CN104072604B - 一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法。本发明通过固相合成方法替度鲁肽对定点的PEG修饰，从而改变替度鲁肽的性质。其主要优点是可以延长蛋白质（多肽）在体内的半衰期，降低免疫原性和抗原性。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法。
背景技术
短肠综合征（SBS）是指由于严重小肠疾病或外科手术切除大部分小肠导致机体无法正常吸收营养而引发一系列综合征。SBS降低了患者摄取液体和营养物质的能力，导致他们脱水和营养不良。而肠外营养支持治疗又将增加全身感染和其他长期并发症的风险，迄今为止尚无药物可以治疗短肠综合征。
替度鲁肽(teduglutide)是一种胰高血糖素样肽2（GLP-2）类似物，是一种天然生成的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。替度鲁肽于2001年被定性为孤儿药。临床试验表明，该药能够降低短肠综合征患者对胃肠外营养的需求。
常规的替度鲁肽含有蛋白质（多肽）类药物常有的弊病。例如半衰期短，有免疫原性，易被蛋白水解酶降解，溶解性差等。传统的PEG修饰多为随机修饰，存在修饰剂呈现多种聚合度、选择性不够高、修饰后的蛋白质分子Mr分布宽、活性降低、稳定性有时不够理想等突出问题。因此，提供一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法具有现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法。本发明通过固相合成方法替度鲁肽对定点的PEG修饰，从而改变替度鲁肽的性质。其主要优点是可以延长蛋白质（多肽）在体内的半衰期，降低免疫原性和抗原性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物，其N端氨基和/或Lys侧链氨基通过酰胺键与单甲氧基PEG衍生物偶联。
在本发明的一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物的分子量为1000～40000Da。
在本发明的另一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物的分子量为2000～20000Da。
在本发明的另一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物的分子量为5000～10000Da。
在本发明的一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物为直链型或支链型。
在本发明的一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物选自mPEG琥珀酰亚胺丙酸酯（mPEG-SPA）、mPEG琥珀酰亚胺丁酸酯（mPEG-SBA）或mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC）。本发明在此不作限定。
在本发明的另一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物选自Lys-mPEG2或Tris-mPEG3。
本发明还提供了一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物的固相制备方法，包括如下步骤：
步骤1、取Asp与固相载体偶联，获得固相载体-Asp；
步骤2、取固相载体-Asp逐步偶联氨基酸，获得固相载体-多肽，多肽的序列如SEQID No.1所示；
步骤3、脱除固相载体-多肽的N端氨基的保护基团和/或Lys侧链氨基的保护基团后，单甲氧基PEG衍生物通过酰胺键与N端氨基和/或Lys侧链氨基偶联，裂解、纯化后，即得。
本发明提供的一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物的固相制备方法中，单甲氧基PEG衍生物是指通过酰胺键与N端氨基或赖氨酸侧链氨基偶联的任何活化PEG衍生物。本发明在此不作限定。
在本发明的一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物的分子量为1000～40000Da。
在本发明的另一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物的分子量为2000～20000Da。
在本发明的另一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物的分子量为5000～10000Da。
在本发明的一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物为直链型或支链型。
在本发明的一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物选自mPEG琥珀酰亚胺丙酸酯（mPEG-SPA）、mPEG琥珀酰亚胺丁酸酯（mPEG-SBA）或mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC）。
在本发明的另一些实施例中，单甲氧基PEG衍生物选自Lys-mPEG2或Tris-mPEG3。
在本发明的一些实施例中，N端氨基的保护基团为Fmoc。
在本发明的一些实施例中，Lys侧链氨基的保护基团为mmt，mtt，Alloc或Trt。
作为优选，Trt侧链保护基只在PEG单修饰N端氨基酸时使用。
在本发明的一些实施例中，N端氨基的保护基团的脱除剂为20%哌啶/DMF溶液。
在本发明的另一些实施例中，Lys侧链氨基的保护基团的脱除剂为TFA或四三苯基膦钯/苯硅烷。
作为优选，选择性脱除mmt或mtt采用TFA，选择性脱除Alloc采用四三苯基膦钯/苯硅烷。
本发明还提供了上述固相制备方法获得的替度鲁肽的聚乙二醇偶合物。
本发明提供一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法。本发明通过固相合成方法替度鲁肽对定点的PEG修饰，从而改变替度鲁肽的性质。其主要优点是可以延长蛋白质（多肽）在体内的半衰期，降低免疫原性和抗原性。
附图说明
图1示替度鲁肽及本发明提供的替度鲁肽的聚乙二醇偶合物的药代试验结果；其中，线1示替度鲁肽，线2示实施例12制备的PEG2000修饰的替度鲁肽，线3示实施例15制备的PEG5000修饰的替度鲁肽，线4示实施例21制备的PEG10000修饰的替度鲁肽，线5示实施例19制备的PEG20000修饰的替度鲁肽；
图2示替度鲁肽及本发明提供的替度鲁肽的聚乙二醇偶合物对小鼠体重修复的影响；其中，线1示替度鲁肽，线2示实施例12制备的PEG2000修饰的替度鲁肽，线3示实施例15制备的PEG5000修饰的替度鲁肽，线4示实施例21制备的PEG10000修饰的替度鲁肽，线5示实施例19制备的PEG20000修饰的替度鲁肽。
具体实施方式
