KR101951405B1

KR101951405B1 - 시료 시약 반응 분석용 키트, 이를 이용한 표적 핵산 검출 장치 및 방법

Info

Publication number: KR101951405B1
Application number: KR1020170081778A
Authority: KR
Inventors: 박승교; 이영; 최신영
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2019-05-08
Also published as: KR20190001745A

Abstract

본 발명은 시료 및 시약을 각각 독립적인 웰에 담은 상태로 필요시 시료에 대한 전처리 과정을 수행하기에 간편하고, 역류 방지에 의해서 전처리 과정을 안정적으로 수행할 수 있으며, 시약을 시료에 투입한 후 반응을 분석하기에도 용이한 시료 시약 반응 분석용 키트와, 이를 이용하여 표적 핵산을 안정적으로 PCR 증폭한 후 정확하게 검출할 수 있게 한 표적 핵산 검출 장치 및 방법에 관한 것으로서, 이를 위한 키트는 시료를 담아둘 제1 웰(111), 시약을 담아둘 제2 웰(112), 및 제2 웰(112)의 시약이 넘쳐 제1 웰(111)로 투입되게 할 유로(113)를 조성한 유동 칩(110); 시약 및 시료가 새지 아니하도록 유동 칩(11)을 덮어 실링하며, 제2 웰(112)을 덮는 부위에 조성되어 눌림에 의해 제2 웰(112)에 담겨 시약을 제1 웰(111)로 투입되게 할 담금 부재(122) 및 제1 웰(111)을 덮는 부위에 조성한 투광창(121)을 구비한 커버(120);를 포함하여 구성된다.
본 발명과 관련된 연구는 산업통상자원부 핵심소재원천기술개발사업(펨토몰 수준의 암유전자 진단을 위한 PNA-나노하이브리드 융합소재 및 분자진단시스템 개발, 과제번호:10047831)의 지원을 받아 수행하였다.
또한, 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 실제 임상샘플에 적용한 검증 실험은 인천성모병원 인체유래물질 자원은행에서 임상 검체를 제공받아 수행하였다.

Description

시료 시약 반응 분석용 키트, 이를 이용한 표적 핵산 검출 장치 및 방법{KIT FOR SPECIMEN-REAGENT RESPONSE ANALYSIS, TARGET NUCLEIC ACIDS DETECTION APPARATUS AND METHOD USING THE SAME}

본 발명은 시료 및 시약을 각각 독립적인 웰에 담은 상태로 필요시 시료에 대한 전처리 과정을 수행하기에 간편하고, 역류 방지에 의해서 전처리 과정을 안정적으로 수행할 수 있으며, 시약을 시료에 투입한 후 반응을 분석하기에도 용이한 시료 시약 반응 분석용 키트와, 이를 이용하여 표적 핵산을 안정적으로 PCR 증폭한 후 정확하게 검출할 수 있게 한 표적 핵산 검출 장치 및 방법에 관한 것이다.

본 발명과 관련된 연구는 산업통상자원부 핵심소재원천기술개발사업(펨토몰 수준의 암유전자 진단을 위한 PNA-나노하이브리드 융합소재 및 분자진단시스템 개발, 과제번호:10047831)의 지원을 받아 수행하였다. 또한, 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 실제 임상샘플에 적용한 검증 실험은 인천성모병원 인체유래물질 자원은행에서 임상 검체를 제공받아 수행하였다.

특정 유전자의 존재 또는 돌연변이 발생 여부와 질병 사이의 관계가 지속적으로 밝혀짐에 따라 전통적으로 질병의 증상이 있는 환자에 대해서 유전 질환을 확진하거나 감별하기 위해서 수행하던 유전자 검사가 질병의 예방, 조기 진단, 치료 및 관리를 통해 질환의 이환율과 사망률을 감소시키기 위한 목적으로 확장되고 있다.

특히, 종양 유전자(Oncogenes) 변이(mutations), 종양 억제 유전자(tumorsuppressor genes) 변이, 탈조절(deregulations)과 염색체 이상(chromosomal abnormalities) 등의 유전자 이상이 암의 발병과 약물의 예후 판단에 관여한다는 사실이 밝혀지면서 다양한 연구가 보고되고 있다(Fearson ER et al., Cell., 1990; K.W Kinzler et al., Cell., 1996; Manuel Serrano et al., Cell., 1997; Amado RG et al., J. Clin. Oncol., 2008, Raponi M et al., Curr. Opin. Pharmacol., 2008; Siena S et al., J. Natl. Cancer Inst., 2009). 이에 따르면, 암에 특이적인 유전자를 분석함으로써, 암의 발병 여부를 간접적으로 확인할 수도 있다.

이와 같이 질환 관련 유전자, 특히 암 관련 유전자의 돌연변이 발생 여부가 암의 조기진단, 발병 여부 판단, 예후 판단은 물론 치료제의 선택 및 변경에까지 영향을 미치기 때문에 이를 정확히 검출하는 것은 임상적으로 매우 중요하다. 따라서 분석하고자 하는 목적 또는 유전자의 종류에 따른 다양한 돌연변이 검출 방법들이 개발되고 있다(Taylor CF, Taylor GR. Methods Mol. Med., 92:9, 2004). 하지만, 많은 경우에 분석 샘플에 존재하는 특정 돌연변이가 발생한 암세포의 수는 정상세포 및/또는 해당 돌연변이가 발생하지 않은 암세포와 대비하여 현저히 적기 때문에 검출하기 매우 어려우며 고도의 검출 기술을 필요로 한다(Chung et al, Clin Endocrinol, 2006/ Trovisco et al, J Pathol.,2004).

