CN104086644A - 血液制品中fiv上清的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了本发明提供了血液制品中FIV上清的制备方法，它是以血浆为原料，利用低温乙醇法制备得到FI+II+III上清，取FI+II+III上清，经过低温乙醇法分离FIV，压滤，取上清即得；与现有技术不同的是，本发明分离FIV后的压滤过程中，采用硅藻土和珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土的用量为3.0～3.5gFI+II+III上清蛋白总量/1g硅藻土；所述硅藻土中，SiO2含量为96.0～98.7％，Al2O3含量为0.6～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。本发明研究表明，采用本发明方法制备FV上清过程中，所得产品中白蛋白含量范围更为稳定，均能保持在80％左右，工艺重现性更好；并且，过滤过程中流量、压力以及滤液浊度均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。

Description

血液制品中FIV上清的制备方法
技术领域
本发明涉及血液制品中FIV上清的制备方法。
背景技术
人血白蛋白是目前产量最大、用量最大的蛋白质药物。其具有维持人体内血液渗透压和携带血液中多种配基(包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物)与组织交换等生理功能，临床用于手术输血、危重病人补液、创伤休克、低蛋白血症、红细胞过多症、发烧和水肿等，并且可增强人体抵抗力，是重要的临床药物。目前，国内人血白蛋白的规模化生产主要使用低温乙醇法从健康人血浆中分离纯化白蛋白，例如《医学生物制品学》(第二版，人民卫生出版社)、《血液制品学》(第二版，人民卫生出版社)、CN201110030778.3、CN201110223760.5、CN201210013227.0、CN201110030776.4等。通常使用的分离流程见图1，其中，组分I(又称FI)主要含有纤维蛋白原，组分I+III(又称FI+III)主要含有丙球、凝血酶原和纤溶酶原，组分II(又称FII)主要含有球蛋白，组分V(又称FV)主要含有白蛋白。低温乙醇法过程相对简单，产量较高，可以进行大规模的生产，在世界范围内得到了广泛的应用。
使用压滤技术进行固液相分离是目前多数国内外血液制品厂家用于低温乙醇分离工艺组分分离的方法。压滤通常会使用助滤剂，其粒间隙也构成复杂的迷宫结构，当制品溶液冲击滤板时，主要通过静电吸附和机械阻挡的方式来捕捉固体成分，由助滤剂形成的滤饼层和深层滤板成为捕捉固体沉淀颗粒的重要场所。滤板应有适当的孔径，以便能在截留助滤剂颗粒以形成结实的滤饼层的同时给制品溶液的流动带来最小的阻力。
压滤工艺的主要控制参数包括滤板(过滤介质)类型、助滤剂类型和用量的选择等条件。
其中，助滤剂种类繁多，其主要功能是吸附沉淀颗粒、帮助过滤，还可提升最终产品的安全性和质量。助滤剂的选择通常可以考虑滤过液的浊度要求、生产能力、产品的回收率、产品的稳定性和纯度等方面的要求，以及去除产品溶液中特别成份的需要。目前血液制品生产常用的助滤剂有硅藻土和珍珠岩等。硅藻土是古代单细胞硅藻遗骸沉积物，具有质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附及填充等一列优良性能，具有良好的化学稳定性。硅藻土助滤剂的主要优点是：具有良好的微孔结构、吸附性能和抗压缩性能，不仅能使被滤液体获得较好的流速比，并且能滤除微细的悬浮物，保证了澄清度。
血液制品中添加助滤剂的主要目的是提高过滤性能、提高滤液澄清度、降低滤液浊度、吸附热原质、脂类、蛋白酶和变性蛋白，从而保证制品质量。助滤剂通过以下方式达到助滤和吸附的作用：
1)机械截留作用：助滤剂形成的滤饼产生众多的孔隙以及形成孔隙与孔隙之间的间隔层，液体流经滤饼时能够截留其中的悬浮粒子，包括：
A.表面过滤作用：固液相分离发生在过滤介质的表面，当液体中悬浮固体颗粒的粒径大于硅藻土/珍珠岩的孔径时被截留在助滤剂表面。
B.深层过滤效应：固液相分离发生在过滤介质的内部：当液体中悬浮固体颗粒的粒径小于硅藻土/珍珠岩的孔径时，比较小的固体颗粒穿过滤饼表面进入介质内部，介质内部曲折的微孔沟道和更细小的孔隙能够截留这些颗粒。
2)吸附作用：产生吸附作用的主要原因包括范德华力、Zeta电位和离子交换作用，包括：
A.液体中的悬浮粒子形成的链团粘附于硅藻土/珍珠岩而被截留；
B.比硅藻土/珍珠岩内部孔径小的悬浮粒子进入到硅藻土/珍珠岩内部表面因相反电荷吸附而被截留。
虽然硅藻土是血液制品中常用的助滤剂之一，然而，硅藻土品种繁多，由于不同硅藻土的原料、加工方式等差异，使得不同硅藻土产品在成分含量和性能上产生了较大区别。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血液制品中FIV上清的制备方法。
具体地，本发明提供了血液制品中FIV上清的制备方法，它是以血浆为原料，利用低温乙醇法制备得到FI+II+III上清，取FI+II+III上清，经过低温乙醇法分离FIV，压滤，取上清即得；与现有技术不同的是，本发明分离FIV后的压滤过程中，使用PALL50P滤板，所述滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土和珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土的用量为3.0～3.5g FI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土；所述硅藻土中，SiO2含量为96.0～98.7％，Al2O3含量为0.6～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
