CN104086645A - 人血白蛋白和球蛋白的制备方法 - Google Patents

人血白蛋白和球蛋白的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了人血白蛋白和球蛋白的制备方法，其中，在制备FI+II+III沉淀或FI+II+III上清的压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土为助滤剂，硅藻土的用量为4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土；所述硅藻土中，SiO2含量为96.0～98.7％，Al2O3含量为0.6～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。本发明研究表明，采用本发明方法制备FI+II+III沉淀或上清过程中，所得产品中球蛋白和白蛋白的含量大幅提高，并且，过滤过程中流量、压力以及滤液浊度均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。

Description

人血白蛋白和球蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及人血白蛋白和球蛋白的制备方法。
背景技术
人血白蛋白是目前产量最大、用量最大的蛋白质药物。其具有维持人体内血液渗透压和携带血液中多种配基(包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物)与组织交换等生理功能，临床用于手术输血、危重病人补液、创伤休克、低蛋白血症、红细胞过多症、发烧和水肿等，并且可增强人体抵抗力，是重要的临床药物。目前，国内人血白蛋白的规模化生产主要使用低温乙醇法从健康人血浆中分离纯化白蛋白，例如《医学生物制品学》(第二版，人民卫生出版社)、《血液制品学》(第二版，人民卫生出版社)、CN201110030778.3、CN201110223760.5、CN201210013227.0、CN201110030776.4等，通常使用的分离流程见图1，其中，组分I(又称FI)主要含有纤维蛋白原，组分I+III(又称FII+III)主要含有丙球、凝血酶原和纤溶酶原，组分II(又称FII)主要含有球蛋白，组分V(又称FV)主要含有白蛋白，低温乙醇法过程相对简单，产量较高，可以进行大规模的生产，在世界范围内得到了广泛的应用。
使用压滤技术进行固液相分离是目前多数国内外血液制品厂家用于低温乙醇分离工艺组分分离的方法。压滤通常会使用助滤剂，其粒间隙也构成复杂的迷宫结构，当制品溶液冲击滤板时，主要通过静电吸附和机械阻挡的方式来捕捉固体成分，由助滤剂形成的滤饼层和深层滤板成为捕捉固体沉淀颗粒的重要场所。滤板应有适当的孔径，以便能在截留助滤剂颗粒以形成结实的滤饼层的同时给制品溶液的流动带来最小的阻力。
压滤工艺的主要控制参数包括滤板(过滤介质)类型、助滤剂类型和用量的选择、过滤温度、过滤前洗缓冲液和过滤回洗缓冲液的成分和理化条件等。
其中，助滤剂种类繁多，其主要功能是吸附沉淀颗粒、帮助过滤，还可提升最终产品的安全性和质量。助滤剂的选择通常可以考虑滤过液的浊度要求、生产能力、产品的回收率、产品的稳定性和纯度等方面的要求，以及去除产品溶液中特别成份的需要。目前血液制品生产常用的助滤剂有硅藻土和珍珠岩等。硅藻土是古代单细胞硅藻遗骸沉积物，具有质轻、多孔、高强、耐磨、绝缘、绝热、吸附及填充等一列优良性能，具有良好的化学稳定性。硅藻土助滤剂的主要优点是：具有良好的微孔结构、吸附性能和抗压缩性能，不仅能使被滤液体获得较好的流速比，并且能滤除微细的悬浮物，保证了澄清度。
血液制品中添加助滤剂的主要目的是提高过滤性能、提高滤液澄清度、降低滤液浊度、吸附热原质、脂类、蛋白酶和变性蛋白，从而保证制品质量。助滤剂通过以下方式达到助滤和吸附的作用：
1)机械截留作用：助滤剂形成的滤饼产生众多的孔隙以及形成孔隙与孔隙之间的间隔层，液体流经滤饼时能够截留其中的悬浮粒子，包括：
A.表面过滤作用：固液相分离发生在过滤介质的表面，当液体中悬浮固体颗粒的粒径大于硅藻土/珍珠岩的孔径时被截留在助滤剂表面。
B.深层过滤效应：固液相分离发生在过滤介质的内部：当液体中悬浮固体颗粒的粒径小于硅藻土/珍珠岩的孔径时，比较小的固体颗粒穿过滤饼表面进入介质内部，介质内部曲折的微孔沟道和更细小的孔隙能够截留这些颗粒。2)吸附作用：产生吸附作用的主要原因包括范德华力、Zeta电位和离子交换作用，包括：