통상적으로 암 관련 유전자 돌연변이 검사는 침습적인 조직 생검(Tissue Biopsy) 검체로 수행해 왔는데, 이는 환자의 고통을 야기할 뿐만 아니라 아예 조직 생검이 불가능한 환자도 다수 존재하며, 이에 더하여 암 조직 세포의 불균질성(Heterogeneity)으로 인한 편향(bias) 위험성 등의 문제점이 존재하기 때문에 비침습적이면서도 균질성을 제공하는 액체 생검(Liquid Biopsy) 검체인 혈액 등으로부터 검사를 수행해야 할 필요성이 제기되었고, 이로 인해 더 적은 양의 유전자로부터 돌연변이를 정확히 검출할 필요성이 대두되고 있다.

유전자 변이 검사 방법으로는 전통적인 방법인 생어 시퀀싱(sanger sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 최근 개발된 리얼-타임 PCR(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR) 등이 있다.

또한, 소량 함유된 돌연변이 유전자를 선택적으로 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머(primer)를 이용하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법(Rhodes et al., Diagnmol pathol., 6:49, 1997), 스콜피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR, DxS' scorpions and ARMS) 방법 (Mark et al., Journal of Thoracic Oncology, 4:1466, 2009), 대립형질 특이적(allele specific) 프라이머 기술과 MGB(minor groove binder)-프로브를 이용하여 야생형 유전자의 증폭을 억제하고 돌연변이 유전자만을 선택적으로 증폭 후 택만(Taqman) 프로브를 이용하여 돌연변이가 일어난 위치를 포함하지 않고 증폭 산물을 검출하는 CAST PCR 방법 (Didelot A et al., Exp Mol Pathol., 92:275, 2012), 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, Tc)를 이용하여 돌연변이의 민감도를 증가시킬 수 있는 콜드PCR(Cold-PCR) 방법(Zuo et al., Modern Pathol., 22:1023, 2009) 등의 실시간 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 기술에 기반을 둔 다양한 선택적인 증폭 방법이 소개되고 있다. 이러한 방법들을 통해 다양한 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석 결과를 비교적 쉽고 빠르게 제공할 수 있게 되었다(Bernard et al., Clinical Chemistry, 48:1178, 2002).

이러한 실시간 PCR 기술에 기반을 둔 선택적인 증폭 방법에서는 표적 유전자 돌연변이를 검출하기 위한 방법으로 프로브에 표지한 형광 물질의 형광 빛을 사용하는 경우가 일반적이다.

특히 형광 물질과 근접할 시에 형광 빛을 흡수하여 형광 빛의 세기를 감소시키는 소광자(quencher)를 이용한 기술들이 종종 사용되는데, 등록특허 제10-1496671호에 따르면, 프로브가 단일 가닥으로 있을 시에 산화그래핀에 흡착되어 프로브의 형광 물질을 소광시키고, 프로브와 표적 핵산이 결합하여 이중 가닥으로 있을 시에 산화그래핀에 흡착되지 아니하여 프로브의 형광 물질을 형광 회복시키는 특성을 이용한다.

또한, 공개특허 제10-2015-0139096호에 따르면, 관심 질병으로 의심되는 세포로부터 나온 엑소좀에 관심 질병과 연관된 특이적인 유전자를 상보적으로 결합할 수 있는 분자 비컨을 사용하되, 분자 비컨의 일측 단부에는 검출라벨(형광 물질)을 결합시키고, 분자 비컨의 타측 단부에는 검출라벨과 대응하는 소광자를 결합시켰다. 이에, 분자 비컨이 특이 유전자와 결합되지 아니할 시에는 검출라벨과 소광자의 결합에 의해 검출라벨을 소광시키고, 유전자와 결합할 시에는 검출라벨이 소광자와 이격되어 형광을 회복하므로, 형광의 회복 여부로 유전자를 검출할 수 있다.

통상적으로 사용되는 형광 물질들은 여기시키기 위한 광 흡수 스펙트럼이 좁아 형광물질에 따라 서로 다른 광원을 사용하거나 해당 파장의 빛만 투과 또는 반사시키는 광학 편광 필터를 사용해야만 하고 이로 인해 적용할 수 있는 형광물질의 종류나 개수가 제한되거나 검출 장치가 복잡해지는 문제점을 가진다.

이에 더하여 형광물질이 표지된 프로브는 실시간 PCR 기술 기반의 선택적 증폭방법과 결합하여 사용되곤 하는데 프로브가 PCR 증폭을 저해하여 민감도를 저하시킬 가능성이 상존하는 문제점도 존재한다.

이에 따라 좀 더 정확하고 민감한 검출 방법에 대한 임상 현장에서의 요구를 충족하기 위한 노력이 지속되고 있다.

최근에는 다형(polymorphism)의 검출 방법으로서 융해점(융해온도, Tm : melting temperature) 해석 방법이 제시되고 있다. 융해점 해석을 통한 다형의 검출 방법은 검출하려는 다형을 포함하는 영역에 상보적인 프로브를 사용하여, 핵산과 프로브의 상보적 결합에 의한 하이브리드(이중 가닥 핵산)을 형성시킨 다음 하이브리드를 가열 처리하여, 온도 상승에 따라 하이브리드가 단일 가닥 핵산으로 분리되는 융해점을 흡광도 등의 시그널을 측정하여 얻고, 이로부터 다형을 판단한다. 일반적으로 측정된 융해곡선으로부터 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)에 의해 융해점을 도출한 다음 이로부터 다형을 판단한다.

