CN104066849B - 样品处理方法和样品处理盒 - Google Patents
样品处理方法和样品处理盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104066849B CN104066849B CN201280050079.8A CN201280050079A CN104066849B CN 104066849 B CN104066849 B CN 104066849B CN 201280050079 A CN201280050079 A CN 201280050079A CN 104066849 B CN104066849 B CN 104066849B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- fluid
- box body
- reaction bin
- shuttle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
- B01L2200/025—Align devices or objects to ensure defined positions relative to each other
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
- B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/06—Fluid handling related problems
- B01L2200/0689—Sealing
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
- B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/0681—Filter
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
- B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
- B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2400/00—Moving or stopping fluids
- B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
- B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
- B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
- B01L3/5082—Test tubes per se
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
- B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
Abstract
本发明尤其涉及用于分析包含生物分子的样品的方法,所述方法包含下列步骤:A)a)裂解所述样品以提供裂解的样品,并任选地澄清所述裂解的样品;b)将至少一部分所述裂解的样品与包含用于执行所述分析方法的试剂的干组合物相接触,由此提供重构的组合物;c)使用所述重构的组合物执行分析方法;或B)a)将所述样品与裂解溶液相接触,由此提供裂解混合物;b)使用所述裂解混合物来重构包含用于执行所述分析方法的试剂的干组合物,由此提供重构的组合物;c)使用所述重构的组合物执行分析方法,其中所述重构的组合物任选地被澄清,并且其中在步骤b)之后执行支持所述样品的裂解的至少一个步骤。此外,提供了特别适合的处理盒和系统。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,并提供了用于重构包含执行分析方法、澄清裂解物所用试剂的干组合物的方法,使用重构的干组合物和可用于处理样品的特定盒来检测生物分子的分析方法。
背景技术
目前,对处理生物样品并检测和分析其中包含的生物分子的快速分析方法,存在着极大需求。这样的分析方法的先决条件是使待分析的生物分子例如核酸可用于所述分析方法,使得目标生物分子以能够被分析的量和足以用于目标分析方法的纯度被提供。例如,对于分析例如检测核酸来说,广泛使用的方法是扩增目标核酸的聚合酶链反应(PCR)。PCR是一种分析方法,因为通过选择特异性引物,可以鉴定样品中包含的核酸群体中相应序列的存在。此外,PCR扩增本身可能是进一步分析的主题,例如它可以被检测、测序、鉴定或进行其他分析。等温核酸扩增和检测反应是PCR的公知可替选方法。这种类型的分析方法的实例是LAMP(环介导的等温扩增)、RPA(重组酶聚合酶扩增)、tHDA(螺旋依赖性扩增)、NEAR(切口酶扩增反应)、TMA(转录介导的扩增)和NASBA(基于核酸序列的扩增)。
由于情况通常是必须同时处理较大量的不同样品,因此理想情况下对这样的分析使用廉价省时的方法。因此,希望能够分析目标生物分子而不用首先纯化它们,并因此能够使用包含目标生物分子的粗裂解物来执行分析方法。通过克服对首先分离生物分子的需要,可以节省时间和成本。为了能够在分析方法例如扩增反应中使用粗裂解物,必须仔细地选择裂解条件,因为如果选择了不适合的条件或缓冲系统,则分析方法不能足够准确地进行。具体来说,重要的是减少或中和可能抑制目标分析方法的污染物。能够在扩增反应中直接使用粗裂解物的适合的裂解缓冲液描述在例如US2011/0177516中。其中公开的裂解缓冲液包含结合或中和裂解物中包含的PCR抑制剂的结合剂或增稠剂例如PVP。然而,对于提供用于提供能够在分析方法例如扩增方法中直接使用的裂解物的改进的方法,仍存在需求。具体来说,对于提供允许更有效地移除可能潜在地干扰目标分析方法的污染物的裂解方法,存在着需求。
为了能够高成本效益地并且也在非专门机构中执行分析方法,对于提供廉价、可简单管理的全生物分子分析方法,存在着需求。目前,用于传染病诊断或癌症检测和监测的遗传试验的涉及核酸扩增的分析方法,是在诊断实验室中的常见方法。大量专用装置通过对许多流程步骤进行自动化,使试验容易进行。大部分试验目前在中央实验室中使用非便携且操作复杂的仪器进行。目前,试验一般需要非常专业的个人来进行分析。结果,在获得怀疑含有特定核酸片段的样品与确定其是否存在之间花费的时间,通常为几小时或甚至数日。然而,与其他类型的分析化验相同,医生和其他人常常要求结果更快并且可以以方便的用户友好的格式获得。因此,对于能够快速方便地进行核酸试验的便携分析系统,存在着需求。同时,对所谓的“一体化”装置进行了工程设计,并且在构造上存在小型化的趋势。这种演变产生了“芯片实验室”(Lab-on-a-Chip)(LoC)系统,其中最精巧的能够进行从样品到结果的诊断试验。因此,可以获得在小型化系统例如盒中执行分析方法的系统。相应的盒描述在例如WO2006/071770、US2009/0130658、WO2006/042734和DE102008004646中。
相应的盒通常包含执行目标分析方法所必需的试剂,其采取干燥形式、优选地冷冻干燥形式。试剂的干组合物被广泛用于分析方法中,特别是用于扩增反应例如聚合酶链反应中或用于检测其他被分析物例如蛋白质。相应的干组合物通常包含分析方法所必需的一种或多种或甚至所有试剂,例如酶、检测化合物例如标记的抗体或探针、缓冲剂、盐、寡核苷酸等。相应的干组合物、特别是冷冻干燥的组合物的使用具有干组合物在储存期间稳定的优点,因此相应的冷冻干燥的组合物通常使用在盒中以提供在盒中执行分析方法所必需的所有试剂。以相应的干燥形式提供试剂,具有用户不必自己合并必需试剂的优点。相反,仅仅加入预定量的液体例如水或适合的缓冲液来重构干燥试剂,由此提供适合于在一旦掺入包含例如核酸的样品后即可执行目标分析方法的反应混合物。在这里,重要的是为重构过程加热预定量的液体,以便确保试剂以适合的浓度提供。为此目的,通常将泵或分发装置与盒联合使用。此外,相应的盒也被设计并装配有适合的试剂和组分例如磁性粒子,以允许在执行目标分析方法、尤其是例如PCR方法之前,从样品纯化生物分子,尤其是核酸。在这些系统中进行纯化是为了确保核酸以足够纯的形式提供,以便能够进行分析方法例如尤其是扩增方法。因此,已知的LoC系统具有盒具有相当复杂的设计,此外为了确保分析方法的性能在盒中进行的过程通常也相当复杂的缺点。目前的系统为了在芯片内进行样品处理,需要几种样品处理缓冲液和其他溶液。此外,为了处理特定体积的用于样品处理的所述缓冲液,需要复杂的阀、泵和其他机构。这增加了相应盒的成本。因此,对于使用相应盒系统执行目标分析方法的更简单的方法,存在着需求。此外,对于提供设计更简单的盒,尤其是可以以较低成本生产的盒,存在着需求。
本发明的目的是克服上述现有技术方法和系统的至少一种缺点和/或对它们进行改良。此外,本发明的目的针对至少一种上述需求。
发明概述
根据本发明的第一方面,提供了一种用于分析包含生物分子的样品的分析方法,其中所述方法包括包含用于执行所述分析方法的试剂的干组合物的重构。在这里,本发明人发现了一种快速方法,其允许不需首先纯化生物分子或使用重构溶液例如重构缓冲液或水来重构干组合物,即可重构相应的干组合物。
在第一子方面A中,所述方法包括下列步骤:
a)将所述样品裂解以提供裂解的样品,并任选地澄清所述裂解的样品;
b)将至少一部分裂解的样品与包含用于执行所述分析方法的试剂的干组合物相接触,由此提供重构的组合物;
c)使用所述重构的组合物执行分析方法。
本发明人令人吃惊地发现,通过直接使用裂解的样品,可以重构包含用于执行所述分析方法的试剂的干组合物。因此,与现有技术方法相反,不必通过在加入裂解的样品之前加入例如水或适合的缓冲液来重构干组合物。相反,优选地从污染物例如特别是沉淀物澄清的裂解的样品,可以直接用于重构。因此,不需首先纯化生物分子和/或通过加入分开的液体来重构干组合物。相反,在裂解后,将裂解的样品与用于重构的干组合物直接进行接触。这相当多地节省时间,并且使相应的过程特别适合使用在处理盒中,当所述处理盒被用于LoC系统中时。不需分开的用于纯化生物分子和/或用于重构样品的试剂。整个方法(相应地处理盒)可以用裂解的样品来运行。因此,当用裂解溶液进行样品裂解时,只需一种溶液即可进行所有要求的过程步骤。有利的是,可以将样品直接收集在适合的裂解溶液中,由此省去进一步的处理步骤。因此,提供了用于执行分析方法的惊人简单和快速的方法,所述分析方法涉及使用包含用于执行目标分析方法的试剂的干组合物。
根据第二子方面B,所述方法包括下列步骤:
a)将所述样品与裂解溶液相接触,由此提供裂解混合物;
b)使用所述裂解混合物来重构包含用于执行所述分析方法的试剂的干组合物,由此提供重构的组合物;
c)使用所述重构的组合物执行分析方法,
其中所述重构的组合物任选地被澄清,并且其中在步骤b)后进行支持所述样品裂解的至少一个步骤。
本发明人发现,也可以在裂解样品之前有效地重构干组合物。在这种变化形式中,将包含与裂解溶液混合的样品的裂解混合物用于重构干组合物,因此将所述干组合物提供为重构的混合物,所述混合物除了用于执行所述分析方法的试剂之外,还包含样品和裂解溶液。在重构后,进行至少一个步骤、优选为加热步骤,以便(充分)裂解包含在重构的混合物中的样品。所述步骤可以在步骤c)之前,例如作为分开的中间步骤来进行。然而,裂解也可以在执行分析方法期间实现或完成。这在分析方法包含加热步骤的情况下是特别可行的。由此,所述方法能够节省过程步骤。
根据第二方面,本发明涉及将裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品或与裂解溶液混合的样品用于重构包含用于执行分析方法的试剂的干组合物,所述使用经向干组合物加入裂解的样品或与裂解溶液混合的样品并进行混合。
正如上面讨论的,本发明人发现,通过至少加入裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品或包含与裂解溶液混合的样品的裂解混合物的等分试样,可以重构包含用于执行分析方法例如PCR方法的试剂的干组合物。由此,提供了适用于执行分析方法的重构的组合物。直接使用优选地在使用之前进行澄清的裂解的样品,具有可以节约时间和重构试剂的优点。此外,本发明人发现,通过加入包含样品和裂解溶液的裂解混合物,可以实现干组合物的有效重构。由此,可以相当大地简化重构过程。
根据第三方面,本发明涉及用于澄清样品除去沉淀物的方法,其中将样品在裂解之前、期间或之后与至少一种固相支持物相接触,所述固相支持物结合源自于裂解的样品的沉淀物,由此与沉淀物形成复合物,并且其中任选地将所述复合物与残留的样品分离开。
这种方法在提供澄清的裂解的样品方面特别有效。本发明人开发了特别适合于澄清裂解的样品以除去可以抑制分析方法的污染物例如沉淀物的方法。正如由实例所示,沉淀物的有效结合提高随后的分析方法的性能,尤其是在打算进行扩增反应时,因为相应的方法可以受到从裂解的样品带入到分析反应中的沉淀物的抑制。此外,正如由实例所示,使用所述方法也适合于澄清重构的组合物以除去相应的抑制性污染物。
根据第四方面,提供了用于提高酸性样品的pH值的方法,所述方法包括向所述样品加入分子筛例如沸石以提高酸性样品的pH值。这种方法可以有利地使用,以便例如将裂解的样品的pH值从酸性到中性调整到碱性pH范围。
根据第五方面,本发明涉及一种处理盒,其适用于本发明的第一方面的用于分析包含生物分子的样品的方法,其中所述处理盒包含盒体和至少一个反应仓室,所述反应仓室包含含有用于执行分析方法的试剂的干组合物,其中所述盒体包含样品摄入口、至少一个样品出口以及连接所述样品摄入口与所述样品出口的流体通路,其中所述样品出口通入所述反应仓室,其中所述盒被设计成通过经所述样品摄入口进入所述盒的样品来实现所述反应仓室中包含的干组合物的重构。
本发明人开发了与现有技术盒相比明显简单的盒设计。在所述盒内发生的整个过程,由通过样品入口进入盒的样品来操作。样品被提供成适用于重构干组合物的形式,以便可以以足够的灵敏度和/或特异性执行所述目标分析方法。为此目的,在一种实施方式中,样品是预处理过的样品,例如上面描述的裂解的样品。预处理可以有利地发生在用于收集样品的容器中,并且所述容器可以组装到处理盒以使样品容器开口与样品摄入口流体连接,由此允许预处理过的样品进入盒体。通过样品摄入口进入盒的样品优选地是裂解的样品,更优选地是澄清的裂解的样品。此外,样品可以是包含样品和裂解溶液的裂解混合物。在相应的裂解混合物中,样品的裂解尚未完成。正如本文中所示,可以在使用所述裂解混合物重构干组合物之后,通过例如在分析例如PCR反应期间进行的简单加热步骤来完成裂解。因此,有利的是,为了实现干组合物的重构,在用于纯化样品中包含的生物分子的处理盒或用于将液体例如水或缓冲液从储液器分配到反应仓室的机构中,不提供分离机构。相反,干组合物在反应仓室内的重构,通过经样品入口进入盒的样品来实现。由于盒的简单设计,可以以非常低的成本生产盒。此外,相应的简单的盒设计与更复杂的设计相比易错性更低。
根据第六方面,提供了一种盒体,其适合于提供从含有流体并且可以组装到所述盒体的样品容器到可以组装到所述盒体或被提供为所述盒体的有机组成部分的至少一个反应仓室的流体连接,所述盒体包含
-样品摄入口和样品出口,
-连接所述样品摄入口与所述样品出口的样品通路,
-用于连接所述样品容器的样品容器连接突起物,其中在将所述样品容器组装到所述连接突起物之后,所述样品摄入口与所述样品容器流体连通,
-用于连接反应仓室的至少一个反应仓室连接突起物,其中在将所述反应仓室组装到所述连接突起物之后,所述样品出口与所述反应仓室流体连通,和/或包含被提供为所述盒体的有机组成部分的至少一个反应仓室
其中至少一个流体开口A被提供在所述反应仓室连接突起物和/或所述反应仓室中,并且其中所述流体开口A包含阻挡物,其中所述阻挡物至少在所述阻挡物与液体发生接触之前允许空气通过,但是其中所述阻挡物基本上阻止液体通过。
本发明的第六方面的盒体具有下述优点,即它包含成本效益高的灵巧设计,允许容易地重构反应仓室中包含的干组合物,正如在本发明的详细描述中进一步解释的。至少一个反应仓室被通过样品摄入口进入盒体并通过提供在至少一个反应仓室处的流体通路到达的样品的填充,由包含在流体开口A中的用于液体的阻挡物来控制。所述阻挡物优选地是多孔疏水膜,其允许空气通过(至少在润湿之前)但基本上不允许样品通过。一旦样品到达所述疏水膜,它不能通过所述膜,并且反应仓室的填充自动停止,由此确保干组合物被预定的足够量的样品重构,所述样品优选地是如上所述的澄清的裂解的样品。所述盒体可以有利地用作本发明的第五方面的处理盒中的盒体。
根据第七方面,提供了用于生产本发明的第五方面的处理盒的方法,所述处理盒包含反应仓室,所述反应仓室包含含有用于执行分析方法的试剂的干组合物,所述方法包括下列步骤:
(a)从聚合物制造盒体,所述盒体具有至少一个通道和/或空腔,以在所述盒体的样品摄入口与所述盒体的至少一个样品出口之间提供流体通路;
(b)将试剂点样到至少一个反应仓室中并干燥其中的试剂,由此提供包含含有用于执行分析方法的试剂的干组合物的反应仓室;
(c)用盖子封闭所述盒体的至少一个通道和/或空腔。
由于所述盒的简单有效的设计,它的生产是成本效益非常高的。
根据第八方面,提供了用于执行包含生物分子的样品的分析方法的系统,所述系统包含:
a)本发明的第五方面的处理盒,其中所述处理盒包含至少一个反应仓室,所述反应仓室包含含有用于所述分析方法的试剂的干组合物;
b)用于接收包含生物分子的样品的容器,其中所述容器可以组装到所述处理盒;
c)处理装置,其用于接收包含被组装的容器的处理盒,并与所述处理盒联合用于执行所述分析方法。
由于盒的独特设计以及在样品容器内处理样品以提供适合于重构干组合物的预处理过的样品、例如澄清的裂解的样品的可能性,相应的系统具有下述优点,即所述系统可以低成本自动地处理样品。此外,由于所述处理装置相当简单并且尺寸小,因此它可以例如与现场护理诊断联合,用于任何实验室或收集并分析样品的设施中。
根据第九方面,提供了使用本发明的第七方面的系统执行分析方法和操作方法,所述方法包括:
a)将包含样品的容器连接到本发明的第四方面的处理盒,其中所述处理盒包含至少一个反应仓室,所述反应仓室包含含有用于所述分析方法的试剂的干组合物;
b)将所述带有组装的样品容器的处理盒插入到处理装置中;并且
c)开始全自动测定。
处理盒的简单设计以及通过从容器进入盒的预处理过的样品——其优选地为澄清的裂解物或裂解混合物——来运行盒内的整个过程、包括干组合物的重构这一特点,导致提供了成本效益非常高且可靠的方法。为了制备用于分析方法的样品,除了将包含收集的样品的容器连接到盒以及将盒插入到处理装置中之外,不需手动工作步骤。所有物质和试剂(除了优选地收集在预处理组合物、优选为裂解溶液中的样品之外)被提供在封闭的单一用途的盒中。此外,所有过程在封闭的盒系统内进行。在用户与潜在地对健康有危害的物质之间没有直接接触(样品和试剂废物保留在封闭盒中)。处理盒小、结构简单且生产廉价。
对于本领域技术人员来说,从下面的描述和随附的权利要求书,本发明的其他目的、特点、优点和方面将变得明显。然而,应该理解,下面的描述、随附的权利要求书和具体实例,尽管指明了本申请的优选实施方式,但仅仅是出于示例的目的而提供。对于本领域技术人员来说,在阅读了下文之后,在所公开的发明的精神和范围之内的各种改变和修改将变得显而易见。
发明详述
在第一方面,提供了一种用于分析包含生物分子的样品的分析方法,其中所述方法包括样品的裂解和包含用于执行分析方法的试剂的干组合物的重构。
在第一子方面A中,所述方法包括下列步骤:
a)将样品裂解以提供裂解的样品,并任选地澄清所述裂解的样品;
b)将至少一部分裂解的样品与包含用于执行所述分析方法的试剂的干组合物相接触,由此提供重构的组合物;
c)使用所述重构的组合物执行分析方法。
本发明人令人吃惊地发现,通过使用裂解的样品代替通常用于重构目的的液体例如水或重组缓冲液,可以重构包含用于执行分析方法的试剂的干组合物。使用裂解的样品进行重构,提供了适用于执行目标分析方法的重构的组合物。因此,与现有技术的方法相反,有利的是,通过取消生物分子的事先纯化和/或干组合物的分开的重构过程,可以节省相当多的时间和过程步骤。正如由实例所示,当直接使用裂解的样品来重构包含执行方法所必需的试剂的干组合物时,可以有效地执行所述分析方法,例如扩增反应。裂解物可以直接用于重构这一点是非常令人吃惊的,因为重构通常基本上通过水和不含相当大量的可能干扰目标分析方法的污染物的其他液体来实现。非常令人吃惊的是,即使仅仅使用裂解的样品,重构也是成功的,并提供了适用于目标分析方法的重构的组合物。
当在本文中使用时,术语“裂解”是指样品的破坏、降解和/或消化。在相应的裂解步骤中,生物分子例如尤其是核酸可以从细胞释放,或者可以不含其他样品组分例如蛋白质。在本文中,我们将破坏、降解和/或消化样品的相应步骤通称为裂解步骤,而不管生物分子例如尤其是核酸是否从细胞释放,或者进行裂解是否是为了例如从样品中包含的蛋白质或其他物质释放生物分子例如核酸。在现有技术中,已知几种允许实现不同样品材料的有效裂解的方法。适合的裂解方法包括但不限于对样品的机械、化学、物理或酶作用。相应的裂解步骤的实例包括但不限于在玻珠研磨机中研磨样品、超声处理、表面声波(SAW)、重复的冻融循环、加热、加入去污剂和/或加入蛋白质降解性化合物例如蛋白质降解酶例如水解酶或蛋白酶或盐类。根据一种实施方式,在裂解期间使用蛋白质降解性化合物。根据优选实施方式,蛋白质降解性化合物是蛋白消化酶。蛋白消化酶(proteolytic enzyme)是指催化例如蛋白质、多肽、寡肽和肽中的肽键切开的酶。示例性的蛋白消化酶包括但不限蛋白质酶和蛋白酶,尤其是枯草杆菌蛋白酶类、枯草杆菌酶类、碱性丝氨酸蛋白酶等。枯草杆菌酶类是一类丝氨酸蛋白酶,即在活性侧链中具有丝氨酸残基的酶。枯草杆菌蛋白酶类是具有广泛底物特异性的细菌丝氨酸蛋白酶。示例性的枯草杆菌蛋白酶类包括但不限于蛋白酶K、蛋白酶R、蛋白酶T、枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶A、QIAGEN蛋白酶。枯草杆菌酶类、枯草杆菌蛋白酶类、蛋白酶K和其他蛋白酶的讨论,可以在尤其是Genov等,Int.J.PeptideProtein Res.45:391-400,1995中找到。优选地,蛋白消化酶是蛋白酶K。优选地,蛋白消化酶在加热和/或搅拌下使用。此外,一种或多种细胞壁消化酶类可用于裂解,例如溶菌酶、消解酶和/或果胶酶。适合的裂解方法还取决于目标分析方法。当通过加入裂解的样品来实现包含用于分析方法的试剂的干组合物的重构时,重要的是确保所执行的裂解不以将随后的分析方法的性能抑制到使所述分析方法不能充分进行的程度的浓度引入一种或多种所述随后分析方法的抑制剂。所述可耐受浓度取决于待执行的分析方法,例如所使用的酶和它们对抑制剂的敏感性以及所述分析方法的足够性能所需的灵敏度。这些参数也可以随着样品而变。在这里,必须考虑到,由于重构通过加入裂解的样品来实现这一事实,与仅向干燥试剂的已重构的组合物加入较少量裂解样品的等分试样的方法相比,通常在分析方法中引入了较大量的生物分子。这种较大量的生物分子也可能抵补了裂解的样品中包含的污染物对分析反应的潜在抑制。