A.液体中的悬浮粒子形成的链团粘附于硅藻土/珍珠岩而被截留；
B.比硅藻土/珍珠岩内部孔径小的悬浮粒子进入到硅藻土/珍珠岩内部表面因相反电荷吸附而被截留。
虽然硅藻土是血液制品中常用的助滤剂之一，然而，硅藻土品种繁多，由于不同硅藻土的原料、加工方式等差异，使得不同硅藻土产品在成分含量和性能上产生了较大区别。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人血白蛋白和球蛋白的制备方法。本发明的另一目的在于提供血液制品中FI+II+III沉淀或FI+II+III上清的制备方法。
具体地，本发明提供了人血白蛋白和球蛋白的制备方法，它是以血浆为原料，经低温乙醇法分别依次制备得到FI+II+III上清和FI+II+III沉淀、FIV上清和FI+III上清、FV沉淀和FII沉淀，取FV沉淀和FII沉淀，精制，分别得到白蛋白和球蛋白；与现有技术不同的是，在制备FI+II+III沉淀或FI+II+III上清的压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A的用量为4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土；所述硅藻土A中，SiO2含量为96.0～98.7％，Al2O3含量为0.6～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
在目前的血浆制品领域中，FI+II+III沉淀主要用于免疫球蛋白的生产，FI+II+III上清主要用于生产蛋白酶抑制剂和白蛋白等。因此，FI+II+III上清和沉淀的制备式生产白蛋白、球蛋白等血浆制品的重要中间步骤。
进一步地，所述硅藻土A中，SiO2含量为96.0～96.2％，Al2O3含量为1.0～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
其中，所述硅藻土A的比表面积为2.2～2.3m2/g，优选地，所述硅藻土A的比表面积为2.228m2/g。
其中，所述硅藻土A的离心湿密度为0.23～0.24g/cm2，优选为0.237g/cm2。
优选地，所述硅藻土A的型号为CELPURE1000。
进一步地，制备白蛋白过程中，FIV上清和FV沉淀的制备方法如下：
FIV上清的制备：以FI+II+III上清为原料，经过低温乙醇法分离FIV，压滤，取上清即得；所述压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A和珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A的用量为3.0～3.5g FI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土A；珍珠岩的用量为2.0～3.0gFI+II+III上清蛋白/1g珍珠岩；
FV沉淀的制备：取FIV上清经过低温乙醇法分离FV，压滤，取沉淀即得；分离FV后的压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A为助滤剂，其中，预涂层所用硅藻土A为40-60g/平方米滤板，待滤液中硅藻土A的用量为1.0～1.5g/L血浆；
制备球蛋白过程中，FI+III上清和FII沉淀的制备方法如下：
FI+III上清的制备：取FI+II+III沉淀，经过低温乙醇法分离提取FI+III，压滤，取上清即得；所述压滤过程中，采用BECO Steril PR40滤板，滤板用量为10～13m2/1000L血浆；以硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A用量为8～9g/L血浆；
FII沉淀的制备：取FI+III上清经过低温乙醇法分离FII，压滤，取沉淀即得；分离FII后的压滤过程中，使用PALL50滤板，滤板的用量为5～10m2/1000L；采用硅藻土A为助滤剂，预涂层所用硅藻土A为80-95g/平方米滤板，待滤液中硅藻土A的用量为0.2～0.3g/L血浆。
其中，本发明制备方法中，各个步骤中的压滤流速和滤板压力为：
本发明还提供了上述方法制备的白蛋白和球蛋白。
本发明还提供了血液制品中FI+II+III沉淀或FI+II+III上清的制备方法，它是以血浆为原料，经过低温乙醇法分离提取FI+II+III，压滤，分取沉淀或上清即得，所述压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A的用量为4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土A。