융해점은 하이브리드화한 양 단일 가닥 핵산의 상보성이 높을수록 높고, 상보성이 낮을수록 낮아지므로 유전자와 프로브의 상보적 결합에 의해 생성된 하이브리드에 대해서 융해점을 검출하여 평가 기준치로 선정하고, 검사 대상의 핵산과 프로브에 의한 하이브리드의 융해점을 평가 기준치와 비교하여서, 핵산의 검출 대상 부위가 목적의 유전자와 동일한 것인지를 판별할 수 있다. 또한, 측정치가 검사 평가 기준치보다도 낮을 경우, 피검 핵산의 검출 대상 부위가 다른 형인 것으로 판별할 수 있다. 이에 따라, 검출 프로브를 첨가하여 PCR 반응시킨 이후 시그널 측정을 수행하는 것만으로, 다형을 검출할 수 있다.

융해점 측정을 위한 측정 시그널로는 프로브에 표지한 형광 물질의 형광 빛을 사용하는 경우가 일반적인데, 통상적으로 사용되는 형광 물질들은 여기시키기 위한 광 흡수 스펙트럼이 좁아 형광물질에 따라 서로 다른 광원을 사용하거나 해당 파장의 빛만 투과 또는 반사시키는 광학 편광 필터를 사용해야만 하고 이로 인해 적용할 수 있는 형광물질의 종류나 개수가 제한되거나 장치가 복잡해지는 문제점을 가지게 된다.

아울러 통상 검체 내 표적 핵산의 농도가 매우 낮아서 PCR 또는 실시간 PCR 등으로 표적 핵산을 증폭 또는 돌연변이 선택적으로 증폭한 다음 융해점 측정을 수행하게 되므로, 융해점 측정을 위한 프로브가 증폭을 저해하여 민감도를 저하시킬 위험성은 여전히 존재하고 있다.

양자점(QD :　quantum dot)은 사이즈에 따른 스펙트럼 변화(즉, 사이즈 변화에 따라 다른 파장의 빛을 방출하는 특성), 개선된 휘도, 광 표백(photo bleaching)에 대한 우수한 안정성, 동시 다중 형광 여기 등과 같은 특유의 유용한 광학 특성을 가지고 있어 최근 바이오 분야에서 많은 주목을 받아온 나노 소재이다.

특히 넓은 흡수 스펙트럼 및 좁은 방출 스펙트럼을 갖고 있어서, 기존 형광물질의 대체뿐만 아니라 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 현상을 기반으로 하는 바이오센서 또는 진단 시스템 내에서 도너(donor) 또는 어셉터 (acceptor)로 활용하려는 시도도 많이 진행되었다.

FRET 현상은 두개의 서로 다른 파장 영역의 형광 물질이 인접했을 경우에 여기된 어느 하나의 형광 물질에서 다른 하나의 형광 물질로 비복사 과정을 통해 에너지가 전이되어 다른 하나의 형광 물질의 고유 형광을 나타내는 물리적인 현상이다. 이때, 에너지를 주는 물질을 도너(donor, 공여체)라 하고, 에너지를 받는 물질을 어셉터(acceptor, 수용체)라 한다.

이와 같은 FRET 현상은 통상적으로 대부분의 생물 내 매크로 분자의 치수(dimension)에 상당하는 대략 10Å 내지 100Å 범위 내로 도너와 어셉터가 근접하였을 시에 일어나기 때문에, 생접합 기술 등을 적용하여 도너와 어셉터 간의 국지적 거리를 보장해야 한다.

양자점을 이용한 FRET 기반 센서의 다수는 단백질-양자점 접합체(conjugates) 또는 스트렙타비딘(Streptavidin)-양자점 시스템을 사용하고 있으며, 비특이적 흡착, 정전기적 상호작용 및 공유 결합 등을 통해 생분자를 양자점에 접합시킨 경우도 보고되었다. 양자점을 이용한 FRET 기반 센서 관련 기술로서, siRNA 서열을 스크리닝하기 위한 양자점-접합된(conjugated) 혼성화 프로브, 고감도 DNA 나노센서, DNA-양자점 접합에 기반하는 뉴클레아제 내성(nuclease tolerant) FRET 프로브 등이 보고되었다.

양자점을 이용한 종래기술의 구체적인 예로서, 등록특허 제10-0704011호 및 등록특허 제10-1510513호가 있다.

상기 종래기술을 비롯한 대부분의 양자점을 이용한 FRET 기반 기술은, 도너인 양자점에 접합시키기에 앞서 대부분 표적 물질(핵산, 유전물질, 예를 들면 DNA)을 먼저 염료(dye)로 라벨링할 것을 요구할 뿐만 아니라, 경우에 따라서는 복수의 프로브를 사전에 제조하거나 접합에 앞서 표적 물질 및 양자점에 각각 바이오틴 처리 및 스트렙타비딘 처리를 수반하기 때문에 절차가 상대적으로 매우 복잡하다. 또한, 프로브를 양자점에 생접합하는 경우, 프로브와 표적 물질 간의 혼성화를 방해하기도 한다.

또한, 대부분의 검체에는 표적 핵산이 소량으로 존재하여 PCR 증폭이 필요한데 양자점은 PCR 증폭 과정에서 열화되는 문제점을 가지고 있다. 양자점의 열화를 방지하기 위해, 통상 PCR 증폭을 별도로 수행한 이후 양자점이 포함된 검출 시약을 시료에 추가로 투입하여 혼성화한 후 온도조절을 하며 시그널 변동을 검출하는데, 투입 및 셋팅 과정이 이중으로 필요하여 그 과정이 매우 번거롭고 어려우며, 시그널 변동 검출 단계보다 PCR 증폭 수행 단계가 상대적으로 더 많은 시간이 소요되기 때문에 그 번거로움 및 어려움이 더욱 증가하는 문제점이 있다.