所述待滤液为待压滤的样品，即FI+II+III上清分离FIV后的待压滤样品。
FIV上清中白蛋白含量较高，是制备白蛋白产品的重要中间体。
进一步地，所述硅藻土中，SiO2含量为96.0～96.2％，Al2O3含量为1.0～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
进一步地，所述硅藻土的比表面积为2.2～2.3m2/g，优选为2.228m2/g。
进一步地，所述硅藻土的离心湿密度为0.23～0.24g/cm2，优选为0.237g/cm2。
优选地，所述硅藻土型号为CELPURE1000。
进一步地，所述珍珠岩为900珍珠岩。本发明中珍珠岩的用量和种类同现有技术。例如，珍珠岩的用量为2.0～3.0gFI+II+III上清蛋白/1g珍珠岩。
为了进一步提高终产品质量，FI+II+III上清优选采用如下方法制备：
以血浆为原料，经过低温乙醇法分离提取FI+II+III，压滤，取上清即得；所述压滤过程中，采用PALL50P滤板，硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，滤板用量为10～13m2/1000L血浆，硅藻土用量为4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土；所述硅藻土如上所述。
其中，本发明制备方法中，各个步骤中的压滤流速和滤板压力为：
本发明还提供了上述方法制备的FIV上清。
本发明研究表明，本发明方法制备FV上清过程中，采用特定的硅藻土、滤板种类和用量，所得产品中白蛋白含量范围更稳定，均能保持在80％左右，工艺重现性更好；并且，过滤过程中流量、压力以及滤液浊度均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。
另外，硅藻土是矿物，虽然经过前期处理，但其中仍然含有一定量的重金属，在压滤过程中，若能够硅藻土用量，将会减少重金属的引入几率，促进产品中重金属含量降低。本发明制备方法中，硅藻土用量比传统工艺明显缩小，为降低产品重金属含量提供了可能。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 血浆制品的常规生产流程图
图2 本发明生产流程图
图3 使用C503型硅藻土助滤的现有技术生产流程图
图4 FIV上清HPLC图谱，其中，A为本发明方法制备的FIV上清HPLC图，B为使用传统C503硅藻土压滤技术所得FIV上清HPLC图。
图5 FI+II+III上清液电泳图谱，其中，A为本发明方法所得到的FI+II+III上清液电泳图谱，B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FI+II+III上清液电泳图谱。
具体实施方式
本发明所用硅藻土和珍珠岩均购自于Imerys Perlite China,Inc。
实施例1 本发明制备方法
取FI+II+III上清，经过低温乙醇法对FIV进行分离，再使用PALL50P滤板，同时以CELPURE1000硅藻土和900珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀，进行压滤，取上清液即得FIV上清。其中，硅藻土和滤板的用量为：
硅藻土 3.0～3.5g FI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土
珍珠岩 2.0～3.0g FI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土
滤板 10～13m2/1000L血浆
本发明所用硅藻土的检测结果如下：
(1)金属氧化范围使用XRF测定的百分比
(2)助熔煅烧品酸溶物质(2.0％上限)
(3)助熔煅烧品水溶物质(2.0％上限)
(4)比表面积
(5)离心湿密度
本发明中所述FI+II+III上清的制备方法可以采用现有技术，但更优选使用如下方法制备：
取血浆，经过低温乙醇法对FI+II+III进行分离，再使用PALL50P滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，进行压滤，取上清液即得。其中，硅藻土和滤板的用量为：
硅藻土 4.5～5.5g血浆蛋白质总量/1g硅藻土
滤板 10～13m2/1000L血浆
采用此处FI+II+III上清的制备方法，与使用C503硅藻土制备的FI+II+III上清进行比较，可以看出：
上述方法所得FI+II+III上清液电泳图谱(图5A)中，白蛋白峰面积约占86％，而使用C503硅藻土助滤得到的FI+II+III上清液白蛋白峰面积仅约占73％(图5B)。对比两者可以看出，上述方法制备的FI+II+III上清中白蛋白纯度明显增高了13个百分点。因此，为了提高终产品的质量，本发明中优选使用上述FI+II+III上清制备方法。
另外，上述方法的压滤流速和滤板压力为：
实施例2 本发明制备方法对压滤过程的影响