本发明方法采用特定的硅藻土、滤板种类和用量制备FI+II+III沉淀或上清，所得产品中球蛋白和白蛋白的含量大幅提高，并且，过滤过程中流量、压力以及滤液浊度均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。
本发明采用特定的硅藻土、滤板种类和用量对白蛋白和球蛋白制备过程进行改良后，有效提高了白蛋白和球蛋白收率，显著增加了商品利润，为企业带来的商业价值不可估量。
另外，本发明方法所得球蛋白成品中，IgA含量明显降低，可降低患者发生IgA抗原抗体不良反应的几率，从而提高产品安全性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 血浆制品的常规生产流程图
图2 本发明生产流程图
图3 使用C503型硅藻土助滤的现有技术生产流程图
图4 FI+II+III上清液电泳图谱，其中，A为本发明方法所得到的FI+II+III上清液电泳图谱，B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FI+II+III上清液电泳图谱。
图5 FI+II+III沉淀电泳图谱，其中，A为本发明方法所得到的FI+II+III沉淀电泳图谱，B为使用C503硅藻土助滤的现有方法得到的FI+II+III沉淀电泳图谱。
具体实施方式
本发明所用硅藻土均购自于Imerys Perlite China,Inc。
实施例1 本发明FI+II+III上清或沉淀的制备方法
取血浆，经过低温乙醇法对FI+II+III进行分离，再使用PALL50P滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，进行压滤，分取上清液即得FI+II+III上清，所得沉淀即为FI+II+III沉淀。其中，硅藻土和滤板的用量为：
硅藻土 4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土
滤板 10～13m2/1000L血浆
本发明所用硅藻土的检测结果如下：
(1)金属氧化范围使用XRF测定的百分比
(2)助熔煅烧品酸溶物质(2.0％上限)
(3)助熔煅烧品水溶物质(2.0％上限)
(4)比表面积
(5)离心湿密度
实施例2 本发明FI+II+III上清或沉淀的制备方法对产品的影响
通过电泳技术检测FI+II+III上清液和沉淀中白蛋白或球白蛋纯度，对本发明与使用C503型硅藻土的现有制备方法进行比较，结果见图4、5。其中，两种方法除了助滤方法不同外，其他操作均相同，在此条件下更能说明两种助滤方法带来的效果差异。
由图可知：
(1)本发明方法所得FI+II+III上清液电泳图谱(图4A)中，白蛋白峰面积约占86％，而使用C503硅藻土助滤得到的FI+II+III上清液白蛋白峰面积仅约占73％(图4B)。对比两者可以看出，本发明方法制备的FI+II+III上清中白蛋白纯度明显增高了13个百分点。
(2)本发明方法所得FI+II+III沉淀中球蛋白含量约为81％(图5A)，而使用C503硅藻土助滤得到的FI+II+III沉淀中球蛋白含量约为76％(图5B)。对比可知，本发明方法制备的FI+II+III沉淀中球蛋白纯度明显增高了约5个百分点。
上述结果表明，本发明方法对FI+II+III的提取分离效果明显优于现有技术。
实施例3 本发明球蛋白和白蛋白的制备方法
(1)按实施例1的方法制备FI+II+III上清和FI+II+III沉淀。
(2)取FI+II+III上清，经过低温乙醇法对FIV进行分离，再使用PALL50P滤板，同时以CELPURE1000硅藻土和900珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀，进行压滤，取上清液即得FIV上清。其中，硅藻土和滤板的用量为：
硅藻土 3.0～3.5g FI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土
珍珠岩 2.0～3.0g FI+II+III上清液蛋白/1g珍珠岩
滤板 10～13m2/1000L血浆
取FIV上清，经过低温乙醇法对FV进行分离，再使用PALL50P滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂，进行压滤，取沉淀即得FV沉淀。其中，硅藻土和滤板的用量为：