本发明公开了一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的替度鲁肽的聚乙二醇偶合物及其固相制备方法中所用原料及制剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取4.94g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（12mmol）、1.95g HOBt（14.4mmol）和0.15g DMAP（1.2mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.25ml DIC（14.4mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.098mmol/g。
实施例2：替代度为0.19mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.38g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（22.8mmol）、3.70g HOBt（27.4mmol）和0.28g DMAP（0.23mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.28mlDIC（27.4mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.192mmol/g。
实施例3：替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取7.42g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（18mmol）、2.92g HOBt（21.6mmol）和0.22g DMAP（1.8mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.38ml DIC（21.6mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.150mmol/g。
实施例4：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的替度鲁肽肽树脂的制备
称取替代度为0.150mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂33.3g（5mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取5.97g Fmoc-Thr(tBu)-OH（15mmol），2.43g HOBt（18mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC（18mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序顺序偶联。其中偶联Lys的原料为Fmoc-Lys(mmt)-OH。偶联完最后一个氨基酸His后不需要脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mmt)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin树脂。
实施例5：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的替度鲁肽肽树脂的制备
称取替代度为0.150mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂33.3g（5mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。
用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取5.97g Fmoc-Thr(tBu)-OH（15mmol），2.43g HOBt（18mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC（18mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序顺序偶联。其中偶联Lys的原料为Fmoc-Lys(mtt)-OH。偶联完最后一个氨基酸His后不需要脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mtt)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin树脂。
实施例6：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的替度鲁肽肽树脂的制备
称取替代度为0.150mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂33.3g（5mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。
用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取5.97g Fmoc-Thr(tBu)-OH（15mmol），2.43g HOBt（18mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC（18mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序顺序偶联。其中偶联Lys的原料为Fmoc-Lys(Alloc)-OH。偶联完最后一个氨基酸His后不需要脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Alloc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin树脂。
实施例7：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的替度鲁肽肽树脂的制备
称取替代度为0.150mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂33.3g（5mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取5.97g Fmoc-Thr(tBu)-OH（15mmol），2.43g HOBt（18mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入2.82ml DIC（18mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序顺序偶联。其中偶联Lys的原料为Fmoc-Lys(Trt)-OH。偶联完最后一个氨基酸His后不需要脱除Fmoc。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Trt)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin树脂。
