CN104087565A - 一种青霉素酰化酶的制备方法 - Google Patents

一种青霉素酰化酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种青霉素酰化酶的制备方法，该方法为微生物发酵法，采用大肠杆菌逐级制备一级种子和二级种子，然后使用二级种子在发酵培养基中进行发酵制备得到青霉素酰化酶，制备得到的青霉素酰化酶的活性在40000U/L以上，显著提高了生产效率。

Description

一种青霉素酰化酶的制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种微生物发酵制备青霉素酰化酶的方法。
背景技术
青霉素酰化酶(penicillin acylase，简称PA)又称为青霉素酰基转移酶，是β-内酰胺类抗生素工业生产中较为关键的酶，用量很大。
青霉素酰化酶既是胞内酶又是胞外酶，可以通过产酶微生物的营养控制代谢及基因型改变，进行大规模的生产。青霉素酰化酶主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶获得，报道最多的是关于埃希氏菌属大肠杆菌发酵生产青霉素G酰化酶。近年来的研究倾向于3个方面：利用物理或化学诱变方法、基因工程方法对产青霉素酰化酶的菌株进行改造，突变菌种的分离以及酶在不同的产酶宿主细胞中的克隆和表达。如利用紫外光诱变巨大芽孢杆菌可以获得酶产量增加4倍的突变菌株，利用重组DNA技术将编码青霉素酰化酶的基因导入宿主细胞中，构建了高产分泌型工程菌，但酶的应用性能还有待提升。
发明内容
本发明的目的是提供一种青霉素酰化酶的制备方法，该方法制备得到的青霉素酰化酶的活性在40000U/L以上。
为了实现本发明所述目的，发明人提供了以下技术方案。
一种青霉素酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
a.取大肠杆菌，在35-40℃条件下制备一级种子和二级种子，所用种子培养基含有蛋白胨，酵母浸膏，NaCl；
b.将步骤a制备的二级种子接种至发酵培养基中，在35-40℃培养15-30h，得到发酵液，所述发酵培养基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液；
c.将步骤b制备的发酵液进行离心，弃去上清液，收集下层的菌体浓缩液，即得到青霉素酰化酶的粗品溶液；
d.将步骤c所得青霉素酰化酶的粗品溶液进行均质，絮凝，超滤浓缩，沉淀除去杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤a中，在37-38℃条件下制备一级种子和二级种子。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤a中，种子培养基含蛋白胨5-10重量份，酵母浸膏2-5重量份，NaCl 5-10重量份，去离子水1000重量份。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基体积的3-9％。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基体积的6％。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，培养的温度为37-38℃。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，培养的时间为26h。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，发酵培养基为每150mL微量元素水溶液中加入甘油10-20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、NaCl5-10g。
上述青霉素酰化酶的制备方法，所述步骤b中，所述微量元素水溶液的配比为：每升去离子水中含有FeCl3·6 H2O 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2·6H2O 0.24g，NaMoO4·2H2O0.24g，CaCl2·2H2O 0.12g，CuSO4·5H2O 0.20g，H3BO31.0g，MgSO40.74g。
本发明所述方法，步骤a中制备一级种子和二级种子选择在35-40℃条件下进行，符合大肠杆菌的生长特性，在此范围内，菌体的密度会随着温度的升高而升高，在37-38℃是增长的速度最快，随后增长趋缓。
步骤b中选择的接种比例为3-9％，在此比例范围内发酵产量与接种量的比较高，尤其是当二级种子的接种量为发酵培养基体积的6％时，产出接种比最高。
步骤b中，二级种子在35-40℃条件下培养种子发酵速度较快，在37-38℃条件下发酵速度最快，发酵时间在15-30h内，时间太短发酵不充分，时间太长会产生菌体自溶，发酵时间在26h时发酵效果最好。
步骤a中，种子培养基的组成中酵母粉为微生物提供碳源和能源，蛋白胨主要提供碳源，而NaCl提供无机盐。这种培养基适于培养细菌。
同样的，步骤b中发酵培养基的组分中酵母粉为微生物提供碳源和能源，蛋白胨和甘油主要提供碳源，而NaCl提供无机盐。选取这种培养基有利于菌体生长、代谢产酶。
步骤b中微量元素水溶液的加入是为了补充细菌生长所需的无机盐。
本发明所述青霉素酰化酶的制备方法，选择合适的培养基及培养条件，能够制备得到活性在40000U/L以上的青霉素酰化酶，提高了发酵产量，明显提高了生产效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
实施例1
种子培养基的制备：蛋白胨5g，酵母粉2g，NaCl5g，去离子水1000g，混合均匀，用1mol/LNaOH调节pH值至6.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。
微量元素水溶液的配置：去离子水1.0L，加入FeCl3·6 H2O 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2·6H2O 0.24 g，NaMoO4·2H2O0.24g，CaCl2·2H2O 0.12g，CuSO4·5H2O 0.20g，H3BO31.0g，MgSO40.74g，混合均匀，备用。
发酵培养基的配置：甘油10g，酵母粉20g，蛋白胨10g，NaCl 5g，150mL微量元素水溶液,混合均匀，用1mol/L的盐酸调节pH值至6.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。