根据第二子方面B,所述方法包括下列步骤:
a)将样品与裂解溶液相接触,由此提供裂解混合物;
b)使用所述裂解混合物来重构包含用于执行分析方法的试剂的干组合物,由此提供重构的组合物;
c)使用所述重构的组合物执行分析方法,
其中所述重构的组合物任选地被澄清,并且其中在步骤b)后进行支持所述样品裂解的至少一个步骤。
如上所述,本发明人发现,也可以在将样品完全裂解之前有效地重构干组合物。在这种变化形式中,将包含与裂解溶液混合的样品的裂解混合物用于重构干组合物,因此将所述干组合物提供为重构的混合物,所述混合物除了用于执行分析方法的试剂之外,还包含样品和裂解溶液。在裂解混合物中,样品的裂解至少是不完全的。在重构后,进行至少一个步骤、优选为加热步骤,以便(充分)裂解包含在重构的混合物中的样品。所述步骤可以在步骤c)之前,例如作为分开的中间步骤来进行。然而,裂解也可以在执行分析方法期间实现或完成。这在分析方法包含加热步骤的情况下,例如在进行PCR的情况下是特别可行的。由此,本发明方法的这种变化形式能够节省过程步骤。
由于本发明的第一方面的方法的两个子方面具有许多共同特点,因此两种方法的共同步骤在后面一起讨论。
根据一种实施方式,将样品与裂解组合物、优选为裂解溶液相接触,所述裂解组合物包含实现和/或促进生物样品裂解的化学物质和/或试剂。取决于裂解溶液的组成,裂解可以被直接启动。根据某些实施方式,通过其他机构例如通过执行加热步骤来促进并因此协助裂解。根据优选实施方式,通过将样品与适合的裂解缓冲液相接触并加热,来实现样品的裂解。正如在上文和实施例中所示,可以在实现样品裂解之后将裂解的样品与干组合物相接触,以进行重构。然而,也可以在向干组合物加入优选地作为混合物的样品和裂解溶液之后,实现并相应地完成裂解。例如,可以将重构的混合物加热,以便在重构的混合物中实现和/或完成样品的裂解。当执行包含加热步骤的分析方法例如PCR反应时,这种实施方式是特别适合的。
根据一种在目标生物分子是核酸时特别适合的实施方式,向样品加入裂解溶液,所述裂解溶液包含非离子型表面活性剂或非离子型去污剂的混合物作为组分(a)。非离子型去污剂优选地选自聚氧化乙烯脂肪醇醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物、聚山梨酸酯和烷基酚乙氧化物、优选为壬基酚乙氧化物、烷基糖苷和/或聚氧化乙烯烷基苯基醚。出于本发明的目的,术语“脂肪醇”尤其是指链长为6至22个碳原子,优选为8至20个碳原子,优选为10至18个碳原子,特别优选为12至18个碳原子的醇类。特别优选的是具有12、14、16或18个碳原子的醇类。尽管脂肪醇可以是单或多不饱和的,但它们优选地是饱和的脂肪醇。出于本发明的目的,术语“聚氧化乙烯”尤其是指HO-(CH2CH2O)n单元,其中n优选为2至150的整数,更优选为4至120,更优选为8至80,最优选为选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的整数。适合的聚氧化乙烯脂肪醇的优选实例是聚乙氧基化的月桂基、鲸蜡基、油基或硬脂基醇,它们可以单独地或作为混合物使用。根据本发明的优选实施方式,至少一种聚氧化乙烯脂肪醇醚包含具有6至22个碳原子的脂肪醇组分和具有2至150个(CH2CH2O)单元的聚氧化乙烯组分。优选地,聚氧化乙烯脂肪醇醚选自聚氧化乙烯月桂基醚、聚氧化乙烯鲸蜡基醚、聚氧化乙烯硬脂基醚和/或聚氧化乙烯油基醚。作为烷基糖苷类,优选地使用来自于聚山梨酸酯类的非离子型去污剂,优选为聚山梨酸酯20(Tween20)、聚山梨酸酯40或聚山梨酸酯80,更优选为聚山梨酸酯20。聚氧化乙烯烷基苯基醚的优选实例包括TritonX-100和Nonidet P-40。优选地,在裂解溶液中包含至少两种相应的非离子型去污剂。根据一种实施方式,裂解溶液中的组分(a)选自Tween、Triton X100、Nonidet P40(壬基苯基聚乙二醇)和Brij58。优选地,在裂解溶液中包含至少两种相应的非离子型去污剂作为组分(a)。在所使用的裂解溶液中,非离子型表面活性剂或非离子型去污剂混合物的浓度在0.05至5%之间,优选地在0.1%至2%之间,更优选地在0.2%至1.5%之间,最优选地在0.4%至1%之间。优选地,在裂解溶液中包含Triton X-100和/或Tween20作为组分(a)。
作为组分(b),裂解溶液包含至少一种防止或降低随后分析方法的抑制的聚合物。因此,将所述聚合物合并到裂解溶液,具有当所述聚合物合并到裂解溶液中时与所述聚合物未合并到裂解溶液中时相比,随后的分析方法例如扩增反应显示出提高的性能的效果。据推测,所述聚合物通过非特异性地络合潜在的抑制剂来防止或降低抑制。哪些化合物起到抑制剂的作用也取决于随后执行的分析方法。例如,通常源自于含核酸的样品的核酸扩增反应的典型抑制剂包括但不限于蛋白聚糖、蛋白质和糖类。聚合物优选地以0.05至0.5%、优选地0.085%至0.2%范围内的浓度包含在裂解溶液中。还可以使用聚合物的混合物。根据一种实施方式,聚合物起到粘合剂和/或增稠剂的作用,并优选地选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚噁唑啉、聚乙二醇、聚乙烯醇和Luvitec。优选地,将聚乙烯吡咯烷酮合并到裂解溶液中。可用于此目的的适合的粘合剂和/或增稠剂也描述在WO2010/003493中。正如在实施例中所示,这样的粘合剂和/或增稠剂例如PVP在防止扩增反应的抑制中非常有效。用于防止或降低在裂解的样品或澄清的裂解的样品中包含的污染物的抑制效应的其他化合物,也可以合并在裂解溶液中。
作为组分(c),裂解溶液可以包含至少一种酶,优选为蛋白消化酶。适合的蛋白消化酶如上所述。优选地使用嗜热蛋白酶,特别优选为选自蛋白酶K或枯草杆菌蛋白酶的嗜热蛋白酶。非常特别优选地在裂解溶液中使用嗜热蛋白酶K。蛋白酶的使用量优选地使它在每毫升裂解溶液中提供0.5至10μ单位,优选地1.5至4μ单位(国际单位)。然而,蛋白消化酶也可以分开添加。
根据一种实施方式,裂解溶液包含至少一种用于二价阳离子的螯合剂作为组分(d)。适合的螯合剂包括但不限于二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和N,N-双(羧甲基)甘氨酸(NTA)。根据优选实施方式,使用EDTA。当在本文中使用时,术语“EDTA”尤其是指EDTA化合物例如K2EDTA、K3EDTA或Na2EDTA的EDTA部分。使用螯合剂例如EDTA具有抑制核酸酶例如DNase和RNase的有利效果。螯合剂优选地以0.5mM至5mM、优选地0.75mM至2mM、最优选地1mM至1.5mM的浓度用于裂解溶液中。优选地,使用EDTA。
根据一种实施方式,裂解溶液包含至少一种缓冲物质作为组分(e)。缓冲物质应该能够在与执行随后的分析方法所需的pH范围相容的pH范围下缓冲裂解溶液。当裂解的样品的pH受到用于裂解的溶液的强烈影响,并且使用裂解的样品来重构包含用于分析方法的试剂的干组合物时,需要缓冲物质。优选地,在裂解溶液中使用缓冲剂以使溶液的pH在7.5至11、更优选地7.5至9之间。相应地缓冲的裂解溶液特别适用于重构包含适合于执行核酸扩增反应的试剂的干组合物。pH缓冲物质可以以5mM至100mM、优选地10mM至80mM、更优选地30-50mM的浓度包含在裂解溶液中。优选地,缓冲物质选自Tris、MOPS、HEPES或磷酸盐。
特别优选的裂解溶液包含
-作为组分(a),两种非离子型去污剂、优选为聚山梨酸酯20(Tween20)和壬基苯基聚乙二醇(Nonidet P40)的混合物,其中每种非离子型去污剂以0.2%至0.6%、优选地0.4%至0.5%的浓度被包含;
-组分(b),浓度为0.05%至0.15%、优选为0.1%的聚合物,其优选地是PVP;
-任选地,蛋白消化酶例如蛋白酶K作为组分(c);
-作为组分(d),浓度低于1.5mM的EDTA;
-作为组分(e),浓度为7.5mM至20mM、优选为10mM的缓冲物质,优选为TRIS。
相应的裂解溶液的pH值优选地大约在8.0至9.0之间,优选为pH8.5。
如上所述的裂解溶液,当与加热步骤组合时,对于裂解样品特别有效。为此目的,将包含样品和裂解溶液的裂解混合物加热至少3min、优选地至少5min到至少90℃、优选地至少95℃的温度。优选地,然后将加热的样品冷却至低于50℃的温度,更优选地至少将它冷却到室温。在这里,已发现相应的冷却步骤促进沉淀物的形成,所述沉淀物由相应地构成它们自身的污染物组成。沉淀物的有效形成以及沉淀物如下所述通过执行澄清步骤的移除/结合,提供了污染物被有效贫化的剩余的裂解样品。如果裂解溶液包含蛋白消化酶和/或与蛋白水解组合使用,优选地将裂解混合物在适合于蛋白消化酶工作的温度下,例如在低于70℃、优选地低于65℃、更优选地低于60℃的温度下温育,并优选地与搅拌相组合。在所述温育后,在更高温度下进行加热步骤。这样的加热步骤在本文中也被称为煮沸裂解。这种用于实现样品的有效裂解的过程步骤序列,具有将样品有效裂解并将蛋白消化酶变性的优点。所描述的裂解溶液特别适合于进行扩增反应例如PCR,因为它不包含浓度显著抑制相应的扩增反应的组分。
在将样品与裂解组合物进行接触之后,优选地将得到的混合物搅拌,以便确保充分混合。混合可以通过涡旋振荡、将气体例如空气导入到混合物中或通过磁力搅拌来辅助,正如将在下面进一步详细描述的。根据一种实施方式,裂解溶液包含至少一个磁性搅拌棒,其可用于在使用磁体移动所述搅拌棒时协助样品的混合。
为了提高随后的分析方法的性能,尤其是在进行扩增反应例如PCR反应时,优选地首先将裂解物澄清然后再将它与用于重构的干组合物相接触。因此,根据这种实施方式,干组合物的重构包括将干组合物与至少一部分澄清的裂解的样品(等分试样)相接触并混合。为了澄清裂解的样品,存在几种选择方案。其非限制性的实例将在下面描述。此外,相应的澄清步骤还有利地移除和/或失活包含在重构的组合物中的污染物。如上所述,在本发明的第一方面的方法的子方面B的方法中,在已用裂解混合物重构干组合物之后实现和/或完成样品的裂解。因此,源自于样品裂解并相应地在样品裂解期间释放的污染物例如蛋白聚糖、蛋白质和糖类,被释放到重构的组合物中,并且相应的污染物可能在其中形成污染物,尤其是在执行如上所述的热处理时。根据一种实施方式,在执行分析方法之前澄清相应的重构的组合物。为了澄清重构的组合物,存在几种选择方案。其非限制性实例将在下面描述。
根据一种实施方式,在裂解之前、期间或之后将样品与用于移除源自于裂解的样品的污染物的机构相接触。由此可以提供澄清的裂解的样品或澄清的重构的组合物。不是所有的污染物都需要被移除。相反,污染物的量只需被移除到使目标分析方法可以充分地进行并且尤其是提供必需的灵敏度和/或特异性的水平。根据一种实施方式,使用化学试剂来移除或失活随后分析方法的抑制剂。适合的化合物例如聚合物、尤其是PVP,已在上面描述。为了在裂解期间直接实现污染物的有效移除,优选地在裂解之前或期间加入这些试剂。它们优选地被合并到裂解溶液中。
污染的主要来源,尤其是在处理含细胞的样品时,是裂解期间沉淀物的形成。尤其是当样品在裂解期间被加热时,形成相应的沉淀物。沉淀物从裂解的样品夹带到分析方法例如扩增反应或检测反应中,可以严扰乱所述所述分析方法和/或得到的结果的解释。因此,有利的是复合相应的沉淀物,并优选地将复合物与剩余的裂解的样品分离开,以例如提供澄清的裂解的样品。分离可以例如通过沉降或离心来协助。沉淀物可能例如沉降在管的底部,留下上清液,其对应于澄清的裂解物或澄清的重构的组合物,如果为此目的执行所述步骤的话。沉降可以例如通过离心来加速和改进。然而,协助沉淀物的分离是优选的。由于从剩余的样品中移除污染物,因此沉淀物的复合已经具有澄清效果。然而,优选地将至少一部分污染物与剩余的样品分离开。
根据一种实施方式,在裂解之前、期间或之后提供用于移除沉淀物的机构,由此提供澄清的裂解物或澄清的重构的组合物。当在这种情形中使用时,术语移除是指将沉淀物的量减少到使随后的分析方法可以充分进行的程度。根据一种实施方式,在用于支持或甚至实现样品裂解的步骤已进行的情况下,将至少一部分裂解物和/或至少一部分重构的组合物通过在裂解的样品通过或重构的组合物通过期间能够留住或移除沉淀物的机构。适合的机构可以选自过滤材料、膜或层,或结合沉淀物的粒子的填充物。裂解的样品或重构的组合物通过所述机构,沉淀物被所述机构捕获并相应地留下,由此在样品通过滤器后提供澄清的样品。所述机构例如滤器或膜可以是多孔的。所述孔应该足够小,以有效地留住并因此移除裂解的样品或重构的组合物中存在的沉淀物。
根据优选实施方式,将样品在裂解之前、期间或之后与结合沉淀物的至少一种固相支持物相接触,由此与沉淀物形成复合物。当然,当例如使用粒子例如珠子作为固相支持物时,也可以形成超过一种复合物。因此,当在本文中使用时,术语“复合物”也指多种复合物。与固相支持物的结合优选地是非特异性的,并通过吸附来实现。优选地将复合物与剩余的裂解物和相应的剩余的重构的组合物分离开,由此提供澄清的裂解物。复合物的分离可以通过沉降、离心或者如果使用磁性固相支持物的话通过磁性分离来协助。例如,可以将复合物集中在容器的底部,并且可以获得对应于澄清的裂解的样品的上清液。将沉淀物结合于固相支持物帮助复合物的沉降,从而改善沉淀物从剩余样品的移除。然而,正如在实施例中所示,如果复合物未被移除而是因此在分析方法期间存在,则固相支持物的添加也是有益的,并且提供了澄清效果,这是因为所包含的污染物例如沉淀物的抑制效应被降低。显然,通过将沉淀物结合于固相支持物来复合沉淀物已经提供了有益效果,这是因为结合的沉淀物不可接近并因此失活。
根据一种实施方式,固相支持物选自粒子、板和其他颗粒物质。根据一种实施方式,固相支持物包含与裂解物或重构的组合物中存在的污染物、特别是沉淀物结合的表面。术语“结合”在广义上使用,并且是指污染物、尤其是沉淀物与固相支持物的允许将至少一部分所述污染物与固相支持物一起移除的任何相互作用。结合优选地通过吸附来实现。
根据一种实施方式,使用包含金属氧化物或由金属氧化物构成的无机粒子作为用于澄清裂解的样品或用于澄清重构的组合物的固相支持物。适合的固相支持物的实例包括但不限于具有二氧化硅表面的固相支持物例如二氧化硅粒子或玻璃粒子和聚合支持物。根据一种实施方式,固相支持物具有水合硅氧化物吸附性表面。然而,固相支持物也可以包含一种或多种配体,以提供用于结合沉淀物或改善沉淀物结合的适合的表面。根据一种实施方式,配体选自离子交换基团,其优选地选自阳离子交换基团例如羧基、磺酸基和硅烷配体。也可以使用相应配体的组合。固相支持物可以另外地或可替选地在其表面上包含结合下游分析方法的抑制剂,例如扩增反应的抑制剂的配体或化合物。适合的实例在上文描述。优选地,固相支持物具有包含羧基的表面。
提供适用于从裂解的样品移除沉淀物的表面的示例性固相支持物,包括例如由玻璃、二氧化硅、聚合物或涂层材料制成的小球,也称为珠子或粒子。在特别优选的实施方式中,固相支持物例如粒子是磁性的。然而,修改例如用于接收样品的消耗品例如容器的内表面,也在本发明的范围之内。如果容器的与样品相接触的至少一部分内壁包含相应的配体,则沉淀物可以结合、优选地吸附于所述表面,并由此固定到样品壁。这允许将澄清的裂解的样品作为例如上清液回收,在所述上清液中沉淀物的量减少。
污染物例如尤其是沉淀物与被提供用来结合所述污染物的固相支持物和相应的表面的结合,在其中污染物结合于固相支持物,但目标生物分子不结合或与污染物(原文为目标生物分子)相比以更低程度结合的条件下进行。因此,所使用的裂解条件是选择性的,其中大部分污染物例如尤其是沉淀物结合、优选地吸附于固相支持物和相应的表面,但是目标生物分子不存在显著结合,使得它们以足够的量保留在裂解的样品或重构的组合物中,允许执行目标分析方法。
优选地,用于结合沉淀物的固相支持物包含在裂解溶液中。由此,确保了在样品裂解后形成的任何沉淀物在其形成之后直接结合于固相支持物,从而形成复合物。由此从剩余的样品中贫化沉淀物。在用于移除污染物例如沉淀物的固相支持物存在下进行裂解,提高了获得的澄清结果。这是可能的,因为沉淀物在它们形成的同时可以被直接结合。这适用于不论裂解在干组合物重构之前还是之后实现的情况。
根据一种实施方式,固相支持物包含分子筛或者是分子筛。分子筛是含有尺寸精确且均匀的小孔的材料,可用作吸附剂。优选地,分子筛包含铝硅酸盐矿物、粘土、多孔玻璃、微孔炭、沸石、活性炭或合成化合物,它们具有开口结构,小分子例如水可以通过所述开口结构扩散。正如由实施例所示,分子筛例如沸石在从裂解的样品移除污染物例如沉淀物中特别有效。可以向裂解组合物加入分子筛,所述裂解组合物优选地是裂解溶液。它们还可以与上述固相支持物一同使用。
当处理酸性样品例如阴道拭子样品时,使用分子筛例如沸石作为固相支持物具有特别优点,即沸石能够升高裂解的样品和/或裂解混合物的pH值。这是有益的,因为许多分析方法例如扩增反应在酸性pH值下不能正常工作。在包含执行扩增反应所必需的试剂的干组合物中通常包含的缓冲物质,由于为重构而添加的酸性裂解样品和相应的酸性裂解混合物的量,通常不能将重构的组合物的pH值维持在理想的和相应地需要的pH范围之内。当在裂解混合物制备期间,尤其是在澄清的裂解物制备期间掺入沸石时,可以克服这一问题。例如,沸石的加入允许将pH值从酸性pH值提高到7至9.5、优选地7.5至9之间的pH值,从而额外地提高要求pH值在相应范围内的分析方法例如扩增反应、尤其是PCR的性能。因此,根据一种实施方式,在裂解之前、期间或之后加入至少一种类型的具有提高裂解的样品的pH值的效果的固相支持物。当处理具有低于7、低于6.5、低于6、低于5.5、低于5或低于4.5的pH的酸性样品时,这种实施方式是特别适合的。优选地,分子筛、更优选为沸石被用于此目的。分子筛还可以与结合沉淀物的其他固相支持物例如羧基化粒子一同添加。
正如上面讨论的,固相支持物优选地是磁性的。优选地,将固相支持物合并到裂解组合物、优选为裂解溶液中。当使用磁性粒子作为固相支持物并与磁性搅拌棒联合时,可以非常有效地实现裂解期间的搅拌。所述方法可能对应于通过参考并入本文的DE102007045474中所描述的方法。根据一种实施方式,裂解溶液包含大量作为固相支持物的磁性粒子以及至少一个被用作搅拌棒的磁性和/或可磁化中心元件,所述元件优选地被构造成杆、哑铃和/或椭圆形状。磁性和/或可磁化中心元件比所述大量磁性粒子更大。磁性粒子分配在与样品混合的裂解溶液中。它们随后聚集在至少一个中心元件上。通过使用被构造成与磁性材料相互作用的至少一个外部磁体例如永磁体或电磁体,来协助使用磁性材料的搅拌和/或混合。作为磁性粒子,优选地使用如上所述的磁性固相支持物,因为相应的磁性粒子额外地提供有益的澄清效果。
根据一种实施方式,澄清步骤另外地或可替选地包括使用至少一种化合物或组合物,所述化合物或组合物结合和/或中和随后分析方法的一种或多种抑制剂,尤其是扩增反应的抑制剂。优选地,所述化合物或组合物被包含在向样品添加用于裂解的裂解溶液中。
在优选实施方式中,样品的裂解和重构通过下列步骤来实现:
(i)将样品与如上所述的裂解溶液和用于移除沉淀物的固相支持物相接触,由此形成裂解混合物;优选地,将混合物搅拌、优选地涡旋振荡,以提供均质混合物;
(ii)将所述混合物加热到至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、优选地至少90℃、更优选地至少95℃的温度;该加热步骤促进或完成样品的裂解;
(iii)任选地将裂解的样品冷却至低于50℃的温度,优选地冷却至室温;
(iv)通过分离包含固相支持物和形成的沉淀物的复合物来澄清所述裂解的样品;以及
(v)使用所述澄清的裂解物来重构干组合物。
沉淀物尤其是由于加热过程并且相应地在加热过程期间形成。将固相支持物直接合并到裂解混合物中,例如通过将其加入裂解溶液,具有沉淀物在形成和/或释放后可以直接结合、例如吸附于固相支持物的优点。任选的冷却步骤(iii)促进沉淀物的形成并因此改进裂解物的澄清。为了确保通过将沉淀物结合于固相支持物而降它们有效地移除,优选地对裂解混合物进行搅拌,例如通过磁力搅拌。这增加了污染物例如沉淀物与固相支持物发生接触,并因此与其形成可以被容易地分离的复合物的机会。为了协助搅拌,可以将磁性搅拌棒合并到裂解混合物中。相应的磁性搅拌棒优选地已被合并到裂解溶液中。这种实施方式简单且消费者友好,因为样品收集容器可以预先装备有裂解组合物例如上面描述的裂解组合物和磁性搅拌棒。
在其他实施方式中,样品的裂解和重构通过下列步骤来实现:
(i)将样品与裂解溶液和用于移除污染物、优选为沉淀物的固相支持物相接触,由此形成裂解混合物;
(ii)使用所述裂解混合物来重构干组合物;
(iii)将所述重构的组合物加热到至少90℃、优选地至少95℃的温度,以便实现或完成样品的裂解;
(iv)任选地将所述包含裂解的样品的重构的组合物冷却至低于50℃的温度;正如上面讨论的,这个任选的冷却步骤协助沉淀物形成并因此协助澄清,以及
(v)通过分离形成的包含固相支持物和沉淀物的复合物来澄清所述重构的组合物,由此提供澄清的重构的组合物。