实施例8：替度鲁肽赖氨酸侧链保护基的选择性脱除
将实施例4或实施例5中的肽树脂加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DCM溶胀树脂30分钟，抽干DCM。加入5%TFA/DCM溶液300ml，室温反应2h。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂显色，说明Lys侧链保护已经脱除。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
实施例9：替度鲁肽赖氨酸侧链保护基的选择性脱除
将实施例6中的肽树脂加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DCM溶胀树脂30分钟，抽干DCM。加入300mlDCM做为溶剂，再加入7.40ml苯基硅烷（60mmol），反应3分钟，再加入1.56g Pd(PPh3)4（1.35mmol），室温反应45分钟，抽掉反应液，茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
实施例10：替度鲁肽赖氨酸侧链单PEG修饰的制备
将实施例8或9中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。以400mlDMF为溶剂，称取10g直链mPEG(1000)-SC（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明赖氨酸侧链氨基已与mPEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(1000))-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys(mPEG(1000))-Ile-Thr-Asp-OH的精肽3.26g。纯度为98.6%。
实施例11：替度鲁肽赖氨酸侧链单PEG修饰的制备
将实施例8或9中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。以400mlDMF为溶剂，
称取400g直链mPEG(40000)-SC（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明赖氨酸侧链氨基已与mPEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(40000))-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys(mPEG(40000))-Ile-Thr-Asp-OH的精肽21.77g，纯度为97.6%。
实施例12：替度鲁肽赖氨酸侧链单PEG修饰的制备
将实施例8或9中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。以400mlDMF为溶剂，称取20g直链mPEG(2000)-SBA（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明赖氨酸侧链氨基已与mPEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(2000))-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys(mPEG(2000))-Ile-Thr-Asp-OH的精肽3.74g，纯度为97.9%。
实施例13：替度鲁肽赖氨酸侧链单PEG修饰的制备
将实施例8或9中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。以400mlDMF为溶剂，称取40g直链mPEG(4000)-SPA（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明赖氨酸侧链氨基已与mPEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(4000))-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys(mPEG(4000))-Ile-Thr-Asp-OH的精肽5.26g，纯度为98.1%。
其中，mPEG-SPA为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯，结构如式Ⅰ所示：
式Ⅰ
实施例14：替度鲁肽赖氨酸侧链单PEG修饰的制备
将实施例8或9中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。以400mlDMF为溶剂，称取40g Lys-mPEG2(4000)（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明赖氨酸侧链氨基已与mPEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Lys-mPEG2(4000))-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为H-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys(Lys-mPEG2(4000))-Ile-Thr-Asp-OH的精肽4.78g，纯度为98.6%。
其中，Lys-mPEG2的结构如式Ⅱ所示：
式Ⅱ。
实施例15：替度鲁肽N端氨基单PEG修饰的制备
将实施例4中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。以400mlDMF为溶剂，称取50g直链mPEG(5000)-SC（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明N端氨基已与PEG偶合。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到mPEG(5000)-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mmt)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-WangResin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为mPEG(5000)-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH的精肽5.71g，纯度为97.3%。
实施例16：替度鲁肽N端氨基单PEG修饰的制备