한편, 시료에 시약을 투입함에 따라 나타나는 반응을 검출하기 위한 종래의 키트는 존재하지만, 1회의 셋팅, 시료에 대한 사전 처리, 시약의 안정적 투입, 반응 검출 등을 위한 키트는 존재하지 아니하여, 상기한 바와 같이 표적 핵산 검출을 쉽고 간편하게 할 수 있는 키트를 사용하지 못하였다.

KR 10-1506048 B1 2015.03.19. KR 10-0704011 B1 2007.03.29. KR 10-1510513 B1 2015.04.02. KR 10-1496671 B1 2015.02.23. KR 10-2015-0139096 A 2015.12.11.

본 발명은 상기한 번거로움, 어려움 및 문제점을 해결하기 위해 창안한 발명으로서, 시료 및 시약을 투입한 상태로 셋팅한 이후 시료에 대한 사전 처리과정을 수행할 수 있고, 시료와 시약 사이의 반응도 용이하게 시키면서 검출할 수 있도록 구성한 시료 시약 반응 분석용 키트와, 이러한 키트를 이용하여 표적 핵산을 안정적으로 PCR 증폭한 후 정확하게 검출할 수 있는 표적 핵산 검출 장치 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

보다 상세하게는, 본 발명의 시료 시약 반응 분석용 키트와 표적 핵산 검출 장치 및 방법을 이용하여 PCR 증폭단계에서 검출 프로브가 표적 핵산의 증폭을 저해할 가능성과 QD(양자점)가 열화할 가능성을 사전에 차단하여 안정적이고 정확하게 표적핵산을 검출할 수 있으면서도 분리된 PCR 증폭단계와 검출단계 사이에 번거롭고 어려운 사용자의 작업이 필요 없도록 함으로써 향상된 사용 편이성을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, QD를 분산광원이라는 새로운 개념으로 활용할 가능성을 확인하고 입증함으로써, 광원과 광학 필터의 필요성을 크게 줄이고, 검출 장비의 광학계를 간소화하면서도 다양한 형광물질을 동시에 사용하여 한 번에 여러 표적 핵산을 동시에 검출하는 다중검출방법을 제공하는 의의도 있다.

본 발명은 시료 시약 반응 분석용 키트에 있어서, 시료를 담아둘 제1 웰(111), 시약을 담아둘 제2 웰(112), 및 제2 웰(112)의 시약이 넘쳐 제1 웰(111)로 투입되게 할 유로(113)를 조성한 유동 칩(110); 및 시약 및 시료가 새지 아니하도록 유동 칩(110)을 덮어 실링하며, 제2 웰(112)을 덮는 부위에 조성되어 눌림에 의해 제2 웰(112)에 담겨 시약을 제1 웰(111)로 투입되게 할 담금 부재(122) 및 제1 웰(111)을 덮는 부위에 조성한 투광창(121)을 구비한 커버(120); 를 포함하여 구성된다.

이를 통해, 시료에 대한 사전 작업도 가능하면서, 시료와 시약 간의 반응을 일으키기에도 용이하며, 반응에 따라 발생하는 시그널도 측정할 수 있게 한 키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 역류 방지 수단을 구비하여서, 시료에 대한 전처리를 안정적으로 수행할 수 있는 키트를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 표적 핵산 검출 장치에 있어서, 표적 핵산을 함유한 시료 및 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭 시약을 상기 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산의 검출을 위한 검출 시약을 제2 웰(112)에 넣은 후 제1 웰(111)의 온도 변화를 주는 히터(300)에 안착하여, 온도 변화를 주어 제1 웰(111)의 시료를 PCR 증폭하고, 이후, 제2 웰(112)의 시약을 제1 웰(111)에 투입한 상태에서 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)을 위한 온도 변화를 주도록 히터(300)를 제어하게 되어 있으며, 제1 웰(111)의 온도 변화에 따른 시그널 변화를 투광창(121)을 통해 광학계(200)로 측정하여 표적 핵산을 검출하게 되어 있다.

또한, 본 발명의 표적 핵산 검출 방법에 있어서, 표적 핵산을 함유한 시료 및 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭 시약을 상기 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브가 함유된 시약을 제2 웰(112)에 넣은 후 제1 웰(111)의 온도 변화를 주어 제1 웰(111)의 시료를 PCR 증폭하는 증폭 단계; 제2 웰(112)의 시약을 제1 웰(111)에 투입하여 검출 프로브를 표적 핵산과 혼성화하는 혼성화 단계; 및 제1 웰(111)에 온도 변화를 주며 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)하여 표적 핵산을 검출하는 검출 단계;를 포함한다.

이를 통해, 표적 핵산의 증폭 및 검출에 이르는 일련의 과정은 1회 셋팅 작업 으로 간편하게 수행할 수 있는 표적 핵산 검출 장치 및 방법을 제공할 수 있다.

상기와 같이 구성된 본 발명에 따른 키트는 제1 웰(111) 및 제2 웰(112)로 구성되는 독립적 웰을 구비하여 시료에 대한 사전 처리가 가능하고, 유로 및 투광창을 이용하여 시료와 시약 간의 반응 분석도 가능하여, 시료과 시약 간의 반응 분석을 위해 필요한 일련의 작업을 용이하게 수행할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 키트를 이용한 표적 핵산 검출 방법 및 장치에 있어서, 1회 셋팅으로 PCR 증폭 과정, 혼성화 과정 및 융해분석을 통한 검출과정에 이르는 전 과정을 용이하게 수행할 수 있고, 다루기에도 간편하다.