在这里,裂解在干组合物已被重构之后实现并相应地完成。这可以节省时间,尤其是当打算进行热启动PCR反应时。在(iii)中进行的加热步骤已经激活热启动聚合酶,由此废除了在实际PCR期间用于激活的其他加热步骤。
在其他实施方式中,样品的裂解和重构通过下列步骤来实现:
(i)将样品与裂解溶液和用于移除污染物、优选为沉淀物的固相支持物相接触,由此形成裂解混合物;
(ii)使用所述裂解混合物来重构干组合物;
(iii)对所述重构的组合物进行扩增反应,所述扩增反应包括涉及至少90℃、优选地至少95℃的温度下优选至少3min、更优选地至少5min的至少一个加热步骤。
取决于被处理的样品,这种方法非常快速并且也产生可接受的结果。在这里,裂解混合物也被用于干组合物的重构。然而,样品的裂解在扩增反应期间实现或完成,例如在样品的初始加热,例如为了激活酶而进行的例如用于执行热启动的加热步骤期间实现或完成。根据这种实施方式,包含固相支持物和污染物例如尤其是沉淀物的复合物可以残留在重构的组合物中并且不被分离。正如由实施例所示,这种实施方式也对某些样品起作用,并具有废除进一步的处理步骤的优点。因此,即使不从重构的组合物移除复合物,相应的固相支持物的存在也已提供显著的改进。然而,根据一种实施方式,一旦沉淀物被结合后,将固相支持物与剩余的样品——在这里是重构的组合物——分离。
干组合物包含执行目标分析方法所必需的一种或多种试剂。优选地,干组合物包含至少一种蛋白质,优选为酶。在干组合物中包含哪些试剂取决于待分析例如检测的生物分子和目标分析方法。适合的实例在下文中描述。
根据一种实施方式,干组合物是冷冻干燥的组合物。冷冻干燥的组合物被广泛用于以可储存的形式提供分析方法所必需的试剂。相应的冷冻干燥的组合物尤其被用于生物技术领域,以便以被制备并因此易于使用的形式提供目标分析方法所必需的试剂。相应的冷冻干燥的组合物通常包含至少一种生物产品,例如选自核酸例如寡核苷酸、蛋白质、抗体、酶等的生物产品。用于制备相应的冷冻干燥的组合物的方法以及使所包含的反应组合物、尤其是生物化学组分例如蛋白质稳定的适合的添加剂,在现有技术中是公知的(参见例如《药物和生物制品的冷冻干燥/冻干》(Freeze-Drying/Lyophilization ofPharmaceutical and Biological Products)第二版、WO01/92569、WO2010/001162、US2010/0068716和US2010/0159529),因此不需在这里详细描述。在本发明的方法中使用的干组合物是可储存的组合物。它优选地适合于长期储存。根据一种实施方式,干组合物在至少3个月、至少6个月、至少10个月或至少12个月的时间段的储存期间是稳定的。优选地,干组合物在3至18个月或6至12个月的时间段内是稳定的。根据一种实施方式,干组合物包含进行目标分析方法所必需的至少一些化学和/或生物化学试剂。优选地,它包含所有必需试剂,因为在添加裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品之后,组合物可随时用于执行分析方法。这在例如在下面描述的LoC系统中使用所述方法时是特别有利的。根据优选实施方式,干组合物包含进行扩增反应、优选为PCR反应所必需的至少一些、优选地所有试剂。正如上面讨论的,相应的干组合物、尤其是冷冻干燥的组合物,被广泛用于以所谓的主混合物的形式将扩增反应所必需的试剂提供成可储存形式。在打算进行扩增反应时,只需使用裂解的样品将干组合物重构以形成扩增反应混合物,然而,其中任选地可以加入其他试剂,例如如果不是所有试剂都已经包含在干组合物中的话,但优选情况下,所有试剂都已经包含在干组合物中。当打算进行扩增反应例如PCR反应时,干组合物包含一种或多种、优选地所有试剂,所述试剂选自聚合酶、适合于进行扩增反应的反应缓冲液和dNTP。优选地,它还包含允许例如检测一种或多种靶核酸的存在或不存在的引物和/或标记的探针,所述靶核酸是例如某些疾病或感染的指示。还可以包含其他添加剂例如酶和盐类。此外,干组合物可以包含磁性材料,其通过能够在重构期间在磁体的协助下将组合物混合来辅助重构过程。在使用裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品重构并任选地加入其他添加剂后,得到的重构的组合物可随时用于进行目标分析方法,例如在提供适用于扩增、例如PCR反应的干组合物的情况下执行靶核酸的扩增。根据一种实施方式,干组合物包含适用于分析方法的试剂,其中所述分析方法可以是可用于分析包含目标生物分子的样品的任何化学和/或生物技术方法。示例性的分析方法在下文中描述。
根据一种实施方式,用于重构的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%的液体由裂解的样品或裂解混合物提供,所述裂解的样品优选地是澄清的裂解的样品。有利的是,重构可以完全通过添加裂解的样品或裂解混合物来实现,所述裂解的样品优选地是澄清的裂解的样品。根据一种实施方式,至少将如上所述获得的澄清的裂解物的等分试样与干组合物相接触,用于重构所述干组合物。为了确保重构的组合物包含的试剂具有适合于目标分析方法的浓度,向干组合物加入预定量的裂解的样品或裂解混合物。所述预定量被选择成使得在重构的组合物中,试剂以适合于执行目标分析方法例如扩增反应的浓度包含在其中。可以通过搅动例如通过上下吸打得到的混合物、搅拌、振摇或涡旋振荡来协助重构过程。根据一种实施方式,使用磁体来实现混合。因此,根据一种实施方式,将磁性材料包含在干组合物中。所述磁性材料允许在重构期间和/或之后在磁体的协助下搅拌和/或混合组合物。优选地,在将组合物干燥、优选地冷冻干燥以提供干组合物之前将磁性材料合并到组合物中。由此,磁性材料被合并到干组合物中,并可用于协助重构过程。根据优选实施方式,磁性材料是一片或多片磁性箔片。可以使用的其他方法是例如在DE102007045474中描述的方法,在此通过参考并入本文。根据一种实施方式,干组合物包含大量磁性粒子以及至少一个磁性和/或可磁化中心元件,所述元件优选地被构造成杆、哑铃和/或椭圆形状。磁性和/或可磁化中心元件比所述大量磁性粒子更大。优选地,在将组合物干燥、优选地冷冻干燥之前将这些元件合并在组合物中。发生接触以使用液体重构的组合物包含大量第一磁性粒子以及至少一个中心元件,所述元件优选地被构造成杆、哑铃和/或椭圆形状。磁性粒子被分配在液体中,并随后聚集在至少一个中心元件上。通过使用被构造成与磁性材料相互作用的至少一个外部磁体例如永磁体或电磁体,来协助使用磁性材料的搅拌和/或混合。在反应仓室中进行的反应的进行期间,重构的组合物的搅拌也可能是有利的。例如,如果进行包含加热步骤、例如PCR扩增中的加热步骤的反应,优选地以一定间隔进行的搅拌,具有使热量更快速且更均匀地分布的支持效果。磁性材料可以包含选自顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料及其混合物的材料,或由所述材料构成。
根据一种实施方式,干组合物包含如上所述用于澄清样品的固相支持物。优选地,将羧基化粒子包含在干组合物中。根据一种实施方式,将相应的干组合物与如上所述的包含样品和裂解溶液的裂解混合物相接触。这种实施方式具有干组合物提供固相支持物的优点,所述固相支持物通过结合污染物例如沉淀物并由此形成包含固相支持物和污染物的复合物而适用于澄清重构的组合物。如上所述,在进行分析方法例如扩增反应之前,任选地但优选地移除所述复合物。
当在本文中使用时,术语“生物分子”尤其是指核酸和多肽,并优选地是指核酸。其他生物分子包括代谢物。
当在本文中使用时,术语“核酸”是指包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸的聚合物,所述核苷酸通常通过亚基之间的磷酸二酯键、但在某些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等共价键合。核酸包括偶但不限于所有类型的DNA和/或RNA,例如gDNA;环状DNA;质粒DNA;循环DNA;PNA;LNA,环己烯核酸;RNA/DNA杂合体;hnRNA;mRNA;非编码RNA(ncRNA),包括但不限于rRNA、tRNA、miRNA(micro RNA)、siRNA(小干扰RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、snRNA(小核RNA)、pwi相互作用RNA(piRNA)、重复序列结合性RNA(rasiRNA)、asRNA和stRNA(时序调节小RNA);片段化核酸;从亚细胞细胞器例如线粒体或叶绿体获得的核酸;以及从生物样品中可能存在的病原体、微生物、寄生虫或DNA或RNA病毒获得的核酸,例如细菌、病毒或真菌核酸;合成的核酸,细胞外核酸。当在本文中使用时,术语“细胞外核酸”尤其是指不包含在细胞中的核酸。相应的细胞外核酸通常也被称为无细胞核酸。这些术语在本文中作为同义词使用。术语“细胞外核酸”是指例如细胞外RNA以及细胞外DNA。在生物样品例如体液如血浆的无细胞级分(相应的部分)中存在的典型的细胞外核酸的实例,包括但不限于哺乳动物的细胞外核酸例如细胞外肿瘤相关或肿瘤衍生DNA和/或RNA、其他细胞外疾病相关DNA和/或RNA、表观遗传学修饰的DNA、胎儿DNA和/或RNA、小干扰RNA例如miRNA和siRNA,以及非哺乳动物的细胞外核酸例如从例如原核生物(例如细菌)、病毒或真菌释放到细胞外核酸群体中的病毒核酸、病原体核酸。
当在本文中使用时,术语“多肽”是指包含通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物的分子。多肽包括任何长度的多肽,包括蛋白质(例如具有超过50个氨基酸)和肽(例如2-49个氨基酸)。多肽包括具有任何活性或生物活性的蛋白质和/或肽类,包括例如生物活性多肽如酶蛋白或肽、受体蛋白或肽、转运蛋白或肽、杀细菌和/或内毒素结合蛋白、结构蛋白或肽、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生长因子、疫苗等。所述多肽可以选自肽激素、白介素、组织纤溶酶原激活剂、细胞因子、免疫球蛋白、尤其是抗体或抗体片段或其变体。还包括修饰的多肽例如糖基化的多肽。
分析方法可以是能够用于分析包含目标生物分子的样品,尤其是可用于分析样品中包含的一种或多种目标生物分子,以便例如扩增、鉴定、检测和/或定量目标生物分子的任何化学和/或生物技术方法。优选地,分析方法包括允许检测裂解的样品中包含的至少一种生物分子的存在、不存在和/或量的检测反应。优选地,所述方法包括至少一种靶核酸的扩增和随后使用例如标记的探针对产生的扩增子的检测。相应的分析方法在现有技术中是公知的,并且也共同适用于医学、诊断和/或预后领域,以便分析样品中包含的生物分子例如核酸或特定核酸。因此,分析方法可以包括对裂解的样品中包含的生物分子进行分析,以鉴定疾病状态的存在、不存在和/或严重性,所述疾病状态包括但不限于大量肿瘤疾病,尤其是初恶性肿瘤和恶性肿瘤,例如不同形式的癌症。例如,在许多应用领域中,可以分析裂解的样品以便检测诊断和/或预后标志物(例如胎儿或肿瘤来源的核酸),所述应用包括但不限于非侵入性产前遗传检测以及相应的筛查、疾病筛查、肿瘤学、癌症筛查、早期癌症筛查、癌症治疗监测、遗传测试(基因分型)、传染病测试、病原体测试、损伤诊断、外伤诊断、移植医学或许多其他疾病,因此在诊断和/或预后方面是重要的。
当目标生物分子是核酸时,可以使用任何核酸分析方法来进行分析,所述方法包括但不限于鉴定技术、扩增技术、聚合酶链反应(PCR)、等温扩增、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(qPCR)、荧光检测、杂交测定法、DNA或RNA测序、限制性分析、反转录、NASBA、LAMP(环介导的等温扩增)、RPA(重组酶聚合酶扩增)、tHDA(螺旋依赖性扩增)、NEAR(切口酶扩增反应)、TMA(转录介导的扩增)和NASBA(基于核酸序列的扩增)、等位基因特异性聚合酶链反应、聚合酶循环组装(PCA)、不对称聚合酶链反应、指数后线性聚合酶链反应(LATE-PCR)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热启动聚合酶链反应、序列间特异性聚合酶链反应(ISSR)、反向聚合酶链反应、连接介导的聚合酶链反应、甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、多重聚合酶链反应、巢式聚合酶链反应、固相聚合酶链反应、使用标记的、优选为荧光标记的引物和/或探针的检测技术,或上述技术的任何组合。相应技术对本领域技术人员来说是公知的,因此不需要在这里进行进一步描述。优选地,分析方法是核酸扩增方法。
其他分析方法包括例如使用结合目标生物分子的标记的抗体或其他适合的标记的结合分子检测多肽的存在、不存在和/或量。相应的试剂也可以以干组合物例如冷冻干燥的组合物的形式提供。
术语“样品”在本文中广义使用,并打算包括含有生物分子、尤其是核酸和蛋白质的来源。示例性的样品包括但不限于生物样品例如通称的体液、全血、血清、血浆、红细胞、白细胞、血沉棕黄层;拭子,包括但不限于口腔拭子、咽拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、咽拭子、直肠拭子、病损拭子、脓拭子、鼻咽拭子、肛门拭子;尿液、痰液、唾液、精液、淋巴液、体液、羊水、脑脊液、腹膜流出物、粪便、胸腔积液、来自于囊肿的流体、滑液、玻璃体液;水状液、粘液囊液、洗眼液、眼吸出物、肺灌洗液、肺吸出物;组织,包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心、肌肉、胰腺和细胞培养物、细菌、微生物、病毒、植物、真菌,包括源自于上述组织或包含上述组织的样品。从临床或法医情形获得的材料或环境样品例如含有或怀疑含有核酸的土壤,也在术语样品所打算的意义之内。此外,本领域技术人员将会认识到,从任何上述示例性样品获得的提取物或材料或其部分,也在术语样品的范围之内。优选地,样品源自于人类、动物、植物、细菌或真菌。优选地,样品选自细胞、组织、细菌、病毒和体液例如血液、血液制品例如血沉棕黄层、血浆和血清、尿液、体液、痰液、粪便、CSF和精液、上皮拭子、阴道拭子、宫颈样品、活检样品、骨髓样品和组织样品,优选为器官组织样品例如肺和肝。可以将样品稳定化。某些样品例如血液样品通常在收集后例如通过将它们与稳定剂相接触进行稳定化,所述稳定剂在血液和源自于血液的样品的情况下是例如抗凝剂。
本发明的方法不需要在将裂解的样品与干组合物接触之前,通过例如将目标生物分子结合于固相和/或通过将它们沉淀以便纯化它们而从裂解的样品分离目标生物分子的步骤。相反,通过如上所述澄清裂解的样品和/或用裂解混合物重构并进行处理以诱导或完成所包含的样品的裂解的重构的组合物,来移除并相应地失活可能干扰目标分析方法的污染物例如沉淀物。这种澄清步骤确保即使直接使用大量裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品或裂解混合物来重构包含用于执行分析方法的试剂的干组合物,分析方法也可以有效地进行。因此,例如,可以在裂解(和任选的澄清)并用裂解的样品重构干组合物之后立即连续地执行分析方法,而不需在裂解与重构之间进行生物分子的纯化,并且不需在加入裂解的样品之前重构干组合物,因为裂解的样品被直接用于重构。当首先用裂解混合物重构干组合物,然后例如通过进行加热步骤在重构的组合物中实现或完成裂解时,类似的考虑也适用。因此,所述方法特别适合在处理盒例如LoC系统中用于重构包含在处理盒的反应仓室中的干组合物。
当在本文中使用时,术语“溶液”例如裂解溶液,尤其是指液体组合物,优选为水性组合物。它可以是仅仅单一相的均质混合物,但是按照本发明使用的溶液包含固体组分例如沉淀物的情况,也在本发明的范围之内。
根据第二方面,本发明涉及使用裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品或与裂解溶液混合的样品来重构包含用于执行分析方法的试剂的干组合物,所述重构包括向干组合物加入裂解的样品或与裂解溶液混合的样品并混合。
关于重构、包含在干组合物中的试剂、分析方法、裂解的样品的制备、重构的样品的制备和澄清步骤的详细情况,已在上面结合本发明的第一方面进行过描述。为了避免重复,可以称为相应的公开内容也适用于本发明的第二方面。正如上面讨论的,本发明人发现,通过至少向干组合物加入裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品或裂解混合物的等分试样并混合,可以重构包含用于执行分析方法例如扩增方法的试剂的干组合物。如上所述,不需加入其他溶液例如重构溶液。此外,生物分子例如核酸在重构之前不用纯化。相反,重构专门通过加入裂解的样品、澄清的裂解的样品或裂解混合物来实现。由此,提供了适用于执行分析方法的重构的组合物。由于省略了用于重构的单独液体的添加,重构过程被相当大地简化。这使所述方法对于在LoC系统中使用来说特别有用,因为这种方法允许使用简单得多的盒设计,正如在下面描述的。根据一种实施方式,所述用途包括使用重构的组合物来执行分析方法。关于可以执行的分析方法和优选实施方式的详细情况,已在上面结合本发明的第一方面进行过描述。为了避免重复,可以称为相应的公开内容也适用于本发明的第二方面。
根据独立的第三方面,本发明涉及用于澄清样品以除去沉淀物的方法,其中在裂解之前、期间或之后将样品与结合源自于裂解的样品的沉淀物的至少一个固相支持物相接触,由此与沉淀物形成复合物,并且其中任选地但优选地将所述复合物与剩余样品分离开。这种方法特别适合于澄清如上所述的裂解的样品。
本发明人开发了特别适合于提供澄清的裂解的样品的方法,所述澄清的裂解的样品由于澄清过程而包含更少量的沉淀物。沉淀物的有效移除提高了随后的分析方法的性能,尤其是打算进行扩增反应时,因为相应的方法可以被从裂解的样品夹带到分析反应中的沉淀物抑制。因此,相应的澄清的裂解物可以直接用于分析方法例如扩增反应中。此外,由于抑制性污染物例如尤其是沉淀物的量减少,所开发的裂解物澄清方法特别适合于提供适用于重构包含用于执行分析方法的试剂的干组合物的澄清的裂解物。此外,正如上面讨论的,相应的方法也适合于提供澄清的重构的组合物,其中加入裂解混合物来重构。在相应的裂解混合物中,裂解尚未完成。如上所述,可以通过将重构的组合物加热到至少90℃、优选地至少95℃的温度来实现和/或完成裂解。详细情况已在上文中描述。关于澄清方法、用于结合沉淀物的适合和优选的固相支持物和表面、复合物的详细情况,以及关于用于提供裂解的样品的裂解程序和适合和优选的裂解溶液的详细情况,已在上面结合本发明的第一方面进行过描述。为了避免重复,可以称为相应的公开内容也适用于本发明的第三方面。
根据独立的第四方面,提供了用于提高酸性样品的pH值的方法,所述方法包括向样品加入分子筛以提高酸性样品的pH值。优选地,所述方法具有一个或多个下列特点:
a)酸性样品的pH值≤6.5、≤6.0、≤5.5、≤5、≤4.5或在选自3至6.5和3.5至6的范围内;
b)分子筛的添加导致pH升高到选自7.5至9、8至9和8至8.5的pH范围;
c)所加入的分子筛是沸石;
d)在样品裂解之前、期间或之后加入分子筛;
e)将已与分子筛接触过的裂解的样品随后用于扩增反应中;和/或
f)在与分子筛接触之后不进行核酸纯化或分离。
方法的详细情况将在下面进行描述。在适合时,我们将参考上面的公开内容。
分子筛的实例在上文中进行过描述。为了提高pH值,必须使用引起pH值升高的分子筛。优选地,所述分子筛能够使酸性样品的pH值升高至少1个pH单位,更优选地至少2个pH单位。酸性样品可以具有≤6.5、≤6.0、≤5.5、≤5、≤4.5的pH值。优选地,它具有在3至6.5、优选地3.5至6之间的范围内的pH值。典型的酸性样品是阴道样品,例如阴道或宫颈拭子。根据一种实施方式,分子筛的加入导致pH升高到在7.5至9、优选地8至9、更优选地8至8.5之间的pH范围内。正如由实施例所示,提高pH的分子筛的加入具有令人吃惊的效果,即尽管样品的初始pH值可变,但可以将酸性样品的pH值设定到预定的pH范围。根据本发明的这一方面使用的提高pH的分子筛,与加入化学缓冲剂相比性能甚至更好。优选地,使用沸石作为分子筛。正如由实施例所示,沸石在提高酸性样品的pH值方面非常有效。优选地,它们的添加量为2-50mg/ml、优选为5至30mg/ml或5至20mg/ml与裂解组合物例如裂解溶液混合的样品。优选地,在样品裂解之前、期间或之后加入提高pH的分子筛。优选地,它在裂解期间出现。因此,对于在随后的扩增反应中使用所提供的裂解物来说,特别有利的是可以优选酸性样品。由此,可以免除在进行扩增反应之前对裂解物的pH值进行分别设定,相应地维持受到pH值影响的下游方法例如扩增反应如PCR的性能。此外,在裂解之前、期间或之后加入分子筛,具有可以有效地移除污染物例如尤其是沉淀物的效果。优选为沸石的分子筛不是用于分离核酸,而是用于制备用于随后的分析方法、尤其是用于扩增方法例如PCR的样品。因此,优选地将分子筛与酸性样品在不发生核酸与分子筛的显著结合的条件下进行接触。因此,优选地,在所使用的条件下,至少80%的所包含的核酸、至少90%、至少95%或至少98%的靶核酸不结合于分子筛。靶核酸可以是DNA或RNA,或者可以是指两者。正如上面讨论的,优选地在裂解期间加入分子筛。
根据第五方面,提供了适用于本发明的第一方面的分析包含生物分子的样品的分析方法的处理盒。所述处理盒包含盒体和至少一个反应仓室,所述仓室包括含有用于执行分析方法的试剂的干组合物,其中盒体包含样品摄入口、至少一个样品出口和连接样品摄入口与样品出口的流体通路,其中样品出口通入反应仓室,其中盒被设计成通过经样品摄入口进入盒的样品来实现反应仓室中包含的干组合物的重构。
当在本文中使用时,术语“流体”被用作通用术语,其涵盖气体和液体。