将购买的大肠杆菌菌种进行活化，在35℃培养6h而后按0.3％的接种量接种至种子培养基上进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；将制备的二级种子，按发酵培养基体积的3％接种量接入发酵培养基中，在35℃培养15h，得到发酵液，即微生物发酵生产青霉素酰化酶结束；将发酵液离心，收集下层浓缩液(即含菌体部分)，即为青霉素酰化酶粗品溶液，活性为45000u/l。
将青霉素酰化酶按照常规操作进行均质，之后加入聚四胺进行絮凝，取上清液进行超滤浓缩，加入硫酸铵沉淀杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
根据需要，可以将其制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例2
种子培养基的制备：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl 10g，去离子水1000g，混合均匀，用1mol/L NaOH调节pH值至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。
微量元素水溶液的配置：去离子水1.0L，加入FeCl3·6 H2O 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2·6H2O 0.24 g，NaMoO4·2H2O0.24g，CaCl2·2H2O 0.12g，CuSO4·5H2O 0.20g，H3BO31.0g，MgSO40.74g，混合均匀，备用。
发酵培养基的配置：甘油20g，酵母粉30g，蛋白胨20g，NaCl 10g，150mL微量元素水溶液,混合均匀，用1mol/L盐酸调节pH值至6.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。
将购买的大肠杆菌菌种进行活化，在40℃培养12h而后按0.3％的接种量接种至种子培养基上进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；将制备的二级种子，按发酵培养基体积的9％接种量接入发酵培养基中，在40℃培养30h，得到发酵液，即微生物发酵生产青霉素酰化酶结束；将发酵液离心，收集下层浓缩液(即含菌体部分)，即为青霉素酰化酶粗品溶液，活性为53000u/l。
将青霉素酰化酶按照常规操作进行均质，之后加入聚四胺进行絮凝，取上清液进行超滤浓缩，加入硫酸铵沉淀杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
根据需要，可以将其制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例3
种子培养基的制备：蛋白胨8g，酵母浸膏3g，NaCl7g，去离子水1000g，混合均匀，用1mol/L盐酸调节pH值至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。
微量元素水溶液的配置：去离子水1.0L，加入FeCl3·6 H2O 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2·6H2O 0.24 g，NaMoO4·2H2O0.24g，CaCl2·2H2O 0.12g，CuSO4·5H2O 0.20g，H3BO31.0g，MgSO40.74g，混合均匀，备用。
发酵培养基的配置：甘油15g，酵母粉25g，蛋白胨15g，NaCl 8g，150mL微量元素水溶液,混合均匀，用1mol/LNaOH调节pH值至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。
将购买的大肠杆菌菌种进行活化，在37℃培养8h而后按0.3％的接种量接种至种子培养基上进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；将制备的二级种子，按发酵培养基体积的6％接种量接入发酵培养基中，在37℃培养26h，得到发酵液，即微生物发酵生产青霉素酰化酶结束；将发酵液离心，收集下层浓缩液(即含菌体部分)，即为青霉素酰化酶粗品溶液，活性为61000u/l。
将青霉素酰化酶按照常规操作进行均质，之后加入聚四胺进行絮凝，取上清液进行超滤浓缩，加入硫酸铵沉淀杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
根据需要，可以将其制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
实施例4
种子培养基的制备：蛋白胨6g，酵母浸膏4g，NaCl6g，去离子水1000g，混合均匀，用1mol/LNaOH调节pH值至6.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。
微量元素水溶液的配置：去离子水1.0L，加入FeCl3·6 H2O 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2·6H2O 0.24 g，NaMoO4·2H2O0.24g，CaCl2·2H2O 0.12g，CuSO4·5H2O 0.20g，H3BO31.0g，MgSO40.74g，混合均匀，备用。
发酵培养基的配置：甘油18g，酵母粉22g，蛋白胨16g，NaCl 7g，150mL微量元素水溶液,混合均匀，用1mol/LNaOH调节pH值至7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。
将购买的大肠杆菌菌种进行活化，在38℃培养8h而后按0.3％的接种量接种至种子培养基上进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；将制备的二级种子，按发酵培养基体积的8％接种量接入发酵培养基中，在38℃培养22h，得到发酵液，即微生物发酵生产青霉素酰化酶结束；将发酵液离心，收集下层浓缩液(即含菌体部分)，即为青霉素酰化酶粗品溶液，活性为58000u/l。
将青霉素酰化酶按照常规操作进行均质，之后加入聚四胺进行絮凝，取上清液进行超滤浓缩，加入硫酸铵沉淀杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。根据需要，可以将其制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。
本发明所用通过基因构建的大肠杆菌从石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司购买，为青霉素酰化酶(E.Coli 254)菌株，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。