또한, 양자점을 분산 광원으로 사용하여 광학계를 단순화할 수 있을 뿐만 아니라, 형광물질을 고르게 여기시키며 정확하게 검출할 수 있고, 다형 검출을 위해 고려해야 할 제약조건도 적어, 다양한 검체에서 추출한 시료에 대해 용이하게 분석할 수 있다.

또한, 양자점을 분산 광원으로 사용함으로써 여러 형광물질을 동시에 사용하여 다중검출을 더욱 용이하게 수행할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시를 위한 키트(100)이다. 키트(100)는 유동 칩(110) 및 커버(120)를 기구적 구성요소로 하며, 유동 칩(110) 및 커버(120)의 사시도, 상면도 및 단면도를 도시하되, 유동 칩(110)은 상면 사시도(a) 및 상면도(b)를 도시하고, 커버(120)는 저면 사시도(d) 및 저면도(e)로 도시하여, 유동 칩(110)의 상면측과 접하는 커버(120)의 저면측을 자세히 보여준다.
도 2는 도 1의 키트(100)에 시료 및 시약을 담은 후 조립한 상태의 단면이다.
도 3은 도 1,2에서 보여준 키트(100)에 광학계(200) 및 히터(300)를 더하여 구성한 표적 핵산 검출 장치의 구성도이다.
도 4는 형광염료 및 소광자를 결합한 검출 프로브이 함유되어 있는 시약에 양자점이 고르게 산재되어 있게 한 후, 시료를 시약을 표적 핵산 함유 시료에 투입하여 표적 핵산을 검출하는 방법의 모식도이다.
도 5는 형광염료 결합한 검출 프로브와 소광자가 함유되어 있는 시약에 양자점이 고르게 산재되어 있게 한 후, 시료를 시약을 표적 핵산 함유 시료에 투입하여 표적 핵산을 검출하는 방법의 모식도이다.
도 6 및 도 7은 키트(100)를 포함한 핵산 검출 장치에 의해 이루어지는 표적 핵산 검출 방법의 순서도이다.
도 8은 Cell line으로부터 추출된 KRAS G12D 돌연변이(Mutant) DNA와 야생형(wild) DNA를 이용하여, 돌연변이 비율에 따라 얻는 융해곡선 그래프이다.
도 9는 실제 임상샘플에 적용한 실험 결과를 얻기 위해서, 인천성모병원 인체유래물질 자원은행에서 제공받은 임상검체를 진단한 결과로 얻은 융해곡선 그래프이다.

< 시료 시약 반응 분석용 키트 >

본 발명에 따른 키트(100)는 시약을 시료에 투입하여 시료와 시약에 각각 함유된 물질 사이의 상호 반응을 유도하고, 상호 반응에 따라 발생하는 시그널을 검출하는 키트로서, 시료와 시약을 각각 독립적인 공간에 담아 둔 상태로 밀폐하고, 시료 와 시약을 혼합하기 이전에 개별적으로 전처리하기에도 용이하며, 이후 시약을 간편하게 시료에 투입시킨 후 상호 반응에 따라 발생하는 시그널도 곧바로 검출할 수 있게 구성된다.

이를 위한 키트(100)의 구체적인 실시 예를 도면을 참조하며 상세하게 설명한다.

도 1 및 도 2를 참조하면, 본 발명의 실시 예에 따른 키트(100)는 유동 칩(110) 및 커버(120)를 기구적 구성요소로 포함하여 구성된다.

상기 유동 칩(110)은 시료를 담아둘 제1 웰(111), 시약을 담아둘 제2 웰(112), 및 제2 웰(112)의 시약이 넘칠 시에 제1 웰(111)로 투입되게 할 유로(113)를 조성한 구성요소이다.

실시 예를 구체적으로 살펴보면, 상호 이격된 위치에 조성하는 제1 웰(111) 및 제2 웰(112)은 각각 상부가 열려 있고 하부로 갈수록 점차 줄어드는 우물 형태로 아래로 돌출되어 있고, 열려 있는 상부 개구 중에 상호 마주하는 방향에 노치(notch) 를 조성한 후 노치 사이를 이어지게 한 장요홈 형태의 유로(113)를 조성하였다.

여기서, 유로(113)는 제1 웰(111)과 연결되는 부위와 제2 웰(112)에 연결되는 부위의 내부 바닥면을 각각 하향 경사지게 조성한 경사면(113a)으로 조성하여, 제2 웰(112)의 시약이 제1 웰(111)로 원활하게 유입되게 한다.

한편, 유동 칩(110)의 상면 중에 제1,2 웰(111, 112)의 둘레, 유로(113)의 둘레, 및 테두리를 제외한 면을 하방으로 함몰시킨 함몰부(114)를 조성하여서, 후술하는 커버(120)의 끼움부(124)가 끼워지게 한다.

상기 커버(120)는 시약 및 시료가 새지 아니하도록 유동 칩(110)의 상부를 덮어 실링하는 구성요소로서, 함몰부(114)의 조성에 따라 함몰부(114)의 바닥면으로 돌출되게 된 제1,2 웰(111, 112)의 상부 개구 둘레 및 유로(113)의 상부 개구 둘레에 밀착되며, 함몰부(114)의 형상에 맞게 하부로 돌출된 끼움부(124)를 저면에 구비하여, 끼움부(124)를 함몰부(114)에 끼우는 방식으로 유동 칩(110)의 상면에 겹쳐 고정시킬 수 있고, 이에, 제2 웰(112)에서 넘치는 시약이 다른 데로는 새지 아니하고 유로(113)를 통해서만 제1 웰(111)로 흐르게 한다.