样品流体通路可以包含至少一个通道和/或空腔,并且优选地至少部分形成在盒体的表面内。流体通路确保了在样品经样品摄入口进入后样品的预定流动路径,由此确保它到达至少一个反应仓室。反应仓室可以整合在盒体内或者可以被提供为分开的元件,所述元件可以组装到盒体。优选地,一个或多个反应仓室被提供成组装到盒体的分开的元件。在这种反应仓室由分开的器件提供的实施方式中,盒体包含用于将至少一个反应仓室连接到盒体的机构,优选为连接突起物。在连接后,在样品出口与反应仓室之间建立起流体连通,使得样品可以进入反应仓室。盒体也可以包含多个反应仓室。在处理盒中提供超过一个反应仓室,具有可以使用同一样品进行超过一个反应和因此超过一项分析的优点。这允许例如使用同一盒平行地检测不同靶(例如疾病标志物或病原体)的存在或不存在。因此,这样的设计特别适合于执行多路测定。然而,正如在现有技术中公知的,也可以在一个反应仓室中、例如在一个扩增反应中,使用不同的引物和/或探针进行几个测定。
如果使用被提供为分开的器件的多个反应仓室,则盒体包含多个用于将反应仓室连接到盒体的机构,优选为连接突起物。几个反应仓室可以被提供为一个器件,所述器件可以流体密封地组装到盒体。这允许在相应的仓室中进行不同反应,以例如平行地检测不同病原体或疾病标志物。不同反应仓室可以提供有包含不同试剂,例如在进行扩增反应的情况下包含不同引物和/或探针的干组合物。将几个反应仓室合并在一个器件中便于操作以及因此处理盒的组装,这节约成本。
此外,盒体包含用于将样品容器连接到盒体的机构,优选为连接突起物。用于将反应仓室和样品容器连接到盒的适合的连接在现有技术中是公知的,因此不需要任何详细描述。连接可以根据形状锁合、力锁合和/或摩擦锁合的原理来建立。优选的实施方式示出在实施例中。
当处理盒在使用中时,样品必须通过样品摄入口进入盒。进入可以通过注射或任何其他适合的机构来协助。例如,样品容器可以包含活塞,所述活塞允许将样品从样品容器转移到样品通路中。
根据优选实施方式,盒体包含流体摄入口B,其在所述容器组装到盒体时通过流体通路B与样品容器流体连通,并允许将空气导入到样品容器中。为此目的,盒体可以包含流体出口B,在所述容器组装到盒体时空气可以通过所述流体出口B进入容器。可以将压力产生装置例如泵连接到流体摄入口B,由此允许将空气泵入样品容器。如果使用泵,压力优选地在100至1000mbar、优选地150至500mbar、更优选地200至250mbar的范围内。由泵产生的压力具有将样品通过样品摄入口压入到盒中并因此由样品流体通路引导到达反应仓室的效果。样品经样品出口进入反应仓室。
根据一种实施方式,提供了用于控制可以进入反应仓室用于干组合物重构的液体的量的机构。根据一种实施方式,至少一个反应仓室和/或用于将反应仓室连接到盒体的机构包含至少一个流体开口A,流体、尤其是空气或类似流体可以通过所述流体开口A离开反应仓室。因此,根据一种实施方式,反应仓室和/或用于将反应仓室连接到盒的连接突起物包含相应的流体开口A。由此,当样品被导入盒体并进入反应仓室时,空气可以从反应仓室逸出。空气基本上被样品驱替。根据一种实施方式,流体可以通过其离开反应仓室的流体开口A包含阻挡物,其中所述阻挡物显著阻止液体的通过。至少在所述阻挡物与液体发生接触之前,阻挡物允许空气通过。然而,它显著阻止液体的通过。由此控制可以进入反应仓室的样品的量,使得反应仓室填充有包含在反应仓室中的干组合物的正确重构所必需的所需量的样品。因此,所述阻挡物可以有利地用于计量,这是由于由阻止样品通过的膜所产生的反压力,仅有所需量的样品可以进入反应仓室。此外,它防止样品、包括反应仓室中包含的试剂被意外地冲出反应仓室。所述阻挡物优选为膜,其被放置成使得仅有预定量的样品能够进入到反应仓室中。当干组合物的重构所需的预定量样品已进入反应仓室时,至少一部分所述优选为膜的阻挡物与样品发生接触,然后优选地阻断样品的进一步进入。膜优选为疏水膜。它优选为多孔的。优选地,使用孔径在0.05μm至0.5μm、优选地0.1μm至3μm、更优选地1.5μm至2.5μm的范围内、最优选约为2μm的膜。膜可以包含聚合物。根据一种实施方式,膜包含支持物例如非织造尼龙支持物。根据一种实施方式,膜是在非织造尼龙支持物上铸造的丙烯酸共聚物膜,或在空气和液体通过方面具有相同性质的膜。所述起到样品阻碍物作用的膜,可以免除更复杂的装置,例如用于将预定量液体导入反应仓室的分发装置。使用所述在反应仓室被样品充满后阻止进一步的样品进入的阻挡物,可以实现足够精确的计量。因此,例如包含在处理装置中的泵可以将空气继续泵入反应容器中,直至膜产生可以阻止更多样品从容器进入盒的反压力。根据一种实施方式,所述可用于反应仓室排气并控制样品在盒中的输入的流体开口A,被定位成使得空气直接离开盒。根据一种实施方式,它可以包含在反应仓室中。
然而,所述流体开口A也可以包含在盒内部。例如,如实施例所示,它可以位于用于将反应仓室连接到盒的机构内,或可以由所述机构提供。优选地,所述用于反应仓室排气的流体开口A通入连接到其他流体出口A的其他流体通路A。提供这样的从一个或多个流体开口A接收空气的其他流体通路A具有特别的优点,尤其是如果分析方法涉及反应仓室内的一个或多个加热步骤的话,正如例如在许多扩增方法的情况下,这是由于可以阻断另外的流体通路A,由此防止或至少降低液体在加热步骤期间蒸发的风险。这可以提高所执行的包含加热步骤的分析方法的精确性。根据一种实施方式,提供了允许关闭将样品摄入口与样品出口相连的流体通路和/或将流体尤其是空气可以通过其离开反应仓室的流体开口A与流体出口A相连的流体通路A的机构。所述机构可以在所述流体通路内形成阻挡物,所述阻挡物与封闭所述流体通路的盖子联合,允许关闭或打开所述流体通路,由此起到简单的阀的作用。当向盖子施加压力时,阀被关闭,如果压力被移除,阀被打开。这种实施方式的进一步详细情况将在下面结合盒体进行描述。
此外,在样品通路中提供相应的阻挡物,具有可以以明显简单的方式进行样品从样品容器到盒中的转移的优点。在这里,样品容器包含与裂解溶液混合的样品。如上所述,对所述混合物进行加热以诱导样品的裂解。向盖子施加压力,从而关闭阀。加热步骤导致在样品容器中产生过压。如果通过从盖子移除压力以打开阀,则由于样品容器中产生的过压将样品冲出盒。样品由此通过所提供的样品通路进入反应仓室。通过提供如上所述的用于样品的包含阻挡物的流体开口A,来确保反应仓室的受控填充。这种实施方式是有利的,因为为了实现样品从相连的样品容器到盒的转移,不需分开的泵等。优选地,转移的样品是裂解的样品,更优选为如上所述的澄清的裂解的样品,或如上所述的裂解混合物。
本发明的盒具有明显简单的设计,因为它不需要用于样品处理或反应仓室中包含的干组合物的重构的液体或溶液的任何储液器。此外,盒不需要用于储存用过的样品材料和/或试剂的一个或多个分开的废液储存器。由于整个处理盒可以(仅)通过进入盒的样品来操作,所述样品优选为如上所述的裂解的样品或裂解混合物,因此不必操作或处理额外的液体或溶液。此外,由于没有在盒上提供液体以例如处理样品或重构干组合物,因此降低了所述液体淋滤的风险。这样的淋滤是相当大的问题,因为干组合物的部分重构可能不可逆地损害其中包含的试剂。除了样品之外不必提供液体这一特点与现有技术盒相比是显著的优点,这也改进生产并减低成本。
在优选实施方式中,盒体包含具有第一末端开口和第二末端开口的管,其中管的第一末端开口与样品摄入口对齐。因此管延长了样品通路。来自于样品容器的流体首先进入到管的第二末端开口中并通过管流动,在第一末端开口处离开管,并通过与管的第一末端开口对齐的样品摄入口进入样品通路。所述管可用于例如在组装到盒体时达到样品容器内,并且在例如利用经流体出口B进入样品容器的流体在样品容器中产生过压的情况下,或者通过当将裂解混合物加热并如上所述将包含在样品通路中的阀关闭时产生的过压,允许流体例如容器中包含的样品流入到样品通路中。
优选地,样品出口和流体开口A由排列在反应仓室侧壁中的管(尤其是在反应仓室作为整合元件提供时)或反应仓室连接突起物提供。在管中构造样品出口,具有样品以受控方式进入反应仓室,类似于好像用移液器将它吸取到反应容器的侧壁的优点。优选地,管包含在侧壁的凸面中。由此,可以防止反应仓室的不受控制的冲出。与反应仓室流体连通的流体开口B也优选地包含在侧壁的凸面中,优选地安排成与样品出口相对。所述排列方式的其他详细情况和优点在下文和附图中进行描述。
根据一种实施方式,将盒体组装到包含样品容器开口的样品容器,所述样品容器开口被安排成使样品容器开口与样品摄入口流体连接,使得流体例如样品可以从容器进入样品摄入口。所述样品容器含有与裂解组合物混合的待分析的样品。裂解组合物可以具有上面结合本发明的第一方面所描述的一种或多种特性。优选地,使用包含下列组分或由其构成的裂解溶液:
(a)至少一种非离子型表面活性剂或非离子型去污剂的混合物,
(b)至少一种聚合物,所述聚合物优选地通过潜在抑制剂的非特异性复合来防止或减少随后分析方法的抑制;
(c)任选地,蛋白消化酶,
(d)任选地,用于二价阳离子的螯合剂,和
(e)任选地,缓冲物质。
适合的详细情况也在上面进行过描述,参考相应的公开内容。它也可以包含磁性搅拌棒来协助样品在裂解溶液中的混合。优选地,它包含用于澄清裂解物的固相支持物,更优选地,它包含羧基化的磁性粒子。由此,可以有效地移除沉淀物,并提供可以作为“样品”通过样品摄入口的澄清的裂解物。可能已被裂解和/或从中移除了污染物或其他样品组分的相应地预处理过的样品,为简便起见在结合盒的情况下也被称为“样品”。裂解溶液和可用于澄清裂解物的固相支持物的其他详细情况已在上面进行过描述,参考相应的公开内容。
优选地,处理盒具有如下结合本发明的第六方面描述的盒体。
根据第六方面,提供了特定盒体。本发明的盒体可用于提供从含有流体例如样品的样品容器到至少一个反应仓室的流体连接。可以将样品容器和一个或多个仓室——如果作为分开的元件提供的话——组装到盒体。有利的是,这样的盒体可用于将本发明的第一方面的方法付诸实用。后面,我们将解释所述盒体的设计、元件和它们的功能,以及它们与可以组装到所述盒体的样品容器和反应仓室的相互作用,和/或可以使用相应的盒体进行的分析方法。正如所述,盒体适用于提供从含有流体并可以组装到盒体的样品容器,到可以组装到盒体或被提供为盒体的有机组成部分的至少一个反应仓室的流体连接。所述盒体包含:
-样品摄入口和样品出口,
-连接样品摄入口与样品出口的样品通路,
-用于连接样品容器的样品容器连接突起物,其中在将样品容器组装到所述连接突起物之后,样品摄入口与样品容器流体连通,
-用于连接反应仓室的至少一个反应仓室连接突起物,其中在将反应仓室组装到所述连接突起物之后,样品出口与反应仓室流体连通,和/或包含被提供为盒体的有机组成部分的至少一个反应仓室,
其中在反应仓室连接突起物和/或反应仓室中提供有至少一个流体开口A,并且其中所述流体开口A包含阻挡物,其中至少在所述阻挡物与液体发生接触之前所述阻挡物允许空气通过,但是其中所述阻挡物显著阻止液体通过。
正如上面和下面描述的,用经样品摄入口进入盒体并通过所提供的流体通路到达至少一个反应仓室的样品填充至少一个反应仓室,受到用于包含在流体开口A中的液体的阻挡物的控制。所述阻挡物优选地是多孔疏水膜,其允许空气通过(至少在润湿之前)但基本上不允许样品通过。一旦样品到达疏水膜,它就不能通过所述膜,并且反应仓室的填充自动停止,由此确保用预定的足够量的样品重构干组合物,所述样品优选为如上所述的澄清的裂解的样品。有利的是,所述盒体可以在本发明的第五方面的处理盒中用作盒体。样品出口以及流体开口A与至少一个反应仓室流体连通,所述反应仓室可以被提供为盒体的有机组成部分或提供为分开的元件。
随后,我们将具体描述特别优选实施方式的详细情况。进一步的详细情况和其他实施方式也在图、权利要求书和下文中进行描述。
盒体可以具有流体摄入口B和流体出口B,由此流体通路B将流体摄入口B与流体出口B相连。流体摄入口B可用于例如接收流体、优选为空气,所述流体流过流体通路B并在流体出口B处离开盒体,以例如进入样品容器。例如,如上所述,可以将流体摄入口B连接到压力产生装置,所述装置通过第一摄入口泵送空气。盒体还包含样品摄入口和样品出口,由此样品通路将样品摄入口与样品出口相连。样品摄入口可例如用于从样品容器获取液化产品例如样品,所述样品流过样品通路并在样品出口处离开,以例如进入反应仓室。
反应仓室和/或用于将反应仓室连接到盒体的反应仓室连接突起物包含至少一个流体开口,流体即空气可以通过所述流体开口离开反应仓室。因此,根据一种实施方式,反应仓室和/或反应仓室连接突起物包含流体开口A。由此,当样品被导入到盒体中并进入反应仓室时,空气可以从样品通路和反应仓室逸出。空气被样品驱替。根据优选实施方式,所述流体开口A包含允许空气通过但不允许样品通过的阻挡物,优选为膜。详细情况在上文中描述。由此控制了可以进入反应仓室的样品的量,使得反应仓室填充有重构反应仓室中所包含的干组合物所必需的所需量的样品。因此,所述阻挡物可用于计量,这是由于由阻止样品通过的膜所产生的反压力使得仅有所需量的样品被泵入反应仓室。使用包含在反应仓室中的流体开口A和/或包含流体开口A的第二突起物中所包含的所述阻挡物,可以实现足够精确的计量。详细情况在上面进行过描述。
在优选实施方式中,盒体包含流体开口A、流体出口A和连接流体开口A与流体出口A的流体通路A。流体开口A可以获取流体即气体例如空气,所述流体离开反应仓室并流过流体通路A以在流体出口A处离开盒体。如果分析方法包括在反应仓室中的加热步骤,例如在许多扩增方法的情形中那样,则提供这样的流体出口A和流体通路A具有特别的优点。流体通路A可以使用与盖子一起起到与阀相同的作用的小棒进行阻断,正如在上面描述并且将在下面进一步详细描述的。所述流体通路A的阻断防止液体在加热步骤期间的蒸发。这可以提高所进行的包含加热步骤的分析方法的准确性。
盒体具有用于连接样品容器的样品容器连接突起物。在将样品容器组装到样品容器连接突起物之后,流体出口B和样品摄入口与容器流体连通。因此,流体例如空气可以通过流体出口B进入样品容器,并且流体例如样品可以通过样品摄入口进入样品通路。优选地,将过压通过流体出口B导入到容器中以诱导样品的移动,正如在上面描述并且将在下面进一步详细描述的。然而,如上所述,为了将样品从容器转移到盒中,其他方法也是可行的。
所述第一突起物可以由一个或多个侧壁构成。通过所述一个或多个侧壁和底壁可以形成仓室。所述仓室可以具有与底壁相对的开口。在将样品容器连接到所述连接突起物之后,流体出口B和样品摄入口被安排在所述第一突起物的底壁或一个侧壁中。流体出口B和样品摄入口的这种排列方式允许将第一流体、优选为空气吹入到仓室和与样品容器连接突起物连接的样品容器中。由于离开流体出口B并进入仓室的样品容器的流体所产生的过压,这种被吹入到第一仓室中的空气可用于迫使其他液体例如样品容器中包含的样品离开与样品容器连接突起物相连的样品容器。样品摄入口的排列方式允许样品离开样品容器并沿着样品通路流向样品出口。
样品容器与盒体的连接,可以通过允许样品容器与盒体之间的紧密连接的任何适合的机构来实现。实例包括但不限于螺纹连接、夹子机构或卡口式夹子。根据一种实施方式,样品容器连接突起物的一个或多个侧壁适合于契合在样品容器的开口中以实现连接。或者,一个或多个侧壁可能适合于将连接突起物契合在第一仓室中,所述第一仓室可以由侧壁和底壁形成。
根据优选实施方式,本发明的盒体还具有至少一个用于连接反应仓室的反应仓室连接突起物。在将反应仓室组装到反应仓室连接突起物之后,样品出口与反应仓室流体连通。由此,样品可以通过样品出口进入到反应仓室中。反应仓室连接突起物可以由一个或多个侧壁和底壁构成。反应仓室与反应仓室连接突起物之间的连接同样可以通过确保盒体与反应仓室之间的紧密连接的任何适合的机构来实现。例如,第二突起物连接的一个或多个侧壁可以适合于契合到反应仓室的开口中,或者侧壁可能适合于将反应仓室的连接突起物契合在第二突起物连接的第一仓室中,所述第一仓室可以例如由一个或多个侧壁和底壁形成,并且具有与底壁相对的开口。反应仓室可以连接到反应仓室连接突起物的侧壁或底壁。
样品出口以及任选地流体开口A可以安排在反应仓室连接突起物的底壁或至少一个侧壁中。正如上面讨论的,还可以设想在反应仓室中提供流体开口A。然而,优选地将它们提供在盒体中,尤其是在本文中所描述的反应仓室连接突起物中。样品出口和流体开口的这种排列方式允许样品通过样品出口进入到反应仓室中。优选地,样品出口和流体开口A由排列在反应仓室连接突起物的侧壁中的管提供。所述管可以具有任何形状,并且也可以包含例如转角。将样品出口构造在管中,具有样品以受控方式进入反应仓室,类似于好像用移液器将它吸取到反应容器的侧壁的优点。由此,可以防止反应仓室的不受控制的冲出。与反应仓室流体连通的流体开口A允许反应仓室中的空气,被反应仓室内由来自于样品容器、通过样品通路并经样品出口进入反应仓室的样品所产生的压力驱动,离开反应仓室。优选地,流体开口A由安排在反应仓室连接突起物的底壁中的管提供。正如上面和下面所描述的,所述流体开口A优选地用膜、优选为疏水膜封闭,以便当反应仓室充满预定量以及因此所需量的重构所必需的样品时,控制样品进一步进入到盒和相应的反应仓室中。密封流体开口A的膜至少在样品润湿膜之前允许空气逸出。一旦膜被润湿,空气的通过通常也被阻碍或甚至阻止,或者只有在产生高压时空气才能通过,正如在反应仓室内进行加热反应时可能出现的情况。优选地,所述膜被置于包含在第二突起物连接的侧壁中的管的上部末端处。提供采取管的形式的流体开口A并将膜置于所述管内或优选地置于所述管的上部末端处,具有可以防止过早关闭反应仓室的优点。即使样品由于施加的压力而快速冲出反应仓室,反应仓室也必定在样品上升到管之前首先被填充。由此确保在样品接触并因此润湿膜从而锁住反应仓室之前,反应仓室被所需量的样品填充。由此防止了样品出口和流体开口A的不想要的分流,所述分流可能导致反应仓室未填充有干组合物的正确重构所必需的预定量的液体。
本发明的盒体被描述为具有流体摄入口和流体出口。优选地,流体摄入口(或通称的开口)和流体出口被理解为是或包含盒体中的孔。流体摄入口可以形成孔,流体通过所述孔流入到流体通路中,流体出口可以形成孔,流体通过所述孔从流体通路流出。它可以提供成管的形式。在两个流体通路的联结处,同一个孔可以提供两种功能。流体摄入口、通称的开口和流体出口的形状都不受限制。孔可能是圆形或椭圆形的。然而,孔也可以是正方形、三角形或任何其他几何形状。孔可以是开孔。孔也可以包含膜或滤器,或者可以被它们覆盖。在这种情况下,它们仍被理解为孔并因此被理解为开口或出口,只要目标流体能够通过膜或滤器流动即可,即使另一种类型的流体不能通过所述膜或滤器。
根据权利要求,盒体具有流体通路。作为流体通路,它们允许流体例如液体(尤其是样品)或气体、尤其是空气的流动。它们可以具有任何形式或尺寸。通路可以包含一个或多个通道和/或空腔。它们可以在其顶端开放,并且例如可以使用盖子例如塑料薄膜来封闭。如上所述,它们可以包含棒,所述棒与盖子一起提供简单的阀。通路还包括通过盒体进行引导的用于流体的导管。通路在横截面中不一定具有对称形状。本发明的通路可以引导流体以预定方向流动。例如,如果通过施加压力将样品引入到样品通路中,则样品通路引导样品流入一个或多个反应仓室。流体通路A将空气导向流体出口A,从而在引入样品时允许空气离开通路系统和反应仓室。
盒体的样品容器连接突起物可以由一个或多个侧壁构成,所述侧壁在优选实施方式中可以围出第一仓室,所述第一仓室由底壁进一步形成并与具有与底壁相对的开口。在优选实施方式中,样品容器连接突起物的侧壁形成管状体,这仅仅意味着所述侧壁可以由在其面向的末端处封闭的一个侧壁构成。因此,当在本文中使用时,术语“侧壁”也指称并涵盖其中仅使用一个相应侧壁的实施方式。然而,样品容器连接突起物不一定是管状形状的。例如,样品容器连接突起物可以具有矩形或方形横截面,由两个或更多例如四个在其相应末端处彼此相连的侧壁构成。样品容器连接突起物也可以具有三角形横截面或任何其他适合的横截面。由一个或多个侧壁形成的第一仓室由底壁进一步形成。优选地,样品容器连接突起物具有杯子形状。样品容器连接突起物的底壁可以是平坦表面。然而,与杯子相同,底壁也可以具有圆形形状。根据一种实施方式,仓室具有与底壁相对的开口。这个开口可以与侧壁所留下的面积一样大。然而,开口也可以形成在顶壁中,所述顶壁进一步拓宽第一仓室并被安排成与底壁相对。
根据一种实施方式,样品容器连接突起物适合于契合在样品容器的开口中,或适合于将样品容器的连接突起物契合在样品容器连接突起物的第一仓室中。连接突起物优选地适合于将样品容器连接到连接突起物的侧壁,并因此适合于允许将样品容器紧密连接到盒体。
优选地,将流体出口B和样品摄入口安排在样品容器连接突起物的底壁中或一个侧壁中。流体出口B和样品摄入口不必安排在同一元件处。例如,可以将流体出口B安排在底壁中,并且可以将样品摄入口安排在第一突起物的一个侧壁中。优选地将流体出口B和样品摄入口安排成开放到第一仓室中。然而,将流体出口B和样品摄入口安排在侧壁中并在侧壁的顶表面上开口,也是可行的。
盒体的反应仓室连接突起物也可以由一个或多个侧壁构成,所述侧壁在优选实施方式中可以围出第二仓室,所述第二仓室由底壁进一步形成。它可以包含与底壁相对的开口。在优选实施方式中,反应仓室连接突起物的侧壁形成管状体,这意味着所述侧壁可以由在其面向的末端处封闭的一个侧壁构成。然而,反应仓室连接突起物不一定是管状形状的。例如,反应仓室连接突起物可以具有矩形或方形横截面,由四个在其相应末端处彼此相连的侧壁构成。反应仓室连接突起物也可以具有三角形横截面或任何其他适合的横截面。由侧壁形成的第二仓室由底壁进一步形成。优选地,反应仓室连接突起物具有杯子形状。反应仓室连接突起物的底壁可以是平坦表面。然而,与杯子相同,底壁也可以具有圆形形状。仓室具有与底壁相对的开口。这个开口可以与侧壁所留下的面积一样大。然而,开口也可以形成在顶壁中,所述顶壁进一步拓宽第一仓室并被安排成与底壁相对。
根据一种实施方式,反应仓室连接突起物适合于契合在反应仓室的开口中,或者适合于将反应仓室的连接突起物契合在反应仓室连接突起物的仓室中。连接突起物适合于将反应仓室连接到连接突起物的侧壁,并因此适合于允许将样品容器连接到盒体。