取FV沉淀，精制，即得白蛋白。
(3)取FI+II+III沉淀，经过低温乙醇法对FI+III进行分离，再使用BECOSteril PR40滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂与待滤液混匀，进行压滤，取上清液即得FI+III上清。其中，硅藻土和滤板的用量为：
硅藻土 8～9g/L血浆
滤板 10～13/1000L血浆
取FI+III上清，经过低温乙醇法对FII进行分离，再使用PALL50滤板，同时以CELPURE1000硅藻土为助滤剂进行压滤，取沉淀即得FII沉淀。其中，硅藻土和滤板的用量为：
待滤液所用硅藻土 0.2～0.3g/L血浆
预涂层中所用硅藻土 80-95g/m2滤板
滤板 5～10m2/1000L
取FII沉淀，精制，即得球蛋白。
以下通过压滤过程和产品的对比说明本发明的有益效果：
一、本发明制备方法中各步骤对压滤过程的影响
以下试验通过过滤流量、压力以及滤液浊度等指标，对本发明与使用C503型硅藻土的现有制备方法进行比较(FI+II+III阶段：C503硅藻土用量为3.0～4.0g血浆蛋白/1g硅藻土，3M60SP滤板用量为10～13m2/1000L血浆；FIV阶段：C503硅藻土用量为2.0～3.0gFI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土，900珍珠岩的用量为2.0～3.0gFI+II+III上清液蛋白/1g珍珠岩,PALL50P滤板用量10～13m2/1000L血浆；FV阶段：待滤液中C503硅藻土的用量为2.0～3.0g/L血浆，预涂层中硅藻土用量75‐85g/m2滤板，PALL ECO1000滤板用量10～13m2/1000L血浆；FI+III阶段：C503硅藻土用量11～13g/L血浆，3M60SP滤板用量10～13m2/1000L血浆；FII阶段：PALL ECO1000滤板用量5～10m2/1000L血浆，预涂层中C503硅藻土用量110～130g/m2滤板，待滤液中C503硅藻土用量0.3～0.5g/L血浆。)，其结果如下：
1、过滤流量
通过常规手段检测滤过速率，其结果如下：
表1过滤速率对比
由表1可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，除制备FII外，其他压滤过程中，单位时间内过滤流量明显增加，明显缩短了过滤时长，有助于整个生产工时的节省。
2、过滤压力
通过常规手段检测滤过压力，其结果如下：
表2过滤压力对比
由表2可知，与现有使用C503硅藻土的制备方法相比，除FII外，其他压滤过程中单位面积滤板承受的压力负荷明显降低。压力的降低，一方面降低了过滤过程中因过滤压力过高带来的安全隐患；另一方面，每种滤材均有其最大承受压力负荷，超过此负荷，其过滤效果将会下降，影响产品质量。过滤压力的下降也从一定程度上保证了产品质量。
从上述检测结果可以看出，在生产过程中，本发明制备方法过滤流量、压力均优于使用C503型硅藻土助滤的现有制备方法。
二、产品比较
1、终产品收率和纯度比较
取同批次的原料，按本发明方法制备的白蛋白、球蛋白与使用C503硅藻土传统工艺(精制方法相同)制备的白蛋白、球蛋白产品进行比较，其结果如下：
表3白蛋白、球蛋白收率及纯度
由上表可知，相对于使用C503硅藻土的传统工艺而言，利用本发明方法制备的白蛋白终产品，其白蛋白、球蛋白的收率和纯度均有一定提高。
(1)本发明方法所得白蛋白平均收率约为28.56g/L，较使用C503硅藻土传统工艺收率增加约0.5g/L，目前白蛋白市场价约为35-40元/g，如本发明所述，其收率提高0.5g/L，以企业平均每次生产量约1000L血浆计算，每次生产可增收500g白蛋白，按照市场价值预估，每次生产可提高利润约1.75-2万元。
(2)本发明方法所得球蛋白收率提高约0.5g/L，目前球蛋白市场价约为200元/g，以企业平均每次生产量约1000L血浆计算，每次生产可增收500g球蛋白，按照市场价值预估，每次生产可提高利润约10万元。
综合上述数据可知，本发明方法可以有效提高白蛋白和球蛋白产品的收率和纯度，尤其是收率的提高，明显提高了产品利润，其商业价值极其显著。
2、球蛋白中IgA含量比较
另外，对本发明方法和使用C503硅藻土传统工艺制备的球蛋白成品中的IgA含量进行测定，结果如下：
表4球蛋白中IgA含量
传统工艺球蛋白成品IgA含量(μg/ml) 本发明方法球蛋白成品IgA含量(μg/ml)