以下试验通过过滤流量、压力以及滤液浊度等指标，对本发明与使用C503型硅藻土的现有制备方法进行比较(硅藻土用量为2.0～3.0gFI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土,900珍珠岩的用量为2.0～3.0gFI+II+III上清液蛋白/1g珍珠岩,PALL50P滤板用量10～13m2/1000L血浆)，其结果如下：
1、过滤流量
通过常规手段检测滤过速率，其结果如下：
表1过滤速率对比
由表1可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，本发明方法压滤过程中，单位时间内过滤流量明显增加，速率提高约了6％，明显缩短了过滤时长，有助于整个生产工时的节省。
2、过滤压力
通过常规手段检测滤过压力，其结果如下：
表2过滤压力对比
由表2可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，本发明方法压滤过程中单位面积滤板承受的压力负荷明显降低。压力的降低，一方面降低了过滤过程中因过滤压力过高带来的安全隐患；另一方面，每种滤材均有其最大承受压力负荷，超过此负荷，其过滤效果将会下降，影响产品质量。过滤压力的下降也从一定程度上保证了产品质量。
3、滤液浊度
通过常规手段检测滤液浊度，其结果如下：
表3滤液浊度对比
由表3可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，本发明方法所得滤液浊度值有所降低。
从上述检测结果可以看出，在生产过程中，本发明制备方法过滤流量、压力以及滤液浊度均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。
实施例3 本发明制备方法对产品的影响
通过HPLC技术检测FIV上清中白蛋白纯度，对本发明与使用C503型硅藻土、珍珠岩、PALL50P滤板的现有制备方法进行比较，结果见表4、图4。其中，两种方法除了压滤工艺不同外，其他操作和原料均相同，在此条件下更能说明两种助滤工艺带来的效果差异。
表4统计结果
本发明白蛋白峰面积(％) C503型硅藻土白蛋白峰面积(％)
1批 80.0 81.6
2批 79.5 75.9
3批 81.2 76.3
4批 80.9 73.3
5批 81.0 83.2
6批 81.1 79.9
平均 80.6 78.4
本发明方法所得FIV上清HPLC图谱(图4A)中，保留时间25分钟的白蛋白峰面积均稳定在80％左右；而使用传统硅藻土助滤的上清HPLC图谱中(图4B)，保留时间25分钟的白蛋白峰面积在72—83％之间波动，说明本发明制备工艺重现性良好，使得产品质量稳定可靠。
另外，现有方法制备的FIV上清中，白蛋白峰面积平均值约为78％，与之相比，本发明方法所得FIV上清中白蛋白平均含量更高，有助于提高白蛋白纯度。
上述结果表明，本发明方法对FIV上清成分的提取分离效果优于现有技术。

Claims (8)

1.血液制品中FIV上清的制备方法，它是以血浆为原料，利用低温乙醇法制备得到FI+II+III上清，取FI+II+III上清经过低温乙醇法分离FIV，压滤，取上清即得，其特征在于：分离FIV后的压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆，采用硅藻土和珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土的用量为3.0～3.5gFI+II+III上清蛋白/1g硅藻土；所述硅藻土中，SiO2含量为96.0～98.7％，Al2O3含量为0.6～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土中，SiO2含量为96.0～96.2％，Al2O3含量为1.0～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土的比表面积为2.2～2.3m2/g，优选为2.228m2/g。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土的离心湿密度为0.23～0.24g/cm2，优选为0.237g/cm2。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土型号为CELPURE1000。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述珍珠岩的用量为2.0～3.0gFI+II+III上清蛋白/1g珍珠岩；优选地，珍珠岩为900珍珠岩。
7.根据权利要求1～6任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述FI+II+III上清采用如下方法制备：
以血浆为原料，经过低温乙醇法分离提取FI+II+III，压滤，取上清即得；所述压滤过程中，采用PALL50P滤板，硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，滤板用量为10～13m2/1000L血浆，硅藻土用量为4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土；所述硅藻土中，SiO2含量为96.0～98.7％，Al2O3含量为0.6～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
8.权利要求1～7任意一项所述方法制备的FIV上清。
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