根据一种实施方式,将样品出口和流体开口A安排在反应仓室连接突起物的底壁中或一个侧壁中。样品出口和流体开口A不必安排在同一元件中。例如,可以将样品出口安排在底壁中,并且可以将流体开口A安排在一个侧壁中。优选地将样品出口和流体开口A安排成开口在反应仓室连接突起物的仓室中。然而,将样品出口和流体开口A安排在侧壁中并在侧壁的顶表面上开口,也是可行的。此外,如上所述,流体开口A也可以包含在反应仓室中,优选地在顶部处,尽管优选地将它提供在盒体中。在这里,出于上述原因,样品出口和流体开口A优选地也提供为侧壁的凸面中的管。
在优选实施方式中,盒体包含具有第一末端开口和第二末端开口的管,其中管的第一末端开口与样品摄入口对齐。因此,管延长了样品通路。来自于样品容器的流体将首先进入到管的第二末端开口中并通过管流动,在第一末端开口处离开管并通过与管的第一末端开口对齐的样品摄入口进入样品通路。所述管例如可用于在组装到盒体时到达样品容器内,并且如果利用经流体出口B进入样品容器的流体在样品容器中产生过压,则允许容器中包含的流体例如样品流入到流体通路中。过压可以由压力产生装置例如泵来产生,所述压力产生装置可以连接到流体摄入口B。
管可以具有任何形状和材料,并且可以例如是柔性的。然而,根据优选实施方式,管是刚性、纵向的管。这允许将样品容器更容易地附连于盒体,并且在将样品容器附连于盒体时允许管更容易地进入到样品容器的开口中。优选地,管由与盒体相同的材料制成。优选地,它形成所述盒体的有机组成部分。
在优选实施方式中,样品容器连接突起物的一个或多个侧壁和/或反应仓室连接突起物的一个或多个侧壁形成管状体。以管状体的形式形成样品容器连接突起物和/或反应仓室连接突起物,促进样品容器与样品容器连接突起物的紧密连接,并促进反应仓室与反应仓室连接突起物的紧密连接。
样品容器和反应仓室与连接突起物之间的组装,可以通过任何适合的机构来实现。连接可以基于形状锁合、力锁合和/或摩擦锁合的原理。取决于所选的连接机构,第一和反应仓室连接突起物包含适合的元件是实现这样的连接。在优选实施方式中,样品容器连接突起物的一个或多个侧壁形成管状体,并且管状体具有外螺纹,由此允许在匹配的样品容器与盒体之间通过螺丝接合实现连接。优选地,反应仓室连接突起物的一个或多个侧壁也形成管状体,所述管状体包含用于组装反应仓室的机构。由于优选地将超过一个反应仓室组装到一个盒体,因此优选地使用允许一次组装包含多个反应仓室的套件的机构。
流体通路可以至少部分地由形成在盒体的底板表面中的至少一个通道和/或空腔形成。提供带有底板的盒体,允许更容易地操作盒体。提供至少部分地采取形成在底板表面中的至少一个通道和/或空腔形式的流体通路,允许获得产生流体通路的容易的制造方法,因为例如通过对底板进行注射模制或通过在已经提供的底板内切割出通道或空腔,可以容易地在底板表面内形成通道和/或空腔。
通路尤其是指相应的流体可以通过其流动并且引导流体流动的空间。因此,相应的通路通常始于相应的摄入口并终止于相应的流体出口。优选地,通路由至少一个通道和/或空腔提供。这也包括其中通过通道和/或空腔的系统并因此通过多个通道和/或空腔来实现流体连通的通路。为了到达可以安排在盒体的不同侧面上的相应的流体摄入口或相应的流体出口,其中相应的通路不能完全由基体表面中的通道形成的设计也是可行的。例如,其中通路不得不至少部分地以导管的形式引过盒体以便到达相应的流体摄入口或相应的流体出口的设计,是可行的。
在优选实施方式中,盒体提供有附连于底板的盖子,由此使盖子至少部分地封闭包含在盒体中的通路。这允许以简单的方式制造盒体。正如上面讨论的,可以将流体通路设计成导管,所述导管可以例如在盒体内钻出。与在盒体内钻出的导管相比,包含在盒体表面中的通道或空腔可以更容易地制造。为了使由一个或多个通道或空腔形成的流体通路流体密封,正如在本发明的这一特定实施方式中所述,将它用至少一个盖子封闭。盖子优选地由塑料薄膜或箔片提供,所述薄膜或箔片可以附着于或融合到盒体。盖子的厚度可以为20μm至500μm,并且优选地在50μm至300μm、更优选地75μm至250μm、最优选地100μm至150μm的范围内。在一种实施方式中,盒体包含复合盖子,例如可以使用不同的盖子部分来封闭不同流体通路的一个或多个通道和/或空腔。在优选实施方式中,盒体包含封闭至少两个、优选地所有流体通路的通道和/或空腔的盖子。这种设计进一步简化了盒体的制造过程。
在优选实施方式中,盒体提供有底板,由此将流体摄入口B、流体出口B、样品摄入口、样品出口、流体开口A和流体出口A安排在底板的同一表面中。将流体摄入口和流体出口安排在底板的同一表面上,允许以简单的方式将盒插入到处理装置中。
在优选实施方式中,通过膜和滤器将流体摄入口B、流体开口A和/或流体出口A封闭。此外,正如在附图中所示,也可以用膜将一个或多个流体通路在其长度上至少部分地覆盖并相应地密封。这种除了盖子之外的措施确保没有液体、尤其是样品能够离开盒体。所提供的膜或滤器可以例如通过挡住由流体运输的粒子,而具有清洁流入或流出的流体的基本功能。此外,对于包含在与反应仓室流体连通的流体开口A中的膜或滤器来说,滤器或膜可以用作一种类型的阀,用于控制流体、在这里是样品的流动。在优选实施方式中,流体开口A提供有仅允许空气或类似流体通过,但是阻止其他类型的流体、特别是密度较高的流体和/或特别是水或基于水的流体例如样品通过的膜。在优选实施方式中,膜是疏水的。这样的膜的使用允许控制可以流出反应仓室的流体的类型。样品可以通过样品出口进入反应仓室。进入反应仓室的流体引起反应仓室中的过压。然而,空气可以通过包含在流体开口A中的膜逸出,由此允许更多样品进入到反应仓室中。然而,流体样品不能通过所述膜。由此,反应仓室中包含的样品的量受到控制。一旦膜与样品发生接触,反应仓室就基本上被锁住。因此,提供包含相应的疏水性膜或滤器的流体开口A,为控制反应仓室中的压力和控制经样品出口进入反应仓室的样品的量,提供了可能性。反应仓室的尺寸可以使一旦基本上所有的空气通过包含在流体开口A中的膜离开反应仓室,因此反应仓室完全或基本上完全被样品填充之后,在反应仓室中提供预定量的样品来重构干组合物,所述预定量的样品对于提供包含必需浓度的试剂的重构的组合物来说,是必需的。
在优选实施方式中,盒体是单片元件。在特别优选的实施方式中,单片元件通过di-浇铸或注射模制来生产。在可选实施方式中,盒体具有单片盒体和附连于所述单片基体的盖子。这允许更容易地制造盒体。盖子优选地可以制造成箔片,在箔片的某些区域中提供有胶粘剂,从而允许将盖子永久地附连于基体。
根据一种实施方式,样品通路和/或流体通路A可以安排有阀。阀优选地被设计成防止流体通过相应的流体通路流动。优点已在上面描述,并且当在样品容器和/或反应仓室中进行加热反应时尤其适用。如上所述,如果将相应的流动通路设计成具有阻断通路的棒例如壁,由此中断通道,则可以实现阀的容易的实施方式。为了形成阀,可以将这样的通道用盖子关闭,所述盖子在壁的区域中包含可移动的例如柔性的板。可移动的区域可以通过机械机构,例如包含在处理装置中的销针或力量来固定。如果撤回销针,通路中流体的压力将盖子的可移动部分向后推,并允许流体流过通道中提供的壁。根据一种实施方式,盖子的可移动部分通过柔性机构连接到盖子的剩余部分,所述柔性机构在一方面允许可移动部分移动,在另一方面提供必需的流体密闭性以防通路中的流体流到除了跟随在壁之后的流体通路的其他部分之外的任何别的地方。在可选实施方式中,盖子本身可以包含能够在流体通路中移动以阻断它的棒,例如壁。例如,上面描述的可移动部分可以包含壁。如果可移动部分后移,则壁后移并阻断流体通路,由此关闭以这样的方式设计的阀。
盒体可以包含用于连接其他反应仓室的至少一个其他连接突起物,其中所述其他连接突起物可以包含与上述反应仓室连接突起物相同的元件。使用超过一个反应仓室具有可以使用同一盒进行超过一个分析反应的优点。这允许检测同一样品中例如不同病原体或疾病的存在。
根据第八方面,提供了用于生产本发明的第五方面的处理盒的方法,其中所述处理盒包含至少一个反应仓室,其包含含有用于执行分析方法的试剂的干组合物。所述方法包括下列步骤:
(a)从聚合物制造盒体,所述盒体具有至少一个通道和/或空腔,以在盒体的样品摄入口与盒体的至少一个样品出口之间提供流体通路;
(b)将试剂点样在至少一个反应仓室中并将其中的试剂干燥,由此提供包含含有用于执行分析方法的试剂的干组合物的反应仓室;
(c)用盖子封闭盒体的至少一个通道和/或空腔。
优选地将一个或多个反应仓室提供为分开的器件。这简化了试剂的点样和干燥过程,所述干燥过程优选为冷冻干燥过程。关于干组合物和其中包含的组分的详细情况,在上面已结合本发明的第一方面进行过描述。可以参考相应的公开内容。在一个或多个反应仓室中获得干组合物之后,所述方法包括将至少一个反应仓室组装到盒体的步骤。所述组装在步骤c)之后进行。
盒体优选地通过注塑模制技术生产。如上所述,盒体优选地包含至少一个膜。它在多步骤过程中生产,其中将至少一个膜组装在注塑模具中,并且其中在第一步中注塑盒的上侧或下侧并在第二步中注塑另一侧,由此提供包含膜的盒体。
根据本发明的第九方面,提供了用于执行包含生物分子的样品的分析方法的系统,所述系统包含:
a)本发明的第五方面的处理盒;其中处理盒包含至少一个反应仓室,所述仓室包含包括用于分析方法的试剂的干组合物;
b)用于接收包含生物分子的样品的容器,其中容器可以组装到处理盒;
c)用于接收包含组装有容器的处理盒,并与处理盒联合来执行分析方法的处理装置。
所述系统包含如上所述的处理盒。此外,系统包含用于收集包含生物分子的样品的容器,其中容器可以连接到处理盒。作为第三个元件,系统包含用于接收盒并在处理盒内执行分析方法的处理装置。处理装置的设计取决于待执行的分析方法。一些详细情况将在后面结合使用相应系统执行分析方法的操作方法进行描述。
根据第十方面,提供了使用第九方面的系统执行分析方法的操作方法,所述方法包括:
a)将包含样品的容器连接到本发明的第五方面的处理盒;
b)将处理盒插入到处理装置中;以及
c)开始全自动测定。
下面,我们将解释相应的操作方法的各个步骤。在第一步中,获得样品并将其插入到容器中。容器优选地包含适合于裂解收集到的样品并适用于重构包含在处理盒的反应仓室中的干组合物的裂解组合物。裂解组合物优选为如上所述的裂解溶液。可以将包含样品的容器封闭,以便例如能够操作容器而没有将包含的样品洒出的风险。为了启动操作方法,将包含样品和裂解组合物的容器连接到处理盒。为此目的,处理盒包含允许容器与盒之间的紧密连接的适合机构。详细情况在上文中进行过描述。一旦将容器连接到盒之后,可以将包含组装的容器的盒立即插入到处理装置中。因此,顾客需要做的仅仅是将包含收集到的样品的容器连接到处理盒并插入到处理装置中。所有随后的步骤自动进行。
根据优选实施方式,样品在容器内裂解。优选地,包含在容器中的裂解组合物包含如上所述用于澄清裂解的样品的固相支持物。优选地,通过加热来协助裂解。为此目的,处理装置可以包含加热单元。此外,如果使用磁性固相支持物来澄清裂解物,则处理装置优选地包含磁体,以便将带有结合的沉淀物/污染物的磁性固相支持物收集在容器的底部或侧壁处。由此,可以高度有效地澄清裂解的样品。裂解的样品、优选为澄清的裂解的样品,通过样品摄入口进入处理盒。优选地,处理盒具有如上结合本发明的第五和/或第六方面所描述的盒体设计,具有流体摄入口B、第一流体通路和流体出口B以及样品摄入口。如上所述,相应的流体系统提供了非常简单的设计,以便实现样品、优选为澄清的裂解物向处理盒的转移。处理装置可以包含压力产生装置,其允许将空气泵过流体摄入口B。空气通过第一流体通路和流体出口B进入到反应容器中。得到的压力具有将包含在容器中的样品、优选为澄清的裂解物推高,并因此通过样品摄入口进入处理盒的效果,所述样品摄入口优选地被设计成如上所述的样品摄入口。实现样品进入的其他方式已在上面进行过描述。
为了协助样品的进入,处理盒优选地包含延伸到容器内并优选地延伸到样品、优选为澄清的裂解的样品内的管。在通过样品摄入口进入处理盒之后,样品通过样品通路直至它到达样品出口。从所述样品出口,样品、优选为如上所述获得的澄清的裂解物进入包含干组合物的反应仓室。由此,样品、优选为裂解的样品,与干组合物发生接触并因此将其重构。重构过程可以例如通过如上所述的混合、涡旋振荡或磁导向来协助。在干组合物包含磁性材料以允许磁导向、例如磁性箔片的情形中,处理装置包含允许包含在反应仓室内的干组合物中的磁性材料移动的磁体。根据一种实施方式,处理装置包含交流电压下的电磁体。根据其他实施方式,提供旋转的永磁体。
对反应仓室的填充进行控制,以便确保仅使用预定量的液体来重构干组合物。根据优选实施方式,一旦样品到达形成液体样品阻挡物的疏水膜时,样品对反应仓室的填充立即停止。正如在附图中所示,所述疏水膜优选地放置在第三流体摄入口的末端处。
在重构干组合物后,可以执行分析方法。处理装置包含执行分析方法所必需的机械。例如,如果进行核酸扩增,则处理装置在反应仓室所在区域中包含执行PCR反应所必需的所有元件,例如尤其是加热和冷却元件。此外,处理装置优选地包含荧光检测器,以便能够进行实时PCR和/或能够检测荧光信号。然而,处理装置也可以包含用于进行检测的其他机构,例如分光光度测量、雾度测量、纳米粒子聚集体测量等。随后,优选地也通过处理装置展现测定法的结果,例如展现在读数单元中。
由于非常简单的设计以及非常简单的流体系统,本发明的整个系统是独特的。处理盒使用疏水膜作为样品停止和计量结构,并且不包含任何复杂的阀,而是能够通过阻挡物例如棒/壁暂时关闭流体通路。此外,它能够通过将空气泵入容器或利用当样品在与处理盒相连的容器中加热时产生的过压,在系统内简单地移动样品。因此,与其他处理盒和系统相反,整个设计被减小到最小,由此允许高成本效益地生产所有元件。在完成测定后,整个处理盒可以与连接到它的容器一起丢弃。在将容器组装到处理盒之后,将整个系统封闭,由此防止包含在盒中的样品或例如扩增产物能够逸出盒。为此目的使用适合的膜。为执行分析方法而需要使用的唯一液体来自于包含样品的容器。容器是收集容器,并在同时起到样品处理容器的作用,因为用于在处理盒内进行分析的样品的制备例如样品裂解,在其中进行。此外,容器还起到包含唯一液体即样品的液体容器的作用,如果需要,对所述液体进行预处理以使它适用于反应仓室中包含的干组合物的重构。如果目标生物分子是核酸,优选地在上面结合本发明的第一方面描述的容器内将样品裂解并澄清。通过样品摄入口进入盒体的样品适用于重构包含在反应仓室中的干组合物,使得重构的组合物适合于以所需的灵敏度和/或特异性执行目标分析方法,包括例如扩增和检测反应。根据一种实施方式,为此目的,将样品在容器中进行制备,例如如上所述的裂解和澄清。容器优选地包含500μl至3ml的裂解和/或稳定化溶液。制备用于核酸分析的样品的优选裂解溶液已在上面进行过描述。所述裂解溶液优选地包含如上所述用于澄清裂解物的固相支持物。通过将容器连接到处理盒来获得有功能的测试单元。
使用本发明的处理盒操作测定法流程的处理装置包含精心设计的机械系统。设计取决于待进行的分析方法。处理装置内部的主要机械-电子零件是支持样品裂解的加热元件、当将容器组装到处理盒时适用于将空气泵入容器中的泵、用于磁导向的至少一个磁体。此外,在将要进行PCR反应的情形中,提供PCR单元。通常通过Pelletier元件来便于在处理装置内进行的PCR反应的热循环。处理盒与处理装置之间的所有连接优选地用膜密封。整个系统具有低的复杂度。
本文中提到的数值范围包含定义范围的数字。本文中提供的标题不限制可以通过参考作为整体的本发明的说明书而看到的本发明的各个方面或实施方式。根据一种实施方式,在本文中,在方法的情形中被描述为包含某些步骤,或者在组合物、溶液和/或缓冲剂的情形中被描述为包含某些成分的主题内容,是指由相应的步骤或成分构成的主题内容。优选地对本文描述的优选实施方式进行选择和组合,并且从优选实施方式的相应组合产生的特定主题内容也属于本公开。
附图描述
图1示出了使用按照实施例1获得的澄清的裂解物和未澄清的裂解物(参比)进行的定量PCR的结果。MasG:MagAttract悬液G(QIAGEN);MasB:MagAttract悬液B(QIAGEN),Seradyn(羧基化磁性粒子);ref:没有进行磁性粒子处理(澄清)的裂解物。
图2示出了实施例2的结果,其中测试了不同珠子的裂解物澄清。一个参比在没有珠子但具有血液的情况下处理(无裂解物澄清),第二参比在没有珠子也没有血液但具有掺入的细菌的情况下测试。因此,第二参比示出了其中基本上不存在PCR抑制性化合物/沉淀物的PCR的结果。
图3证实了本发明的裂解物澄清过程的效率。在左侧示出了未澄清的血液裂解物,在右侧是同样的样品,但是在其中已按照本发明进行了裂解物澄清。
图4示出了实施例3的结果,其中使用7个不同的阴道拭子样品来产生澄清的裂解物;将10μl澄清的或粗(未澄清的)裂解物直接用于定量PCR中。
图5示出了4个不同的阴道拭子样品的结果,所述样品被裂解并在其中使用不同类型的磁性粒子来澄清裂解物。在定量PCR中使用10μl裂解物。Seradyn(羧基化珠子);MasG(MagAttract悬液G(QIAGEN));MasB(MagAttract悬液B(QIAGEN))。
图6示出了合并的阴道拭子样品,所述样品使用不同磁性粒子进行处理,并且其中将不同体积的澄清的裂解物直接用于定量PCR,在其中检测人类基因组DNA。通过加入25μl裂解物或澄清的裂解物来重构干燥的PCR组合物。
图7示出了当处理酸性样品例如阴道拭子样品时,在裂解期间掺入沸石的有益效果。按照实施例6,将样品在具有和不具有沸石的情况下进行处理。
图8示出了实施例7的结果,其中在具有和不具有沸石的情况下对血样进行处理,并将不同体积的裂解物直接用于定量PCR中,以便检测大肠杆菌的基因组DNA。使用25μl澄清的裂解物来重构包含引物和探针的干燥的PCR混合物。
图9示出了实施例8的结果。将来自于8位不同供体的口腔拭子样品在具有和不具有沸石的情况下进行处理,并将不同体积的裂解物直接用于定量PCR中。
图10示出了实施例9的结果,其中将来自于16个独立制备物的粪便拭子样品在Seradyn珠子存在下进行处理;并将不同体积的得到的澄清的裂解物直接用于定量PCR中,在其中检测大肠杆菌基因组DNA和人类基因。
图11示出了当使用羧基化磁性珠子移除沉淀物时对PCR的影响(参见实施例11)。样品1、2、5和7是其中未加入磁性珠子来澄清裂解物的阴道拭子样品。样品3、4、6和8是通过向阴道拭子样品的裂解物加入羧基化磁性粒子而获得的澄清的裂解物。
图12a)示出了本发明的盒体的顶视图,图12b)示出了图12a)的盒体沿着图12a)的线A-A切开的侧视图。
图13示出了组装有样品容器和反应仓室的图12的盒体的侧视图。
图14示出了本发明的盒从下方观察的透视图。
图15示出了本发明的盒的其他实施方式的部件分解图。
图16是如图15中所示的样品盒的顶视图。
图17示出了包含可以组装到盒的多个反应仓室的装置,用于提供包含反应仓室的处理盒。
图18示出了流体通路6和9内起到阀的作用的壁的功能。
图19示出了本发明的系统。
图20示出了样品的收集。
图21示出了如实施例12中所述的用于进行样品裂解和冷冻干燥的PCR混合物的重构的本发明的不同实施方式的性能。
图12a)中示出的盒体33具有流体摄入口B(1)和流体出口B(2)。流体通路B(3)由排列在盒体顶表面处的边界壁提供。由此形成允许流体通过的空腔。因此,在图12a)中示出的实施方式中,提供了具有接近正方形横截面的流体通路B(3),由此将流体摄入口B(1)安排在正方形流体通路B(3)的一个角中,并将流体出口B(2)安排在流体通路B(3)的第二个角中。在将样品容器连接到盒体时,可以通过流体摄入口B(1)进入流体通路B(3)的流体、优选为空气,从流体摄入口B(1)穿过正方形形状的流体通路B(3)流向流体出口B(2)并进入样品容器。正如本文中所述,可以将泵连接到流体摄入口B(1),以便使用压力将空气导入到盒以及因此样品容器中,由此缓解样品向盒的进入。图12a)中示出的盒体33进一步提供有样品摄入口4和样品出口5。样品摄入口4和样品出口5由样品通路6相连。样品通路6由盒体顶表面上的通道产生。如果将反应仓室组装到盒体33,从容器通过样品摄入口4进入盒体的样品沿着样品通路6移动,直至它到达样品出口5并通过样品出口5进入反应仓室。图12中示出的实施方式被设置用于接受4个反应仓室,其通过盒体33的4个反应仓室连接突起物连接到盒体。反应仓室连接突起物可以在图12b)中看到。在组装反应仓室之后,它们与样品通路6流体连通,所述样品通路6具有支路,并且其中每个支路终止于通入不同反应仓室的不同样品出口。然而,正如在本文中所述,将反应仓室提供为盒体的有机组成部分,也在本发明的范围之内。
此外,盒体被提供有流体开口A(7)和流体出口A(8)。设计类似于样品通路6的流体通路A(9)是盒体顶表面内的通道,其将流体开口A(7)与流体出口A(8)相连。流体开口A(7)和样品出口5各自被设计成管,所述管被部分地包含在反应仓室连接突起物侧壁的凸面中。所述管与反应仓室流体连通。流体开口A(7)和样品出口5彼此相对排列。将流体开口A(7)和样品出口5设计成至少部分在反应仓室侧壁内的管,具有良好地调节流体在反应仓室内的流动的优点。样品通过管状样品出口5进入到反应仓室中,类似于好像将样品手动吸取到反应仓室的侧壁。由此,可以防止反应仓室的不受控制的冲出,其可能引起反应仓室的不规则的填充。流体开口A(7)包含作为液体阻碍物的疏水膜。所述膜防止进入反应仓室的液体例如尤其是样品通过所述阻挡物。因此,由于流体开口A中的膜,液体不能进入流体通路A(9)。然而,疏水膜至少在被液体润湿之前允许空气通过。因此,被样品驱替的空气可以通过流体开口A(7)离开样品通路6和反应仓室。因此,对于空气来说,流体开口A(7)可以被当作流体摄入口,它引导空气进入流体通路9,从那里通过流体出口A(8)逸出盒。流体出口A(8)和流体摄入口B(1)两者包含疏水膜,用于密封盒以防反应仓室中包含的液体、尤其是样品和/或反应产物(例如扩增子)的无意泄漏。在组装样品容器后,处理盒的这种不透流体的密封,具有可以将包括所连接的样品容器的整个处理盒在使用后容易地丢弃的优点。