아울러, 상기 커버(120)는 제1 웰(111)의 상부 개구를 덮는 부위에 조성한 투광창(121), 및 하부 방향으로의 눌림에 의해 제2 웰(112)에 담겨지도록 제2 웰(112)의 상부 개구를 덮는 부위에 조성한 담금 부재(122)를 구비한다.

상기 투광창(121)은 광 투광을 위한 구성요소로서, 투명 재질로 막혀 있거나 아니면, 구멍 형태로 조성한 후 폐구 수단을 이용하여 선택적으로 폐구할 수 있게 하며, 실시 예에 따르면 제조의 편의상 구멍 형태로 조성하고 폐구 수단으로 막을 수 있게 하였다. 폐구 수단으로는 점착성 또는 접착성을 갖는 투명한 실링 테이프(125)로 할 수 있다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 상기 커버(120)는 탄성적으로 수축 가능한 재질로서 예를 들어 실리콘 재질처럼 고무탄성(rubber elasticity) 특성을 갖는 재질로 구성되어, 끼움부(124)를 함몰부(114)에 억지끼움 방식으로 유동 칩(110)의 상면을 덮으면, 제1 웰(111), 제2 웰(112) 및 유로(113)의 상부 열린 부위를 덮어 실링할 수 있다.

담금 부재(122)는 커버(120) 중에 제2 웰(112)의 상부 개구를 덮는 부위로 구성되되, 하부로 돌출되어 있어 제2 웰(112)에 담길 수 있고, 하부로 돌출된 하부 구조를 제2 웰(112)의 하부측 내부의 형상으로 형태 유지할 수 있는 형상 유지부(122a)로 구성하고, 상부측 구조에 대해서는 형상 유지부(122a)의 눌림에 의해 하부로 늘어나거나 형상 유지부(122a)를 하부로 이동시키는 데 필요한 길이만큼 주름져 있어서, 형상 유지부(122a)를 상부측 노출된 부위를 하방으로 눌러 제2 웰(112)의 내부 바닥에 밀착시킬 수 있다. 이에, 제2 웰(112)의 시약을 최대한 많이 제1 웰(111)로 투입할 수 있다.

본 발명의 실시 예에서는 고무탄성 재질로 되어 있다고 하였고, 담금 부재(122)의 상부측 구조는 하부측 형상 유지부(122a)에서 연장되어 커버(120) 위로 돌출된 후 커버(120)의 평평한 면에 이어지도록 1회 굽어진 형태를 갖추므로, 담금 부재(122)는 하방으로 눌렀을 시에 눌어남과 동시에 굽어진 상부측 구조를 펴지게 하면서 제2 웰(112)의 내부 바닥까지 담겨진다.

실시 예에 따르면, 담금 부재(122)의 형상 유지부(122a)는 제2 웰(112) 하부 측 내부면에 밀착할 수 있으면서 속이 채워진 형태를 이루어, 눌림에 의한 형태 변화는 적게 나타나게 하였다.

상기 커버(120)는 제1 웰(111)에서 제2 웰(112)로 역류하는 것을 방지하는 역류 방지 수단을 구비하며, 구체적인 실시 예에 따르면, 역류 방지 수단은 상기 유로(113)를 막은 상태에서 담금 부재(122)의 눌림으로 투입되는 시약의 유압에 의해 제1 웰(111) 방향으로 탄성 변형되며 유로(113)를 개방하는 역류방지 돌기(123)로 구성된다.

이때의 역류방지 돌기(123)는 유로(113) 내에 조성한 경사면(113a) 중에 제1 웰(111) 측의 경사면(113a)이 조성된 부위의 유로(113)를 막도록 저면에 돌출되어 있고, 제1 웰(111)에서 멀어질수록 하부로의 돌출 높이를 작게 하여서, 시약에 의한 유압이 가해질 시에 제1 웰(111) 방향으로 탄성 변형되며 유로(113)를 개방한다. 물론, 유압이 가해지지 아니하면 탄성 복원하여 유로(113)를 막게 되고, 제1 웰(111)에서의 역방향 압력이 가해져도 개방하지 아니하고 유로(113)를 막은 상태로 유지되게 한다.

한편, 커버(120)의 재질적 특성에 의해 담금 부재(122)를 눌렀을 시에 유로(113)를 덮는 부위가 담금 부재(122) 쪽으로 당겨지게 되고, 이에 따라, 역류방지 돌기(123)를 개방 동작시키는 힘이 가해지게 하므로, 개방 동작을 원활하게 한다.

이와 같이 구성되는 키트(100)는 시료 및 시약을 독립적으로 상호 분리되어 있도록 제1,2 웰(111, 112)에 담아 두어 시료와 시약 간의 반응을 위한 세팅이 완료되므로, 다루기 쉽고, 시료 또는 시약에 대한 전처리 과정이 필요한 경우 해당되는 것만 독립적으로 전처리 과정을 수행할 수 있으며, 전처리 과정 이후 시료와 시약 간의 반응을 위한 혼합과정이 용이함은 물론이고, 반응으로 나타나는 결과도 관찰할 수 있게 되어 있어, 전반적으로 시료 시약 반응 분석용 키트에 유용하다.