将实施例5中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。以400mlDMF为溶剂，称取100g Tris-mPEG3（10000）（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明N端氨基已与PEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到Tris-mPEG3(10000)-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mtt)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为Tris-mPEG3-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH的精肽6.71g，纯度为96.9%。
其中，Tris-mPEG3的结构如式Ⅲ所示：
式Ⅲ。
实施例17：替度鲁肽N端氨基单PEG修饰的制备
将实施例6中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。以400mlDMF为溶剂，称取100g Tris-mPEG3（10000）（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明N端氨基已与PEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。加入300mlDCM做为溶剂，再加入7.40ml苯基硅烷（60mmol），反应3分钟，再加入1.56g Pd(PPh3)4（1.35mmol），室温反应45分钟，抽掉反应液，茚三酮检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到Tris-mPEG3(10000)-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为Tris-mPEG3(10000)-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH的精肽6.54g，纯度为97.1%。
实施例18：替度鲁肽N端氨基单PEG修饰的制备
将实施例7中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。以400mlDMF为溶剂，称取80g mPEG-SPA(8000)（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明N端氨基已与PEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到mPEG(8000)-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Trt)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-WangResin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为mPEG(8000)-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH的精肽5.85g，纯度为97.7%。
实施例19：替度鲁肽N端氨基单PEG修饰的制备
将实施例7中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。以400mlDMF为溶剂，称取200g mPEG-SPA(20000)（10mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明N端氨基已与PEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到mPEG(20000)-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Trt)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-WangResin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为mPEG(20000)-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH的精肽7.02g，纯度为97.1%。
实施例20：替度鲁肽双PEG修饰的制备
将实施例8或9中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。以400mlDMF为溶剂，称取40g直链mPEG(2000)-SPA（20mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明N端和赖氨酸侧链氨基已与mPEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到mPEG(2000)-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(mPEG(2000))-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为mPEG(2000)-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys(mPEG(2000))-Ile-Thr-Asp-OH的精肽3.62g，纯度为98.1%。
实施例21：替度鲁肽双PEG修饰的制备
将实施例8或9中的肽树脂（5mmol）加入到固相反应柱中，用DCM洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，抽干DMF。用DBLK脱除N端Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。以400mlDMF为溶剂，称取100g Lys-mPEG2(10000)（20mmol），加入上述溶液中，适当摇匀使PEG溶解并与肽树脂混合均匀，在室温条件下反应2h，茚三酮检测无色透明，说明N端和赖氨酸侧链氨基已与mPEG偶合，抽干反应液，DMF洗涤6次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到Lys-mPEG2(10000)-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Lys-mPEG2(10000))-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂。
将肽树脂置于反应烧瓶中。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：
苯甲硫醚：乙二硫醇：苯甲醚=90:5:3:2（V:V），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液。加入冰冻的无水乙醚沉淀（无水乙醚用量为100ml/g树脂），将沉淀离心，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体。