样品通路6和流体通路9包含小棒54,其通过破坏提供流体通路的通道来阻断流体通路6和7。与优选为封闭盒体的箔片的处理盒的盖子(未示出)一起,所述棒起到阀的作用,允许可逆地关闭并因此密封样品通路6和流体通路A。这是有利的,因为它防止液体,例如源自于在相连的样品容器或组装的反应仓室中进行的加热反应的蒸发的水,通过样品通路6和流体通路A流动。对于样品通路6来说,有利的是防止液体、例如在为裂解样品而进行的加热步骤期间从样品容器蒸发的水意外地通过样品通路6流动并到达包含干组合物的反应仓室。蒸发的液体的这种逸出可能引起反应仓室中包含的干组合物的部分重新水合,这可能损害所述干组合物,由此危及随后分析方法的性能。通过在为样品裂解而执行的热处理期间在盖子上施加压力,阀被关闭,从而防止蒸发的液体到达反应仓室。在裂解后,从盖子撤除压力,由此打开阀并允许样品流过小棒54,所述样品因此可以通过样品出口5进入反应仓室。对于流体通路A(9)的阻断来说,可以阻止反应仓室中包含的液体的蒸发。尽管流体开口A(7)包含疏水膜,但如果在反应仓室中进行加热步骤,由于产生的压力,有时不能通过膜完全防止蒸发。因此,如果在反应仓室中进行加热步骤,在流体通路A(9)中提供棒54是特别有利的。
正如可以在图12b)中看到的,盒体被提供有样品容器连接突起物10。样品容器连接突起物10由围出第一仓室12的侧壁11构成,所述仓室进一步由底壁13形成并具有与底壁13相对的开口14。连接突起物的侧壁适合于契合到样品容器的开口中,并适合于将样品容器连接到连接突起物10的侧壁11。正如可以在图12b)中看到的,将样品摄入口4安排在底壁13中。正如可以从图12a)看出的,也将流体出口B(2)安排在底壁13中。可以利用提供在侧壁11的外侧上的外螺纹15将样品容器连接到样品容器连接突起物10的侧壁11。
盒体还提供有反应仓室连接突起物20,其由围出第二仓室22的侧壁21构成,所述仓室进一步由底壁23形成,并具有与底壁23相对的开口24。连接突起物的侧壁21适合于契合到形成反应仓室的插座的开口中。所述形成反应仓室的插座可以连接到反应仓室连接突起物20的侧壁。正如可以在图12b)中看到的,样品出口5被安排成一个侧壁21中的管或通道,并在侧壁21的下端处开口。同样地,第三流体开口A(7)被安排在一个侧壁21中,并在所述侧壁21的下端处开口。在上端处提供有疏水膜。
正如可以从图12b)看出的,提供了管30。管30具有第一末端开口31和第二末端开口32。第一末端开口31与样品摄入口4对齐。正如可以从图12b)看出的,管30与盒体33被安排成单片。
图13a)示出了与图12中示出的相同盒体33的侧视图,其中已将样品容器39组装到盒体。在组装之后,管30伸到样品容器39中,并因此当样品管39被裂解溶液和待分析的样品充满时位于裂解溶液中,由此减缓了样品的进入。此外,样品处理盒包含反应仓室38,其包含包括用于执行目标分析方法的试剂的干组合物。正如可以从图13b)看出的,提供了4个反应仓室38(a)至38(d)。将反应仓室38提供为一个独立的器件,将所述器件安装在反应仓室连接突起物20上以组装到盒。
图13b)示出了图13a)的包含反应仓室38(a)至38(d)的器件沿着图13a)中的线A-A切开的侧视图。将包含用于执行分析方法的干试剂的反应仓室38(a)至38(d),通过反应仓室连接突起物20组装到盒体33。将流体开口A(7)用膜40密封,所述膜是疏水和多孔的,并且允许空气但不允许液体通过。一旦疏水膜40被液体润湿后,空气的通过被阻碍。因此,一旦样品润湿疏水膜40,反应仓室38立即被密封。
在图12和13中示出的盒体33,可以形成如图14中所示的组装有样品容器39的处理盒的一部分。在图12、13和14中示出的实施方式中,将盒设计成具有4个反应仓室38。为此,图12中示出的盒体的样品通路6形成支路,其中每个支路终止于用于每个反应仓室的样品出口中。此外,每个反应仓室包含并相应地连接到流体开口A(7),由此允许样品流入到相应的反应仓室中并允许空气逸出。将反应仓室38连接到流体通路A(9),以便引导从反应仓室逸出的空气通过相应的流体开口A到达流体出口A,并在那里离开盒。如图13b)中所示,所有反应仓室的流体开口A(7)包含膜40,以便允许空气逸出反应仓室并控制反应仓室的填充。在这里,使用贯穿所有流体开口A(7)的一个膜40。反应仓室38含有干组合物,所述干组合物包含用于执行扩增反应的试剂例如引物、探针、酶、dNTP和缓冲剂。
正如在图14中所示,可以将样品容器39组装到盒体33。样品容器39具有样品容器开口,所述开口被安排成使得样品容器开口与在这里包含管30的样品摄入口4流体连通。样品容器39具有内螺纹,并被拧在样品容器连接突起物10的外螺纹15上。样品容器39含有待分析的样品。正如上面讨论的,在优选实施方式中,将样品与如上所述的裂解溶液混合。裂解溶液优选地包含用于澄清裂解物的固相支持物。优选地使用羧基化珠子。由此将样品预处理并制备以用于分析。澄清的样品随后可以通过样品摄入口4进入样品通路6。然而,与裂解溶液混合的样品通过样品摄入口4进入样品通路6,并且相应地发生的裂解,在干试剂重构之后例如在PCR反应中进行的加热步骤期间,在盒中、例如在反应仓室38内完成的情况,也在本发明的范围之内。
图15示出了盒的其他实施方式。类似的元件被指派有相同的参考数字,只是与图12至14中示出的实施方式中相当的元件相比增加了100的值。图15中示出的实施方式显示,可以在流体通路B(103)的整个长度上提供膜150。图15还显示,可以在流体通路A(109)的整个长度上提供膜151。图15还显示,可以将盖子152附连于盒体133以紧密密封所有的流体通路。盖子152附连于盒体133的方式,使得盖子152封闭至少部分地形成流体通路B(103)的第一通道、至少部分地形成样品通路106的第二通道以及至少部分地形成流体通路A(109)的空腔。盖子优选为塑料箔片。在这种实施方式中,只提供了两个反应仓室。
图16是如图15中所示的盒的顶视图。相同的元件用相同的编号标出。此外,在沿着盒视图中标出的线切开的侧视图中,示出了在盒下方,在检测区域中的处理盒与处理装置之间的连接。检测器被置于反应仓室底下,因此能够例如捕获荧光信号。
图17a)示出了反应仓室38(a)至38(d),它们被提供为分开的元件并可以安装到盒体的相应连接突起物,由此提供处理盒。正如可以看到的,4个反应仓室38(a)至38(d)被提供为一个器件,这简化了操作,尤其是向盒的组装。为此目的,将反应仓室38(a)至38(d)通过联结桥153相连。在图17b)中示出了沿着线A-A的侧视图。提供更多反应仓室,也在本发明的范围之内。
图18是并入样品通路6和流体通路A(9)中的流体阻挡物154的详细视图。阻挡物被设计成与盖子152联合起到阀的作用的小壁,所述盖子在示出的实施方式中是塑料箔片。盖子152覆盖通道并附着于相应的壁。如果在盖子152上施加压力,则通道关闭,并且液体例如水或样品不能通过所述阻挡物154。一旦从盖子撤除压力,通路6和9的通道立即打开,并且液体,在这里是样品例如裂解的样品或包含与裂解缓冲液混合的样品的裂解混合物,可以流过所述阻挡物154。在可替选的设计中,相应的阻挡物154附连于盖子152,并通过向盖子施加压力而被插入到通道中。下方示出了带有组装的样品容器和反应仓室的盒体,其中突出了详细视图。
图19示出了本发明的系统。样品使用拭子41来收集,并将样品插入到包含裂解溶液的样品容器39中。在图20中也示出了使用不同设计的样品管进行的样品收集,所述样品管具有螺纹并包含磁性搅拌棒155。将样品容器39组装到包含组装好的反应仓室的盒体33,所述反应仓室包含用于执行分析方法的干试剂。然后使相应的组装好的盒进入到处理装置160中。
实施例
实施例1:血浆中大肠杆菌的裂解
材料
-血浆(EDTA稳定化的)
-大肠杆菌甘油储用物(滴度:3.04x108个细胞/ml;10μl=3x106个细胞)
-裂解缓冲液:0.1%PVP MW10.000;0.45%Tween-20;0.45%Nonidet P40;10mM TrisHCL pH8.0;1mM EDTA
-磁性粒子悬液:
a)MasG(MagAttract悬液G(QIAGEN–二氧化硅珠子))
b)MasB(MagAttract悬液B(QIAGEN–二氧化硅珠子))
c)羧基化磁性粒子(Seradyn)
流程
在1.5ml微量管中提供920μl裂解缓冲液。加入50μl血浆和20μl珠子悬液。在参比方法中加入20μl水。加入10μl细胞(未稀释的),并将混合物在Eppendorf热混合仪上以1400rpm在95℃温育5min。由此将细胞裂解。将混合物冷却至室温,并进行磁性分离(以沉降作为参比)。由于加入的磁性粒子,沉淀物吸附到粒子,并使用磁体将其收集到管的底部处。由此将裂解物澄清。将得到的上清液(澄清的裂解物)用于大肠杆菌定量PCR中(1μl和10μl)。
qPCR流程
所使用的条件概述在下表中:
循环参数:5min95℃;(10sec95℃)40x
结果
本实施例的结果示出在图1中。示出的是执行的PCR方法的Ct值。Ct值越高,为了达到某个阈值所需的PCR循环就越多。因此,高的Ct值表明样品中核酸的量低和/或存在PCR抑制剂。为了区分这些效应,将1μl和10μl澄清的裂解物平行地进行试验。由于使用10μl澄清的裂解物的PCR反应包含更多核酸,因此与使用1μl样品材料的PCR反应相比Ct值应该降低。如果尽管存在更多核酸经历PCR反应这一事实但没有看到相当大的降低,这表明PCR反应受到抑制。图1证实了在使用所有被测试的粒子时,用于澄清裂解物的磁性粒子的加入导致Ct值相当大地降低。这证实了本发明的用于澄清裂解物的方法,在移除扩增反应的抑制剂、特别是在裂解过程期间形成的沉淀物方面非常有效。使用羧基化磁性粒子时实现最好的结果,尽管基于二氧化硅的磁性粒子也显示出相当大的改进。使用羧基化珠子时,实现Ct值的几乎理想的降低。在按照参比方法(其中不加入磁性粒子来澄清裂解物)处理的样品中,尽管事实上加入了几乎多10倍的核酸,但Ct值仅仅降低约0.5Ct单位。这显示,由于在上清液中存在污染物,PCR受到相当大的抑制。因此,实施例1的结果证实,所有测试的磁性粒子都适用于从裂解物移除PCR抑制性沉淀物。这在打算在定量PCR中使用较大量裂解物时是特别重要的,因为更多的裂解物在扩增反应中引入更多抑制剂。正如在随后的实验中所示,当打算使用裂解物来重构干燥的PCR试剂时,通过裂解物澄清来有效移除抑制性污染物例如沉淀物是特别重要的。然而,对于复杂性较低的样品类型和/或其他分析方法来说,相应的裂解物澄清步骤尽管是有利的,但不是强制性的。
实施例2:血液中棒状杆菌(Corynebacterium)的裂解
材料
-血液(稳定化的)
-谷氨酸棒杆菌(Corynebacteria glutamicum)甘油储用物(滴度:1.3x108个细胞/ml;23μl=3x106个细胞)
-裂解缓冲液(参见实施例1)
-磁性粒子悬液:
a)Ademtech羧基珠子(Ademtech)
b)Magnosphere MK230/羧基(JSR Corp)
c)羧基化磁性粒子(Seradyn)
流程
在1.5μl微量管中提供952μl裂解缓冲液。加入50μl血液和20μl珠子悬液。相反,在参比方法中加入20μl水,在所述参比方法中不按照本发明的教示进行裂解物澄清。随后,加入23μl细胞(未稀释的),并将混合物在Eppendorf热混合仪上以1400rpm在95℃温育5min。将混合物冷却至室温。随后,通过本发明的用于澄清裂解物的方法中的磁性分离来澄清裂解物,对于参比方法来说通过沉降来进行。将上清液(在磁性分离的情况下是澄清的裂解物)用于谷氨酸棒杆菌定量PCR(1μl和10μl)。
qPCR流程
使用的PCR条件概述在下表中:
循环参数:5min95℃;(10sec95℃)40x
结果
结果示出在图2中。正如可以看到的,当加入磁性珠子时Ct值相当大地改进,正如可以从在使用10μl澄清的裂解物作为输入材料时观察到的Ct值的降低所推演的。这显示,所测试的珠子能够从裂解物成功地移除污染物例如尤其是沉淀物,由此获得相当大的裂解物澄清效果。因此,可以在扩增反应中使用更多裂解物。
图3显示,不论试验的是何种类型的磁性粒子,血液沉淀物都可以使用磁性珠子有效地移除。在左手一侧示出了裂解的样品,其中没有加入磁性粒子来澄清裂解物。正如可以看到的,在微量管的底部形成红色沉淀物。在右手一侧,示出了澄清的血液裂解物的上清液,其已经按照本发明的第三方面所教示的使用磁性粒子进行澄清。正如可以看到的,简单地加入磁性粒子能够有效移除血液沉淀物,由此澄清裂解物。
实施例3:阴道拭子的裂解和直接扩增
材料
-阴道拭子
-裂解缓冲液(参见实施例1)
-磁性粒子悬液:羧基化磁性粒子(Seradyn)
流程
将阴道拭子(宫颈内拭子,Copan)转移到1ml裂解缓冲液中。在1.5ml微量管中提供200μl阴道拭子样品。加入200μl裂解缓冲液,并加入或不加入50μl Seradyn珠子悬液上的Seradyn珠子沉积物。将混合物涡旋振荡20sec,并在Eppendorf热混合仪上以1400rpm在95℃温育5min。将混合物冷却至室温。磁性分离进行2min,并将参比(没有珠子)以最高速度离心1min。将10μl上清液用于人类H18S定量PCR。
qPCR流程
PCR条件如下:
循环参数:5min95℃;(10sec95℃)40x
结果
结果示出在图4中。在添加和不添加磁性粒子的情况下将7个不同的阴道拭子样品裂解,并将10μl相应的澄清和未澄清的裂解物直接用于定量PCR中。正如可以看到的,所述澄清的裂解物能够进行PCR反应。在所有情形中,按照本发明的教示进行澄清的裂解物的性能,与仅仅通过离心来沉降沉淀物的参比方法相比明显更好。
实施例4:使用阴道拭子的裂解和直接扩增
材料、流程和定量PCR流程
如实施例3中所述制备样品。然而,除了Seradyn珠子之外,还使用二氧化硅珠子(MagAttract悬液G和MagAttract悬液B(QIAGEN))来澄清裂解物。
结果
图5示出了结果。正如可以看到的,通过使用具有羧基化或二氧化硅表面的不同磁性粒子,可以从裂解物有效地清除沉淀物。
实施例5:使用阴道拭子的裂解和直接扩增
材料
-离子交换粒子(Duolite ES468和Amberlite XAD-7)和玻璃珠0.1mm
-裂解缓冲液(参见实施例1)
流程
将阴道拭子(宫颈内拭子,Copan)转移到1ml裂解缓冲液中。在1.5ml微量管中称量15mg粒子;在不加入用于裂解物澄清的粒子的情况下制备参比。加入200μl裂解缓冲液和200μl阴道拭子样品,并将混合物涡旋振荡20sec。将涡旋振荡的混合物在Eppendorf热混合仪上以1400rpm在95℃温育5min。将混合物冷却至室温并以最高速度离心1min。将上清液、即澄清的裂解物用于人类H18S qPCR。
qPCR流程
如实施例3中所述进行定量PCR。然而,还结合已经在冷冻干燥机中干燥的包括所使用的引物和探针的PCR主混合物,对所有裂解物进行试验。所述冷冻干燥的包括所使用的引物和探针的PCR主混合物,通过加入25μl未澄清的裂解物(参比)或25μl澄清的裂解物来重构。因此,PCR主混合物的重构通过加入澄清的裂解物来进行。
结果
结果示出在图6中,并证实了使用离子交换粒子来澄清裂解物,允许在向PCR加入1μl或10μl澄清的裂解物时成功地进行扩增。此外,结果还证实,可以使用澄清的裂解物以便重构干燥的PCR混合物。这与现有技术方法相比是相对大的简化,因为可以将澄清的裂解物直接用于重构,从而废除了使用例如水或重构缓冲液的分开的重构步骤。因此,正如也在本文中描述的,相应的方法特别适合于芯片实验室系统。正如在结果中所示,参比方法在向液体PCR主混合物加入1μl或10μl时允许进行PCR反应,但是在干燥的PCR混合物的重构中没有成功。在这里,只有当加入用于从裂解物移除沉淀物的磁性粒子时,PCR才可能成功。随后,方法是几乎同等有效的。这证实了本发明的裂解物澄清方法的优点,因为它有效地制备裂解物并使裂解物适用于重构干燥的PCR混合物。
实施例6:使用阴道拭子的裂解和直接扩增
材料
-沸石CAS:1318-02-1Fluka,96096
-裂解缓冲液(参见实施例1)
-羧基化磁性粒子悬液(Seradyn)
流程
将阴道拭子(宫颈内拭子,Copan)提供在1ml裂解缓冲液中。在1.5ml微量管中称量30mg沸石。在参比中未加入沸石。加入250μl裂解缓冲液和40μl Seradyn珠子悬液。在加入250μl阴道拭子样品后,将混合物涡旋振荡20sec,并在Eppendorf热混合仪上以1400rpm在95℃温育5min。将混合物冷却至室温。磁性分离进行2min,并将澄清的裂解物、即上清液用于人类H18S qPCR。将1μl、10μl裂解物用于正常的液体PCR反应,并使用25μl澄清的裂解物来进行使用干燥PCR试剂的PCR反应。在这里,将澄清的裂解物同时用于重构干燥的PCR试剂。
qPCR流程
如实施例3中所述进行PCR,然而,其中,在一个实例中将包括引物和探针的PCR混合物干燥,然后用25μl澄清的裂解物重构。
结果
用沸石作为固相粒子处理阴道拭子裂解物导致pH值升高。这种效果导致PCR性能显著提高超过10Ct值。因此,检测改善超过1000倍。
图7示出了按照实施例6使用和不使用沸石处理的阴道拭子样品,并且其中将不同体积的裂解物直接用于定量PCR反应中。使用25μl澄清的裂解物重构干燥的PCR试剂。在右手一侧,标出了样品的pH值。正如可以看到的,在裂解期间加入沸石导致裂解的样品的pH值升高,因此具有使PCR反应可以在最适条件下进行的效果。因此,沸石不仅由于移除包含在裂解的样品中的污染物例如沉淀物而对扩增反应具有有益效果,而且沸石还由于pH值升高而对pH值具有有益影响。实施例7:血液中大肠杆菌的裂解和直接扩增
材料
-人类血液
-大肠杆菌甘油储用物(滴度:9.2x109个细胞/ml;10μl(用PBS进行1:30稀释)=3x106个细胞)
-沸石CAS:1318-02-1Fluka,96096
-裂解缓冲液(参见实施例1)
流程
在1.5ml微量管中称量30mg沸石。参比不使用沸石来进行。向微量管加入985μl裂解缓冲液以及5μl血液和10μl细胞。将混合物在Eppendorf热混合仪中以1400rpm在95℃温育5min。将混合物冷却至室温。在短暂离心后,将上清液用于大肠杆菌qPCR。在这里,将1μl、10μl和25μl(用于干燥的PCR混合物的重构)用于随后的PCR中。qPCR流程
如实施例3中所述进行PCR。对于一个反应来说,将包括引物和探针的完整的PCR主混合物在冷冻干燥机中干燥。
结果
结果证实,沸石可以有效地用作固相粒子,以便从裂解物清除污染物例如沉淀物,并因此使裂解物直接适合于进行PCR反应。按照本发明的教示澄清的裂解物被用于进行PCR,并且也适用于重构干燥的PCR混合物。
实施例8:口腔拭子中大肠杆菌的裂解和直接扩增
材料
-人类血液
-大肠杆菌甘油储用物(滴度:9.2x109个细胞/ml;10μl(用PBS进行1:30稀释)=3x106个细胞)
-沸石CAS:1318-02-1Fluka,96096
-将口腔拭子(每个面颊一个拭子)转移到1.1ml裂解缓冲液中
-裂解缓冲液:(参见实施例1)
流程
在1.5ml微量管中称量30mg沸石。参比不使用沸石来制备。加入490μl口腔拭子样品以及5μl血液和10μl细胞。将混合物在Eppendorf热混合仪上以1400rpm在95℃温育5min。将混合物冷却至室温,并且在离心后,将上清液(澄清的连接物)用于大肠杆菌qPCR。在这里,在25μl反应中加入1μl、10μl。
qPCR流程
流程如实施例3中所述来进行。
结果
结果示出在图9中。正如可以看到的,用沸石处理口腔拭子裂解物以便澄清裂解物导致PCR性能的相当大的改进。平均来说,提前约2.6个循环达到Ct值。这对应于6倍的提高。
实施例9:掺杂到粪便拭子的大肠杆菌的裂解和直接
材料
-人类粪便样品
-如下所述获得粪便样品拭子:将拭子(puritan聚酯)用水润湿并除去过量的水。将拭子轻轻插入粪便样品中,并通过将拭子围绕其自身的轴转动来除去过量样品。然后将拭子加入到装有500μl裂解缓冲液的1.5ml微量管。通过在管的边缘处和液体中再次将拭子围绕其自身的轴转动,将粪便材料转移到裂解缓冲液中。
-大肠杆菌甘油储用物(滴度:9.2x109个细胞/ml;10μl(用PBS进行1:30稀释)=3x106个细胞)
-沸石CAS:1318-02-1Fluka,96096
-裂解缓冲液:(参见实施例1)
-羧基化磁性粒子悬液(Seradyn)
流程
在1.5ml微量管中称量30mg沸石。参比不加入沸石来进行。加入250μl粪便样品和50μl Seradyn珠子以及10μl大肠杆菌细胞。将混合物在Eppendorf热混合仪中以1400rpm在95℃温育5min并冷却至室温。磁性分离进行2min,并将上清液(澄清的裂解物)转移到新的管中。将上清液用于人类H18S和大肠杆菌qPCR(1μl和10μl)。
qPCR流程
如实施例3中所述进行定量PCR。
结果
结果示出在图10中。正如可以看到的,如本发明所教示的裂解物澄清甚至允许有效地澄清非常困难的材料例如粪便的裂解物,从而使澄清的裂解物适合直接用于扩增反应,而不需首先从样品纯化核酸。
实施例10:通过加入沸石提高阴道拭子样品的pH值
当进行酶促过程例如PCR时,强制要求为所使用的酶,例如在PCR的情况下taq DNA聚合酶,维持给定pH值。由于阴道拭子酸性非常高,因此可以用所述样品特别好地证实沸石的pH活性效果。阴道拭子样品具有约为4的pH值,其中约8-9的pH值是标准PCR反应所必需的。在实施例10中,分析了下列参数如何影响阴道拭子样品的pH值:A)加入基于沸石的分子筛(3埃孔径)和B)加入具有较高离子强度的裂解缓冲液。为了突出效果,使用了酸性特别高的阴道样品。
在变化形式A)中,向60μl裂解缓冲液中的阴道拭子样品(参见实施例9)加入60μl裂解缓冲液(参见实施例9,其中另外加入100mMTris/HCl pH8.5)。向pH试纸加入15μl得到的混合物,以测定裂解物的pH值。
在变化形式B)中,向60μl裂解缓冲液中的阴道拭子样品(参见实施例9)加入60μl裂解缓冲液(参见实施例9,其中另外加入33mMTris/HCl pH8.5和采取粒子(3埃孔径)形式的中尺寸分子筛)。向pH试纸加入15μl得到的混合物以测定pH值。结果示出在下表中:
拭子的pH值 | 变化形式A后的pH值 | 变化形式B后的pH值 |
3.8 | 6.0 | 8–8.5 |
3.9 | 6.0 | 8.0 |
4.0 | 7.5 | 8–8.5 |