Claims (9)

1.一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.取大肠杆菌，在35-40℃条件下制备一级种子和二级种子，所用种子培养基含有蛋白胨，酵母浸膏，NaCl；
b.将步骤a制备的二级种子接种至发酵培养基中，在35-40℃培养15-30h，得到发酵液，所述发酵培养基含有甘油，酵母粉，蛋白胨，NaCl，微量元素水溶液；
c.将步骤b制备的发酵液进行离心，弃去上清液，收集下层的菌体浓缩液，即得到青霉素酰化酶的粗品溶液；
d.将步骤c所得青霉素酰化酶的粗品溶液进行均质，絮凝，超滤浓缩，沉淀除去杂蛋白，最后进行透析浓缩，即得到青霉素酰化酶纯品。
2.根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤a中，在37-38℃条件下制备一级种子和二级种子。
3.根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤a中，种子培养基含蛋白胨5-10重量份，酵母浸膏2-5重量份，NaCl5-10重量份，去离子水1000重量份。
4.根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基体积的3-9％。
5.根据权利要求4所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，二级种子的接种量为发酵培养基体积的6％。
6.根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，培养的温度为37-38℃。
7.根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，培养的时间为26h。
8.根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，发酵培养基为每150mL微量元素水溶液中加入甘油10-20g、酵母粉20-30g、蛋白胨10-20g、NaCl 5-10g。
9.根据权利要求1所述的一种青霉素酰化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，所述微量元素水溶液的配比为：每升去离子水中含有FeCl3·6 H2O 3.24g，ZnCl20.22g，CoCl2·6H2O 0.24g，NaMoO4·2H2O0.24g，CaCl2·2H2O 0.12g，CuSO4·5H2O 0.20g，H3BO31.0g，MgSO40.74g。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105255764A (zh) * 2015-10-27 2016-01-20 桂林瑞丰环保微生物应用研究所 一种大肠杆菌的微离心式培养方法
CN105647807A (zh) * 2016-04-11 2016-06-08 浙江拓普药业股份有限公司 一种青霉素酰化酶的产生菌的培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1821400A (zh) * 2006-03-14 2006-08-23 华东理工大学 利用基因工程菌发酵生产粪产碱杆菌青霉素酰化酶
CN103695405A (zh) * 2013-11-11 2014-04-02 华北制药河北华民药业有限责任公司 一种新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1821400A (zh) * 2006-03-14 2006-08-23 华东理工大学 利用基因工程菌发酵生产粪产碱杆菌青霉素酰化酶
CN103695405A (zh) * 2013-11-11 2014-04-02 华北制药河北华民药业有限责任公司 一种新型β-内酰胺类抗生素合成酶的生产方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105255764A (zh) * 2015-10-27 2016-01-20 桂林瑞丰环保微生物应用研究所 一种大肠杆菌的微离心式培养方法
CN105647807A (zh) * 2016-04-11 2016-06-08 浙江拓普药业股份有限公司 一种青霉素酰化酶的产生菌的培养方法

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