离子交换层析和反相高效液相色谱纯化后得到结构为Lys-mPEG2(10000)-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys(Lys-mPEG2(10000))-Ile-Thr-Asp-OH的精肽4.56g，纯度为98.3%。
实施例22替度鲁肽与本发明提供的PEG修饰替度鲁肽化合物的药代实验
取雄性昆明小鼠（体重250～300g），实验前小鼠不禁食禁水，随机分为5组，每组6只。
对照组：每支分别以50μg/kg的量皮下单次注射替度鲁肽
试验组1：每支分别单次注射含有50μg/kg的替度鲁肽量的实施例12制备的赖氨酸mPEG单取代修饰替度鲁肽化合物（PEG2000）；
试验组2：每支分别单次注射含有50μg/kg的替度鲁肽量的实施例15制备的N端mPEG单取代修饰替度鲁肽化合物（PEG5000）
试验组3：每支分别单次注射含有50μg/kg的替度鲁肽量的实施例21制备的mPEG双修饰替度鲁肽化合物（PEG10000）
试验组4：每支分别单次注射含有50μg/kg的替度鲁肽量的实施例19制备的N端mPEG单取代修饰替度鲁肽化合物（PEG20000）
注射后0，1，2，4，8，12，18，24，36，48，72，96小时尾尖采血，血药浓度采用美国康肽公司试剂盒检测，结果如图1。
经计算，各组化合物的半衰期见表1。
表1药代试验结果
实验结果表明，替度鲁肽的PEG取代化合物能够有效延长药物半衰期，并且延长时间与PEG分子量成正比关系。当取代PEG分子量达到20000时间，其半衰期约为替度鲁肽的20倍。
实施例22：PEG修饰替度鲁肽化合物对体重修复的影响
Wistar大鼠40只行75%小肠切除术后随机分成4组，分别为短肠空白组(空白组，n=10)、短肠替度鲁肽（PEG2000，实施例12制备）组(n=10)、短肠替度鲁肽（PEG5000，实施例15制备）组(n=10)、短肠替度鲁肽（PEG10000，实施例21制备）组(n=10)和短肠替度鲁肽（PEG20000，实施例19制备）组(n=10)，按相应时间相同方法获取标本。所得结果如图2。
结果显示，在小肠切除术后，空白组小鼠体重随时间延长不停下降，而替度鲁肽的PEG取代化合物能够有效的抑制术后的体重下降，并能够一定程度上起到恢复体重的功效。
实施例23：PEG修饰替度鲁肽化合物对对短肠大鼠残留小肠水和葡萄糖吸收的影响
Wistar大鼠20只行75%小肠切除术后分成两组，一组做为短肠空白组（空白组，n=10），不做处置，一组为短肠替度鲁肽（PEG10000，实施例21制备）组(n=10)，皮下注射替度鲁肽（PEG10000，实施例21制备）。6天后麻醉后开腹，以5-0丝线结扎肠壁边缘血管支，获取相应空、回肠段备作组织切片和RT-PCR检测，保留吻合口上下11.5cm肠段进行在体循环灌流实验。分别给予生理盐水水和15mmol/L的葡萄糖供试液。另设一组正常进食大鼠(正常组，n=10)作空白组的对照组。测定每厘米回肠45min水和葡萄糖的吸收量，结果见表2。
表2PEG修饰替度鲁肽化合物对对短肠大鼠残留小肠水和葡萄糖吸收的影响
实验结果显示，PEG修饰替度鲁肽化合物能显著促进残留小肠单位长度的葡萄糖及水的吸收。从而改善SBS症状。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种替度鲁肽的聚乙二醇偶合物，其特征在于，其N端氨基通过酰胺键与单甲氧基PEG衍生物偶联；
所述单甲氧基PEG衍生物选自mPEG琥珀酰亚胺丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯。
2.一种如权利要求1所述的替度鲁肽的聚乙二醇偶合物的固相制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、取Asp与固相载体偶联，获得固相载体-Asp；
步骤2、取所述固相载体-Asp逐步偶联氨基酸，获得固相载体-多肽，所述多肽的序列如SEQ ID No.1所示；
步骤3、脱除所述固相载体-多肽的N端氨基的保护基团和/或Lys侧链氨基的保护基团后，单甲氧基PEG衍生物通过酰胺键与所述N端氨基和/或所述Lys侧链氨基偶联，裂解、纯化后，即得。
3.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述单甲氧基PEG衍生物的分子量为1000～40000Da。
4.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述单甲氧基PEG衍生物的分子量为2000～20000Da。
5.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述单甲氧基PEG衍生物的分子量为5000～10000Da。
6.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述单甲氧基PEG衍生物为直链型或支链型。
7.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述单甲氧基PEG衍生物选自mPEG琥珀酰亚胺丙酸酯、mPEG琥珀酰亚胺丁酸酯或mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯。
8.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述单甲氧基PEG衍生物选自Lys-mPEG2或Tris-mPEG3。
9.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述N端氨基的保护基团为Fmoc。
10.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，Lys侧链氨基的保护基团为mmt，mtt，Alloc或Trt。
11.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，所述N端氨基的保护基团的脱除剂为20％哌啶/DMF溶液。
12.根据权利要求2所述的固相制备方法，其特征在于，Lys侧链氨基的保护基团的脱除剂为TFA或四三苯基膦钯/苯硅烷。
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2013
- 2013-03-27 CN CN201310102207.5A patent/CN104072604B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2010042145A1 (en) * | 2008-09-19 | 2010-04-15 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of glp-2-like peptides |
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| CN109438568A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-08 | 湖南华腾制药有限公司 | 单分散聚乙二醇单甲醚修饰的白介素il-12前药的制备与应用 |
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