4.0 | 7–7.5 | 8.0 |
4.1 | 8.0 | 8–8.5 |
4.1 | 7.5–8 | 8–8.5 |
4.1 | 7.5 | 8–8.5 |
正如可以看到的,加入较低缓冲液强度与沸石(分子筛)的组合,与加入较强缓冲液相比,明显更好地将pH值升高到8-8.5的必需pH值。结果更加均匀并因此可靠。因此,可以使用沸石可靠地将具有低于4.5的pH值的酸性样品的pH值升高到适合于进行扩增反应的8至8.5范围内的pH值。
实施例11:通过加入羧基化磁性粒子进行的裂解物澄清
阴道拭子包含大量肉眼可见的粒子,例如松散的细胞层和含有糖蛋白的粘渣。正如由下面的实验所示,当使用羧基化磁性粒子时,可以非常好地分离所述颗粒污染物。将50μl裂解缓冲液中的阴道拭子样品(参见实施例1)用含有2.5mg羧基化磁性粒子(Seradyn)的50μl裂解缓冲液稀释。将样品混合并在95℃温育5min。然后,将样品在室温冷却2min并磁性分离1min,以便移除沉淀物。使用移液器将得到的上清液(澄清的裂解物)转移到新的反应容器中。正如在图11中所示,向裂解的样品加入羧基化磁性粒子,引起肉眼可见的沉淀物的出色移除。
实施例12:使用不同方法进行的干PCR试剂的重构和本发明的裂解程序
材料
-鼻咽拭子
-谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)细胞的悬液
-裂解缓冲液(参见实施例1)
-磁性粒子:羧基化磁性粒子(Seradyn)
流程
将每个拭子样品转移到500μl裂解缓冲液中。将从三位供体获得的三个拭子样品合并。将1000μl包含样品的相应合并物与裂解缓冲液、66μl预先分离的SeraMag珠子和10μl谷氨酸棒杆菌悬液混合。对于处理来说,使用三种不同方法:
方法1:将冷冻干燥的包含引物和探针的PCR主混合物用25μl裂解混合物重构,其中裂解混合物包含样品、裂解缓冲液和磁性珠子。然而,没有采取特别措施来促进样品裂解。因此,使用包含在裂解缓冲液中的样品来进行冷冻干燥的主混合物的重构。因此,重构发生时裂解混合物包含样品,然而所述样品尚未(完全)裂解。重构的PCR组合物包含裂解缓冲液以及样品。制备10个分别地重构的组合物并将其合并。将25μl等分试样转移到标准PCR条板中,合在一起共10个样品。向每个反应加入1.25μl谷氨酸棒杆菌悬液。由于在所使用的条件下样品的裂解不完全,因此将已经包含重构的PCR混合物的相应混合物在95℃温育5分钟以促进裂解,然后冷却到室温1分钟,以便增加构成可能抑制PCR反应的污染物的沉淀物的形成。将磁性珠子收集/分离1分钟。由此使沉淀物结合于珠子并使裂解物澄清。将20μl澄清的反应液转移到新的PCR管中。然后在下列条件下进行PCR反应:95℃10秒,60℃30秒,40个循环。平行地处理10个样品。因此,在PCR主混合物重构之后进行加热步骤,用于促进样品的变性和因此裂解。这允许节省处理步骤,因为在PCR期间不再需要初始的加热步骤。
方法2:将10份冷冻干燥的包含引物和探针的quantifast PCR主混合物用25μl裂解混合物重构,所述裂解混合物包含样品、裂解缓冲液和磁性珠子。因此,重构同样地使用裂解混合物来进行,在所述裂解混合物中样品刚刚与裂解缓冲液相接触,然而尚未通过加热来促进裂解。将分别重构的PCR混合物合并,并将20μl转移到PCR反应管中(平行地处理10个样品)。加入1μl谷氨酸棒杆菌悬液。随后,使用下列条件直接进行PCR反应:95℃5分钟,95℃10秒,60℃30秒,将后两个步骤重复40个循环。该流程非常快速,因为在这里,裂解在真实PCR期间来促进并实现。
方法3:将25ml转移到PCR条板的10个反应管。加入1.25ml谷氨酸棒杆菌悬液,并将混合物在95℃温育以促进样品的裂解。将反应冷却1分钟至室温,并对珠子进行1分钟的分离。将25ml上清液(澄清的裂解物)转移到包含冷冻干燥的PCR主混合物的PCR条板中,用于重构(10个样品)。将25ml相应的重构的组合物转移到管中,并如本实施例的方法2中所述在PCR中进行处理。
图21示出了结果。正如可以看到的,所有三种方法提供可比的结果,并证实也可以通过在分析步骤中,例如在PCR反应期间一起执行裂解步骤,使用本发明方法的快捷方式。由此,可以节省相当多的时间。
因此,本发明方法的所有可替选方案都可以使用。
Claims (15)
1.一种适用于分析包含生物分子的样品的处理盒,其中所述处理盒包含盒体(33)和包括含有用于执行分析方法的试剂的干组合物的至少一个反应仓室(38),其中所述盒体(33)包含样品摄入口(4)、至少一个样品出口(5)和连接所述样品摄入口(4)和所述样品出口(5)的流体通路(6),其中所述样品出口(5)通入所述反应仓室(38),其中所述盒被设计成使得包含在所述反应仓室(38)中的所述干组合物的重构,通过经所述样品摄入口(4)进入所述盒的样品来实现,
其中所述反应仓室(38)和/或用于将所述反应仓室连接到所述盒体的机构包含至少一个流体开口A(7),气体可以通过所述至少一个流体开口A(7)离开所述反应仓室(38),并且其中气体可以通过其离开所述反应仓室(38)的流体开口A(7)包含阻挡物(40),其中所述阻挡物(40)基本上阻止液体的通过,并且其中所述阻挡物(40)具有一个或多个下列特点:
a)所述阻挡物至少在所述阻挡物与液体发生接触之前允许空气通过,但是其中所述阻挡物基本上阻止液体的通过;
b)所述阻挡物是膜或滤器;
c)所述阻挡物是疏水的;和/或
d)所述阻挡物是有孔的。
2.权利要求1的处理盒,其具有一个或多个下列特点:
a)所述流体通路(6)包含通道和/或空腔中的至少一种,并且至少部分地形成在所述盒体(33)的表面中;
b)所述盒体(33)包含在所述样品经所述样品摄入口(4)进入后用于预定样品通路的通道和/或空腔系统;
c)所述盒包含至少两个反应仓室(38),并且其中用于所述样品的流体通路(6)分支并终止于至少两个样品出口(5),其中每个样品出口(5)通入不同的反应仓室(38);
d)所述一个或多个反应仓室(38)整体包含在所述盒体(33)中;
e)所述一个或多个反应仓室(38)作为组装到所述盒体(33)的分开的装置提供;
f)所述盒体(33)包含反应仓室连接突起物(20)作为用于将至少一个反应仓室(38)连接到所述盒体(33)的机构;
g)所述盒体(33)包含多个反应仓室(38)和/或多个反应仓室连接突起物(20)作为用于连接所述反应仓室的机构;
h)所述盒体(33)包含样品容器连接突起物(10)作为用于将样品容器(39)连接到所述盒体(33)的机构;
i)所述盒体(33)包含流体摄入口B(1),其在所述容器(39)组装到所述盒体(33)时通过流体通路B(3)与所述样品容器(39)流体连通,并且其中空气经所述流体出口B(2)被导入到所述样品容器(39)中;和/或
j)所述盒体(33)包含管(30),其在所述容器(39)组装到所述盒体(33)时位于所述样品容器(39)内,并且其中所述样品经所述管(30)到达所述样品摄入口(4)。
3.权利要求1或2的处理盒,其中提供了用于控制能够进入所述反应仓室(38)用于所述干组合物的重构的液体的量的机构。
4.权利要求1或2的处理盒,其中
-所述样品出口(5)和/或所述流体开口A(7)被设计成管,其至少部分地包含在反应仓室(38)的侧壁中和/或用于将所述反应仓室连接到所述盒的机构的侧壁中,
和/或
-所述盒体(33)包含由流体通路A(9)连接到所述流体开口A(7)的流体出口A(8)。
5.权利要求1或2的处理盒,其特征在于允许关闭所述样品通路(6)和/或所述流体通路A(9)的机构。
6.权利要求5的处理盒,其中在所述样品通路(6)和/或所述流体通路A(9)内提供至少一个阻挡物(54,154),其与覆盖所述流体通路(6,9)的盖子(152)一起,允许在向所述盖子(152)施加压力时封闭所述样品通路(6)和/或所述流体通路A(9)。
7.权利要求1或2的处理盒,其中将所述盒体(33)组装到包含样品容器开口的样品容器(39),其排列方式使得所述样品容器开口与所述样品摄入口(4)流体连通。
8.权利要求7的处理盒,其特征在于所述样品容器(39)含有与裂解组合物混合的待分析样品,并且其中所述裂解组合物具有一个或多个下列特点:
a)它是包含下列组分的裂解溶液
(a)至少一种非离子型表面活性剂或非离子型去污剂的混合物,
(b)至少一种聚合物,其通过潜在抑制剂的非特异性络合来阻止或减少后续分析方法的抑制;
(c)任选地,蛋白消化酶,
(d)任选地,用于二价阳离子的螯合剂,以及
(e)任选地,缓冲物质;
b)它包含磁性搅拌棒;和/或
c)它包含用于澄清所述裂解物的固相支持物,
其中所述固相支持物具有一个或多个下述特征:
a)所述固相支持物选自粒子、板和其他颗粒物质;
b)所述固相支持物包含将源自于裂解的样品的污染物结合于所述固相支持物的表面;
c)所述固相支持物包含金属氧化物;
d)所述固相支持物包含二氧化硅表面;
e)所述固相支持物在其表面上包含促进污染物与所述固相支持物的结合的一种或多种配体,其中所述配体选自离子交换基团、羧基、磺酸基和硅烷配体;
f)所述固相支持物在其表面上包含羧基;
g)所述固相支持物包含或者是分子筛;
h)所述固相支持物在所述裂解的样品和/或所述重构的组合物中的掺入,导致所述裂解的样品和/或所述重构的组合物的pH值升高;
i)所述固相支持物是磁性的;和/或
j)所述固相支持物包含在裂解溶液中。
9.一种盒体,其适合于提供从含有流体并可以组装到所述盒体(33)的样品容器(39)到可以组装到所述盒体(33)或被提供为所述盒体(33)的有机组成部分的至少一个反应仓室(38)的流体连接,所述盒体包含:
-样品摄入口(4)和样品出口(5),
-连接所述样品摄入口(4)与所述样品出口(5)的样品通路(6),
-用于连接所述样品容器(39)的样品容器连接突起物(10),其中在将所述样品容器(39)组装到所述连接突起物(10)之后,所述样品摄入口(4)与所述样品容器(39)流体连通,
-用于连接反应仓室(38)的至少一个反应仓室连接突起物(20),其中在将所述反应仓室(38)组装到所述反应仓室连接突起物(20)之后,所述样品出口(5)与所述反应仓室(38)流体连通,和/或包含被提供为所述盒体(33)的有机组成部分的至少一个反应仓室(38),
其中在所述反应仓室连接突起物(20)中和/或在所述反应仓室(38)中提供有至少一个流体开口A(7),并且其中所述流体开口A(7)包含阻挡物(40),其中所述阻挡物至少在所述阻挡物与液体发生接触之前允许空气通过,但是其中所述阻挡物基本上阻止液体的通过。
10.权利要求9的盒体,其中所述阻挡物(40)具有一个或多个下列特点:
a)所述阻挡物是膜或滤器;
b)所述阻挡物是疏水的;和/或
c)所述阻挡物是有孔的。
11.权利要求9或10的盒体,其具有一个或多个下列特点:
a)所述样品出口(5)和/或所述流体开口A(7)被设计成管,其中所述管至少部分地包含在反应仓室(38)的侧壁中和/或反应仓室连接突起物(20)的侧壁中,
b)所述盒体(33)包含流体出口A(8)和连接所述流体开口A(7)和所述流体出口A(8)的流体通路A(9);和/或
c)所述盒体的特征在于允许关闭所述样品通路(6)和/或所述流体通路A(9)的机构。
12.权利要求9或10的盒体,其包含
-流体摄入口B(1,101)和流体出口B(2,102),
-连接所述流体摄入口B(1,101)和所述流体出口B(2,102)的流体通路B(3,103),
其中在将所述样品容器(39)组装到所述样品容器连接突起物(10)之后,所述流体出口B(2)和所述样品摄入口(4)与所述样品容器(39)流体连通。
13.权利要求9或10的盒体,其具有一个或多个下列特点:
a)在所述样品通路(6)和/或所述流体通路A(9)内提供有至少一个阻挡物(54,154),其与覆盖所述流体通路的盖子(152)一起,在向所述盖子(152)施加压力时允许关闭所述样品通路(6)和/或所述流体通路A(9);
b)所述样品出口(5)和/或所述流体开口A(7)被设计成管,其中所述管至少部分地包含在反应仓室(38)的侧壁的凸面内和/或所述反应仓室连接突起物(20)的侧壁的凸面内;
c)所述样品容器连接突起物(10)包含侧壁(11)和底壁(13)并任选地包含与所述底壁(13)相对的开口(14),其中所述流体出口B(2)和所述样品摄入口(4)被安排在所述底壁(13)或至少一个所述侧壁(11)中;
d)所述反应仓室连接突起物(20)包含侧壁(21)和底壁(23),其中所述样品出口(5)和任选地所述流体开口A(7)被安排在所述底壁(23)或至少一个所述侧壁(21)中;
e)所述盒体(33)包含具有第一末端开口(31)和第二末端开口(32)的管(30),由此使所述第一末端开口(31)与所述样品摄入口(4)对齐,其中所述管(30)是刚性、纵向的管;
f)所述样品容器连接突起物(10)的所述侧壁(11)和/或所述反应仓室连接突起物(20)的所述侧壁(21)形成管状体;
g)所述样品容器连接突起物(10)的所述侧壁(11)适合于契合到所述样品容器的开口中,其中所述样品容器连接突起物(10)的所述侧壁(11)形成管状体并且所述管状体具有外螺纹(15),和/或所述反应仓室连接突起物(20)的所述侧壁(21)适合于契合到可以组装到所述反应仓室连接突起物(20)的反应仓室(38)的开口中;
h)所述样品通路(6,106)至少部分地由形成在所述盒体(33,133)的表面内的通道或空腔提供,和/或所述流体通路A(9,109)至少部分地由形成在所述盒体(33,133)的表面内的通道或空腔形成,和/或所述流体通路B(3,103)至少部分地由形成在所述盒体(33,133)的表面内的通道或空腔提供;
i)将盖子(152)附连到所述盒体(33,133),其中所述盖子封闭形成了所述样品通路(6,106)、所述流体通路A(9,109)和/或所述流体通路B(3,103)的至少一部分的所述通道或空腔,其中所述盖子是箔片;
j)所述样品通路(6,106)至少部分地由形成在所述盒体(33,133)的表面内的通道或空腔形成,并且所述流体通路A(9)至少部分地由形成在所述盒体(33,133)的表面内的通道或空腔形成,并且其中所述流体通路B(3,103)至少部分地由形成在所述盒体表面内的通道或空腔形成,由此将盖子(152)附连到所述盒体(33,133),以封闭所述所述通道或空腔;
k)所述流体摄入口B(1,101)、所述流体出口B(2,102)、所述样品摄入口(4,104)、所述样品出口(5,105)、所述流体开口A(7,107)和所述任选的流体出口A(8,108),被安排在所述盒体(33,133)的同一表面中;
l)所述流体开口A(7)、所述流体摄入口B(1)和/或所述任选的流体出口A(8)被选自膜或滤器的阻挡物(40)封闭;
m)所述盒体(33)包含用于将其他反应仓室(38)连接到所述盒体(33)的至少一个另外的反应仓室连接突起物(20),其中所述另外的反应仓室连接突起物(20)包含与前述权利要求项中描述的反应仓室连接突起物(20)相同的元件,并且其中所述另外的反应仓室连接突起物(20)的所述样品出口(5)与所述样品通路(6,106)流体连通;和/或
n)所述盒体包含与所述样品通路(6,106)流体连通的至少一个另外的反应仓室。
14.权利要求1或2的处理盒,其特征在于盒体(33)具有权利要求9至13任一项中定义的特点。
15.使用用于执行包含生物分子的样品的分析方法的系统来执行分析方法的操作方法,其中所述系统包含:
a)权利要求1至8和14的任一项的处理盒,其中所述处理盒包含至少一个反应仓室(38),其包含含有用于所述分析方法的试剂的干组合物;
b)用于接收包含生物分子的样品的样品容器(39),其中所述容器(39)可以组装到所述处理盒;
c)处理装置,其用于接受包含被组装的所述容器的所述处理盒,并用于与所述处理盒一起执行所述分析方法;
并且其中所述方法包括:
a)将包含样品的样品容器连接到权利要求1至8和14的任一项的处理盒;
b)将所述处理盒插入到处理装置中;以及
c)开始全自动测定。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161545983P | 2011-10-11 | 2011-10-11 | |
US61/545,983 | 2011-10-11 | ||
EP11008214 | 2011-10-11 | ||
EP11008214.6 | 2011-10-11 | ||
PCT/EP2012/070211 WO2013053855A1 (en) | 2011-10-11 | 2012-10-11 | Sample processing method and sample processing cartridge |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104066849A CN104066849A (zh) | 2014-09-24 |
CN104066849B true CN104066849B (zh) | 2017-04-19 |
Family
ID=48081401
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280050079.8A Active CN104066849B (zh) | 2011-10-11 | 2012-10-11 | 样品处理方法和样品处理盒 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9994891B2 (zh) |
EP (2) | EP2766493B1 (zh) |
JP (1) | JP6262657B2 (zh) |
CN (1) | CN104066849B (zh) |
WO (1) | WO2013053855A1 (zh) |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10201606120XA (en) | 2007-10-02 | 2016-09-29 | Theranos Inc | Modular Point-Of-Care Devices And Uses Thereof |
CN106248582B (zh) | 2011-01-21 | 2020-10-20 | 拉布拉多诊断有限责任公司 | 样品使用最大化的系统和方法 |
US8840838B2 (en) | 2011-09-25 | 2014-09-23 | Theranos, Inc. | Centrifuge configurations |
US20140170735A1 (en) | 2011-09-25 | 2014-06-19 | Elizabeth A. Holmes | Systems and methods for multi-analysis |
US8475739B2 (en) | 2011-09-25 | 2013-07-02 | Theranos, Inc. | Systems and methods for fluid handling |
US9664702B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-05-30 | Theranos, Inc. | Fluid handling apparatus and configurations |
US9632102B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-04-25 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-purpose analysis |
US9268915B2 (en) | 2011-09-25 | 2016-02-23 | Theranos, Inc. | Systems and methods for diagnosis or treatment |
US9619627B2 (en) | 2011-09-25 | 2017-04-11 | Theranos, Inc. | Systems and methods for collecting and transmitting assay results |
US9810704B2 (en) | 2013-02-18 | 2017-11-07 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
US9250229B2 (en) | 2011-09-25 | 2016-02-02 | Theranos, Inc. | Systems and methods for multi-analysis |
US10012664B2 (en) | 2011-09-25 | 2018-07-03 | Theranos Ip Company, Llc | Systems and methods for fluid and component handling |
CA2849354C (en) | 2011-09-26 | 2021-11-09 | Preanalytix Gmbh | Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids |
US11021733B2 (en) | 2011-09-26 | 2021-06-01 | Qiagen Gmbh | Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids |
US10724074B2 (en) | 2012-09-25 | 2020-07-28 | Qiagen Gmbh | Stabilisation of biological samples |
CN105164258B (zh) | 2013-03-18 | 2021-05-18 | 凯杰有限公司 | 细胞外核酸的稳定化和分离 |