105.79 57.51
92.3 61.06
85.91 67.45
88.75 58
81.65 61.1
89.46 65.1
97.27
93.72
平均值：91.8 平均值：61.7
由上表可知，本发明方法所得球蛋白成品中，IgA含量明显降低，可降低患者发生IgA抗原抗体不良反应的几率，从而提高产品安全性。

Claims (8)

1.人血白蛋白和球蛋白的制备方法，它是以血浆为原料，经低温乙醇法分别依次制备得到FI+II+III上清和FI+II+III沉淀、FIV上清和FI+III上清、FV沉淀和FII沉淀，取FV沉淀和FII沉淀，精制，分别得到白蛋白和球蛋白；其特征在于：在制备FI+II+III沉淀或FI+II+III上清的压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A的用量为4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土A；所述硅藻土A中，SiO2含量为96.0～98.7％，Al2O3含量为0.6～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土A中，SiO2含量为96.0～96.2％，Al2O3含量为1.0～1.2％、Fe2O3含量为0.3～0.4％，酸溶物质含量为0.05～0.12％，水溶物质含量为0.15～0.20％。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土A的比表面积为2.2～2.3m2/g，优选为2.228m2/g。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土A的离心湿密度为0.23～0.24g/cm2，优选为0.237g/cm2。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述硅藻土A的型号为CELPURE1000。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的制备方法，其特征在于：
制备白蛋白过程中，FIV上清和FV沉淀的制备方法如下：
FIV上清的制备：以FI+II+III上清为原料，经过低温乙醇法分离FIV，压滤，取上清即得；所述压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A和珍珠岩为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A的用量为3.0～3.5g FI+II+III上清液蛋白/1g硅藻土；珍珠岩的用量为2.0～3.0gFI+II+III上清蛋白/1g珍珠岩；
FV沉淀的制备：取FIV上清经过低温乙醇法分离FV，压滤，取沉淀即得；分离FV后的压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A为助滤剂，其中，预涂层所用硅藻土A为40-60g/平方米滤板，待滤液中硅藻土A的用量为1.0～1.5g/L血浆；
制备球蛋白过程中，FI+III上清和FII沉淀的制备方法如下：
FI+III上清的制备：取FI+II+III沉淀，经过低温乙醇法分离提取FI+III，压滤，取上清即得；所述压滤过程中，采用BECO Steril PR40滤板，滤板用量为10～13m2/1000L血浆；以硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A用量为8～9g/L血浆；
FII沉淀的制备：取FI+III上清经过低温乙醇法分离FII，压滤，取沉淀即得；分离FII后的压滤过程中，使用PALL50滤板，滤板的用量为5～10m2/1000L；采用硅藻土A为助滤剂，预涂层所用硅藻土A为80-95g/m2滤板，待滤液中硅藻土A的用量为0.2～0.3g/L血浆。
7.权利要求1～6任意一项所述方法制备的白蛋白和球蛋白。
8.血液制品中FI+II+III沉淀或FI+II+III上清的制备方法，它是以血浆为原料，经过低温乙醇法分离提取FI+II+III，压滤，分取沉淀或上清即得，其特征在于：所述压滤过程中，使用PALL50P滤板，滤板的用量为10～13m2/1000L血浆；采用硅藻土A为助滤剂与待滤液混匀，硅藻土A的用量为4.5～5.5g血浆蛋白/1g硅藻土A。
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