이상에서 설명한 키트(100)는 표적 핵산을 함유한 시료를 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산의 검출을 위한 시약을 제2 웰(112)에 넣은 후, 시료에 대해서는 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭하고, 이후, 시약을 시료에 투입한 후 투광창(121)을 통해 표적 핵산을 검출하는 키트로 사용할 수 있다. 여기서, 시약은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브가 양자점과 함께 산재되어 있는 시약으로 하여서, 시약을 시료에 투입함에 따라 양자점이 산재되어 있는 환경 하에서 검출 프로브와 표적 핵산을 혼성화시켜 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하게 할 수 있다. 이에, 양자점을 분산광원으로 하여 형광염료의 형광 빛을 측정하는 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)을 통해 표적 핵산을 검출할 수 있다.

이와 같이 키트(100)를 포함하여 구성되는 표적 핵산 검출 장치 및 이를 이용한 표적 핵산 검출 방법에 대해서는 설명한다.

< 표적 핵산 검출 장치 >

도 3을 참조하면, 표적 핵산 검출 장치는 상기 키트(100)에 광학계(또는 광학시스템, 200) 및 히터(300)를 더하여 구성된다.

히터(300)는 컨트롤러(미도시)에 의해 온도를 제어할 수 있는 구성요소로서, 상기 키트(100)를 올려놓는 안착대(301) 중에 제1 웰(111)이 끼워져 안착되는 부위에 장착된다.

이때, 안착대(301)에 올려놓는 키트(100)는 표적 핵산을 함유한 시료 및 PCR 증폭 시약을 상기 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산의 검출을 위한 시약을 제2 웰(112)에 넣은 후 커버(120)로 실링한 상태이다. 후술하는 바와 같이 본 발명의 실시 예에 따르면, 시약은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브와, 분산광원으로 사용할 양자점이 고르게 산재되어 있되, 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료가 검출 프로브에 표지되어 있다.

한편, 컨트롤러(미도시)에 의한 온도 제어는 시약을 투입하기 이전 제1 웰(111)의 시료에 대해 온도 변화를 주어 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭하기 위한 온도 제어와, 제2 웰(112)의 시약을 제1 웰(111)에 투입한 상태에서 제1 웰(111)에 온도 변화를 주어 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis) 하기 위한 온도 제어이며, 이와 같은 온도 제어 방식은 본 발명이 속한 기술분야에서 공지된 기술인 바, 상세 설명을 생략한다.

여기서, 커버(120)의 담금 부재(122)를 누를 수 있는 누름 수단을 유압 실린더 등으로 구성하여, 시약의 투입을 컨트롤러에 의해 이루어지게 하여도 좋다.

상기 광학계(200)는 히터(300)에 안착된 키트(100)의 투광창(121) 위에 배치된다. 구체적으로, 투광창(121) 위에는 대물렌즈부(210), 제1 다이크로익 미러(220), 제2 다이크로익 미러(230), 형광 빛 검출용 필터(241) 및 형광 빛 검출부(240)의 순서로 연직방향으로 배치되어, 형광 빛을 검출할 수 있고, 양자점을 여기시키는 여기 광원(221)이 제1 다이크로익 미러(220)의 반사에 의한 도움을 받아 형광 빛의 광축과 일치되어 대물레즈부(210)를 통해 제1 웰(111)에 조사되게 한다.

양자점에서 방출되는 빛이 형광염료의 형광 빛과 함께 제1 웰(111)로부터 방출되므로, 제2 다이크로익 미러(230)로 양자점의 방출 빛을 반사시킨 후 필터(232)로 필티링하여 양자점 빛 검출부(231)로 검출되게 한다.

여기서, 제1,2 다이크로익 미러(220)는 특정 파장을 초과하는 빛을 모두 통과시키고, 그 이하의 파장을 갖는 빛은 반사시키는 특성이 있는 다이크로익 미러(dichroic mirror)로서, 제1 다이크로익 미러(220)는 형광 빛과 양자점 방출 빛을 포함하는 파장대는 통과시키지만 여기 광의 파장대 빛은 반사시키고, 제2 다이크로익 미러(230)는 형광 빛의 파장대 빛은 통과시키지만 양자점 방출 빛의 파장대 빛은 반사시키도록 적절하게 선택 사용한다. 또한 다중 검출에서와 같이 검출하고자 하는 파장대의 검출부를 추가하려는 경우 다이크로익 미러를 추가 설치할 수도 있고 방향을 달리하여 설치할 수도 있음을 밝혀 둔다.

그리고, 필터(232, 241)는 각각 검출하려는 빛의 파장대만 선별적으로 통과시키는 필터로 구성하면 된다. 또한, 경우에 따라 회전판상에 서로 다른 파장대역을 갖는 필터를 배치하여 선별적으로 회전시켜 다양한 파장대의 빛을 검출하도록 할 수도 있다.

형광 빛 검출부(240) 및 양자점 빛 검출부(232)는 예를 들어 CCD 센서 또는 PMT(photo multiplier tube)로 구성할 수 있다.

한편, 다중 검출(multiplex detection)을 위해서, 서로 다른 크기의 양자점을 키트의 구성품으로 하는 것이 좋다.

<표적 핵산 검출 방법>

상기한 표적 핵산 검출 장치를 이용한 표적 핵산 검출 방법은 표적 핵산을 함유한 시료 및 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭 시약을 상기 제1 웰(111)에 넣는 한편, 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브가 함유된 시약을 제2 웰(112)에 넣고 커버(120)로 유동 칩(1110)을 실링한 키트(100)를 안착대(301)에 안착한 이후 히터(300)를 이용하여 제1 웰(111)에 온도 변화를 주어 제1 웰(111)의 시료를 PCR 증폭하는 증폭 단계; 증폭 이후, 담금 부재(122)를 눌러 제2 웰(112)의 시약을 제1 웰(111)에 투입함으로써 검출 프로브를 표적 핵산과 혼성화하는 혼성화 단계; 및 히터(300)를 이용하여 제1 웰(111)에 온도 변화를 주며 광학계(200)로 형광 빛을 측정하고, 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)을 얻어 분석함으로써 표적 핵산을 검출하는 검출 단계;를 포함한다.