EP3447141B1 (en) | 2013-03-18 | 2020-08-05 | PreAnalytiX GmbH | Stabilisation of biological samples |
WO2015035256A2 (en) | 2013-09-06 | 2015-03-12 | Theranos, Inc. | Devices, systems, methods and kits for receiving a swab |
CN111378568A (zh) | 2013-09-06 | 2020-07-07 | 赛拉诺斯知识产权有限责任公司 | 用于检测感染性疾病的系统和方法 |
JP2015159733A (ja) * | 2014-02-26 | 2015-09-07 | セイコーエプソン株式会社 | 物質結合用固相担体の凍結乾燥体、物質含有液中の物質を物質結合用固相担体と結合させるための容器、および、物質結合用固相担体を含む凍結乾燥体の製造方法 |
CN107532197B (zh) * | 2015-05-08 | 2021-04-30 | 株式会社钟化 | 干燥形态的酶反应试剂及其制备方法 |
EP3135769A1 (en) * | 2015-08-26 | 2017-03-01 | Qiagen GmbH | Kits and methods for extracting rna |
US10953376B2 (en) * | 2015-09-03 | 2021-03-23 | Tetracore, Inc. | Device and method for mixing and bubble removal |
EP3377645B1 (en) | 2015-11-20 | 2023-10-04 | Qiagen GmbH | Method of preparing sterilized compositions for stabilization of extracellular nucleic acids |
PL235210B1 (pl) * | 2016-12-21 | 2020-06-15 | Genomtec Spolka Akcyjna | Sposób detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej oraz urządzenie do jego realizacji |
KR101951405B1 (ko) * | 2017-06-28 | 2019-05-08 | 주식회사 파나진 | 시료 시약 반응 분석용 키트, 이를 이용한 표적 핵산 검출 장치 및 방법 |
FI128087B (en) | 2017-06-30 | 2019-09-13 | Teknologian Tutkimuskeskus Vtt Oy | Microfluidic chip and a method of making a microfluidic chip |
CN107523487B (zh) * | 2017-09-18 | 2024-03-19 | 星源智(珠海)生物科技有限公司 | 一种集成化管状反应装置 |
US11278897B2 (en) | 2017-12-28 | 2022-03-22 | Stmicroelectronics S.R.L. | Cartridge for sample preparation and molecule analysis, cartridge control machine, sample preparation system and method using the cartridge |
US11110457B2 (en) | 2017-12-28 | 2021-09-07 | Stmicroelectronics S.R.L. | Analysis unit for a transportable microfluidic device, in particular for sample preparation and molecule analysis |
US11491489B2 (en) | 2017-12-28 | 2022-11-08 | Stmicroelectronics S.R.L. | Microfluidic connector group, microfluidic device and manufacturing process thereof, in particular for a cartridge for sample preparation and molecule analysis |
US11717825B2 (en) | 2017-12-28 | 2023-08-08 | Stmicroelectronics S.R.L. | Magnetically controllable valve and portable microfluidic device having a magnetically controllable valve, in particular cartridge for sample preparation and molecule analysis |
US11511278B2 (en) | 2017-12-28 | 2022-11-29 | Stmicroelectronics S.R.L. | Solid reagent containment unit, in particular for a portable microfluidic device for sample preparation and molecule analysis |
WO2021046504A1 (en) * | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Teleflex Medical Incorporated | Infection detection systems and methods including a sample processor having integrated sample filter and meter |
WO2021046506A1 (en) * | 2019-09-06 | 2021-03-11 | Teleflex Medical Incorporated | Infection detection systems and methods including intermediate filtering and metering |
JP7290345B2 (ja) * | 2020-02-25 | 2023-06-13 | Blue Industries株式会社 | 遺伝子解析用前処理キット、核酸分析用チップ、解析システム、生体物質分析用チップ |
JPWO2022044973A1 (zh) * | 2020-08-31 | 2022-03-03 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001092569A2 (en) * | 2000-05-31 | 2001-12-06 | Tepnel Medical Limited | Formulation for polymerase chain reaction and vessel containing same |
WO2004036184A2 (en) * | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Applera Corporation | Method for drying dye-terminator sequencing reagents |
WO2006042734A1 (de) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren zur durchführung einer elektrochemischen messung an einer flüssigen messprobe in einer über leitungen zugänglichen messkammer und zugehörige anordnung |
WO2006071770A2 (en) * | 2004-12-23 | 2006-07-06 | I-Stat Corporation | Molecular diagnostics system and methods |
EP1865074A2 (en) * | 1997-12-22 | 2007-12-12 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates |
WO2009057931A2 (en) * | 2007-10-29 | 2009-05-07 | Bioneer Corporation | Dried composition for hot-start pcr with long-term stability |
WO2010001162A1 (en) * | 2008-07-02 | 2010-01-07 | Enigma Diagnostics Ltd | Freeze-dried compositions for biochemical reactions |
WO2010003493A1 (de) * | 2008-07-10 | 2010-01-14 | Qiagen Gmbh | Schnelles analyseverfahren biologischer mischproben |
EP2202302A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-30 | Roche Diagnostics GmbH | Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4902103B2 (ja) * | 2002-04-11 | 2012-03-21 | メディミューン・エルエルシー | 凍結乾燥フォームによる生物活性材料の保存 |
KR100601972B1 (ko) * | 2004-11-03 | 2006-07-18 | 삼성전자주식회사 | 레이저와 비드를 이용한 상 분리에 의한 핵산의 정제 장치및 방법 |
US20070065841A1 (en) * | 2005-04-16 | 2007-03-22 | Dunbar John M | Methods and compositions for the removal of nucleic acid amplification inhibitors |
DE102006056790B3 (de) | 2006-12-01 | 2008-01-17 | IfP Privates Institut für Produktqualität GmbH | Laboreinmalartikel für Analyse und Diagnosik |
EP1935496A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-06-25 | Eppendorf Array Technologies SA | Device and/or method for the detection of amplified nucleotides sequences on micro-arrays |
JP2008175608A (ja) | 2007-01-17 | 2008-07-31 | Yokogawa Electric Corp | 化学反応用カートリッジ及びその使用方法 |
DE102007045474A1 (de) | 2007-09-21 | 2009-04-02 | Qiagen Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zum Behandeln von Flüssigkeiten mit magnetischen Partikeln |
JP5463492B2 (ja) * | 2008-10-08 | 2014-04-09 | 島根県 | 微生物細胞からのプラスミドdna抽出法 |
EP2248915B1 (en) * | 2009-05-05 | 2013-09-18 | Qiagen GmbH | Detection of multiple nucleic acid sequences in a reaction cartridge |
CA2768794C (en) * | 2009-07-22 | 2018-09-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Sequences and their use for detection and characterization of e. coli o157:h7 |
-
2012
- 2012-10-11 EP EP12770149.8A patent/EP2766493B1/en active Active
- 2012-10-11 EP EP19216936.5A patent/EP3663408B1/en active Active
- 2012-10-11 WO PCT/EP2012/070211 patent/WO2013053855A1/en active Application Filing
- 2012-10-11 US US14/350,095 patent/US9994891B2/en active Active
- 2012-10-11 CN CN201280050079.8A patent/CN104066849B/zh active Active
- 2012-10-11 JP JP2014535084A patent/JP6262657B2/ja active Active
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1865074A2 (en) * | 1997-12-22 | 2007-12-12 | Hitachi Chemical Co., Ltd. | Direct RT-PCR on oligonucleotide-immobilized PCR microplates |
WO2001092569A2 (en) * | 2000-05-31 | 2001-12-06 | Tepnel Medical Limited | Formulation for polymerase chain reaction and vessel containing same |
WO2004036184A2 (en) * | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Applera Corporation | Method for drying dye-terminator sequencing reagents |
WO2006042734A1 (de) * | 2004-10-15 | 2006-04-27 | Siemens Aktiengesellschaft | Verfahren zur durchführung einer elektrochemischen messung an einer flüssigen messprobe in einer über leitungen zugänglichen messkammer und zugehörige anordnung |
WO2006071770A2 (en) * | 2004-12-23 | 2006-07-06 | I-Stat Corporation | Molecular diagnostics system and methods |
WO2009057931A2 (en) * | 2007-10-29 | 2009-05-07 | Bioneer Corporation | Dried composition for hot-start pcr with long-term stability |
WO2010001162A1 (en) * | 2008-07-02 | 2010-01-07 | Enigma Diagnostics Ltd | Freeze-dried compositions for biochemical reactions |
WO2010003493A1 (de) * | 2008-07-10 | 2010-01-14 | Qiagen Gmbh | Schnelles analyseverfahren biologischer mischproben |
EP2202302A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-30 | Roche Diagnostics GmbH | Dry composition of reaction compounds with stabilized polymerase |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2014533934A (ja) | 2014-12-18 |
EP3663408B1 (en) | 2024-05-01 |
US20140287955A1 (en) | 2014-09-25 |
EP2766493B1 (en) | 2019-12-18 |
CN104066849A (zh) | 2014-09-24 |
US9994891B2 (en) | 2018-06-12 |
EP3663408A1 (en) | 2020-06-10 |
EP2766493A1 (en) | 2014-08-20 |
JP6262657B2 (ja) | 2018-01-17 |
WO2013053855A1 (en) | 2013-04-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104066849B (zh) | 样品处理方法和样品处理盒 | |
US11016086B2 (en) | Sample entry | |
US8828716B2 (en) | Disposable and removable nucleic acid extraction and purification cartridges for automated flow-through systems | |
JP6737744B2 (ja) | サンプル収集のためのデバイス、溶液及び方法 | |
JP5782384B2 (ja) | 未処理試料から核酸を単離するための自己完結型装置および精製方法 | |
RU2654666C2 (ru) | Система и способ сбора образца нуклеиновой кислоты | |
ES2741749T3 (es) | Método y materiales para el aislamiento de materiales de ácido nucleico | |
US8313652B2 (en) | Method and device employing centrifugal force | |
TWI624294B (zh) | 用於樣本處理之方法及裝置 | |
JP7250757B2 (ja) | 逐次的ラテラルフローデバイス | |
US20020182718A1 (en) | Method and device for the handling of samples and reagents | |
AU778440B2 (en) | Sample processing device | |
KR101967236B1 (ko) | 핵산 추출용 전처리 챔버, 그를 이용한 카트리지 및 핵산 추출 방법 | |
WO2008055257A2 (en) | Cartridge for conducting diagnostic assays | |
EP2846910A1 (en) | Device for isolating an analyte from a sample, and methods of use | |
CN106232799A (zh) | 用于净化生物分子的方法和装置 | |
CN103827301A (zh) | 从兽医学全血样品中分离核酸的方法 | |
US20230356213A1 (en) | Analyte inspection apparatus and analyte inspection method using same | |
WO2018148271A1 (en) | Microdevice for differential separation, purification and amplification of forensic samples | |
JP2020511134A (ja) | ろ過デバイス、捕捉デバイス、及びそれらの使用 | |
ES2773261T3 (es) | Método de procesamiento de muestras y cartucho de procesamiento de muestras | |
WO2022148880A1 (en) | Microfluidic circuit, microfluidic chip, kit and method for isolating and purifying an analyte from a biologic sample |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |