仪检测样品荧光强度(FI)(激发波长355nm，发射波长460nm)，并将FI值与蛋白浓度做线性回归分析，斜率即为样品的疏水性指数。

结果见图2，与酪蛋白相比，辛基轭合的酪蛋白疏水性指数提高了36.54％，且与酪蛋白自身有显著性差异。

4.2 乳化活性(EAI)测定：

将1.0mL的大豆色拉油与3.0mL的蛋白溶液(用0.1mol/L的磷酸缓冲液，pH7.0溶解，配置成2mg/mL的蛋白溶液)混合后用高速乳匀机在12000rpm下乳匀1min，得到白色乳液。从乳液底部吸取50μL样品并加入到5mL SDS(0.1％(w/w))溶液中，在500nm下测定吸光度值。0.1％(w/w)SDS溶液作为空白对照，并根据下述公式计算蛋白的乳化活性：

EAI(m²/g)＝(2×2.303×A₅₀₀×dilution)/(C×(1-Φ)×10⁴)

其中C为蛋白浓度(g/mL),Φ是大豆色拉油在乳状液中的体积分数(v/v)，dilution即稀释倍数，本实验中为100，A₅₀₀为乳液与SDS混合液在500nm处的吸光度值。

结果见图3，与酪蛋白相比，辛基轭合的酪蛋白乳化活性指数提高了82.16％，且与酪蛋白自身有显著性差异。

4.3 热稳定性实验：

称取5mg样品置于坩埚中，放入热重分析仪中。实验条件：流速为20mL/min的动态氮气环境下，检测温度范围为30-600℃，加热速度为10℃/min。实验结束后，从热重曲线中获得相关参数值。

结果见表1

表1

结果说明：与酪蛋白相比，辛基轭合的酪蛋白的T_50％(蛋白样品失重50％时的温度)和T_max(失重率最大时的温度)值都有所提高，说明辛基轭合后提高了酪蛋白的热稳定性。

4.4 盐稳定性实验

称取50mg蛋白样品，将其分散于10mL不同浓度的NaCl溶液(1M-5M)中，搅拌过夜，在20000×g下离心20min，取上清液。将上清液用NaCl溶液稀释20倍后，用Bradford法测量蛋白含量。蛋白的盐稳定性通过蛋白在不同浓度NaCl溶液中的溶解度来间接衡量，而蛋白溶解度则通过计算上清液中蛋白含量与投料蛋白量的比值来得到。

结果见表2

表2

结果说明：与酪蛋白相比，辛基轭合的酪蛋白在高浓度的NaCl(4M)溶液中溶解度更大，稳定性更好，且与酪蛋白自身有显著性差异，其中，a、b、c指结果具有统计学显著性差异。

实施例5 不同酪蛋白浓度和反应时间对酪蛋白衍生物中疏水基团轭合度的影响

其中，轭合度定义为修饰酪蛋白中所轭合的疏水基团摩尔数与酪蛋白中谷氨酰胺残基摩尔数的比值

方法同实施例1，区别在于疏水基团为十六胺，其中，蛋白和反应时间的区别及其与轭合度的影响如表3所示：

表3

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种酪蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(c)收集(b)反应后的反应液，从而获得所述的酪蛋白衍生物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反应温度为10-70℃，较佳地，为15-60℃；和/或

所述的反应时间为0.5-24小时，较佳地为2-12小时；和/或

所述的反应在恒温振荡下完成。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中刚还包括将反应液进行透析并冷冻干燥的步骤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水相溶液中含有水性溶剂包括缓冲范围为pH-5-8的缓冲盐溶液，和/或所述的有机相溶液中含有的有机溶剂包括能溶解C6-C24的胺但不溶于水的有机溶剂。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的水性溶剂包括Tris·盐酸缓冲盐、磷酸缓冲盐；和/或所述的有机溶剂包括环己烷，正己烷，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的C6-C24的胺与酪蛋白的质量比为0.5-2：2-10，较佳地为1-1.5：5-8；和/或所述的转谷氨酰胺酶的加入量为2-50U/g·酪蛋白。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酪蛋白来源于哺乳动物，较佳地来源于人、牛、羊。

8.一种酪蛋白衍生物，其特征在于，所述的酪蛋白衍生物由以上任一权利要求制备获得。

9.权利要求8所述酪蛋白衍生物的用途，其特征在于，用于制备食品或药物组合物。

10.一种酪蛋白衍生物制备反应体系，其特征在于，包括以下组分：

(i)含有酪蛋白的水相溶液；

(ii)含有C6-C24的胺或其组合的有机相溶液；

(iii)转谷氨酰胺酶；

其中，所述的组分经混合或独立包装。