구체적인 실시 예에 따르면, 제2 웰(112)에 넣는 시약은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브가 양자점과 함께 고르게 산재되어 있는 시약이며, 여기서 검출 프로브는 표적 핵산 간의 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광 염료의 상태 변화를 유도하게 되어 있다.

이때, 형광 염료의 상태 변화는 형광 빛을 방출하는 상태 및 형광 빛이 소광되어 방출되지 아니하는 상태 간의 변화이다.

그리고, 상기 혼성화 단계에서는 시약을 시료에 투입함에 따라 양자점이 산재되어 있는 환경 하에서 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화된다.

이에, 상기 검출 단계에서는 컨트롤러(미도시)가 히터(300)를 제어하여 제1 웰(111)의 온도를 서서히 올리고, 동시에 광학계(200)를 제어하여 자외선 또는 레이저를 제1 웰(111)에 조사하여 양자점을 여기시켜 양자점을 분산광원으로 함에 따라 양자점의 방출 빛에 의해 여기되어 발광하는 형광염료의 형광 빛 세기를 측정하게 한다. 그리고, 온도 변화에 따른 형광 빛 세기의 변동율로 얻는 융해곡선(Melting Curve)을 분석하여 표적 핵산을 검출한다.

도 4 및 도 5의 모식도를 참조하여 양자점을 분산광원으로 하는 표적 핵산 검출 방법에 대해 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 실시 예에 따른 표적 핵산 검출 방법은 검출 프로브(detecting probe)과 표적 핵산 사이의 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료(fluorescent dye)의 상태 변화를 검출하여 표적 핵산을 검출함에 있어서, 형광염료의 흡광 파장대의 빛을 사방으로 방출하는 양자점(QD : quantum dot)을 분산광원으로 사용한다.

구체적으로, 본 발명은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖고 있는 검출 프로브를 양자점이 산재되어 있는 환경 하에 표적 핵산과 혼성화시켜 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하는 혼성화 단계; 및 산재되어 있는 양자점을 여기시킴에 따라 분산광원 역할을 하는 양자점의 방출 빛을 받는 형광염료의 형광 빛을 검출함으로써 표적 핵산을 검출하는 검출 단계; 를 포함한다.

표적 핵산은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 다양한 DNA, RNA, 염색체, 대사물질 등이 있다. 표적 핵산은 예를 들어 질병 발생 가능성 및 발병 위험도와 관련된 돌연변이 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 표적 핵산을 함유하는 시료를 채취하여 표적 핵산을 검출한다.

채취한 시료에는 표적 핵산이 소량 함유되어 있는 것이 일반적이며, 본 발명의 실시 예에서는 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭을 선행하여 시료 내의 표적 핵산을 증폭하는 증폭 단계를 상기 혼성화 단계 이전에 수행한 이후, 검출 프로브 및 양자점이 각자 고르게 산재되어 있게 함유된 혼합액을 검출을 위한 시약으로서 증폭 결과물 함유 시료에 투입하여 혼성화 단계를 수행한다.

이를 통해, PCR 증폭 과정에서의 열적 영향이 양자점 및 검출 프로브에 미치지 아니하므로, 양자점의 열화 문제 또는 PCR 시약과 검출 프로브 사이의 열적 특성 차이에 따른 문제가 생기지 아니한다.

본 발명에 따른 키트(100)를 이용하면 증폭 단계 이후 혼성화 단계를 수행하는 과정이 간편하다.

한편, PCR 증폭은 PCR 증폭 시약을 투입한 상태에서 변성(Denaturation), 결합(Annealing) 및 신장(Elongation)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여, 표적 핵산을 증폭하는 공지의 기술인 바, 상세한 설명을 생략한다.

시약에 투입된 물질에 대해 설명하면 다음과 같다.

검출 프로브(detecting probe)는 표적 핵산에 상보적으로 결합하여 혼성화하는 모든 핵산 또는 핵산 유사체로서, 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA (Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택될 수 있다. PCR 증폭을 위한 중합효소에 일반적으로 뉴클레아제(nuclease) 활성이 있어서, 검출 프로브의 손상이 생길 가능성도 있으므로, 뉴클레아제에 대해 안정한 PNA와 같은 합성 핵산을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 검출 프로브는 표적 핵산의 유전자를 선택적으로 검출시키는 역할을 하므로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 핵산 검출을 위한 검출 프로브를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 바람직하게 PNA 프로브를 사용하였으며, PNA 프로브는 인공합성 DNA로서 타겟 DNA 또는 타겟 RNA와의 특이적 결합이 가능하고, 뉴클레아제에 대해 안정하기 때문에 프로브를 기반으로 한 융해곡선(melting curve) 분석이 가능하다.

이때의 검출 프로브는 표적 핵산의 특정 위치 유전자에만 혼성화하는 것일 수도 있다. 예를 들어 야생형(wild) 유전자는 제외하고 돌연변이(mutant) 유전자와 혼성화하는 검출 프로브일 수도 있다.

혼성화는 잘 알려진 바와 같이 상보적인 단일 가닥 핵산들이 상보적 결합하여 이중 가닥 핵산, 즉, 하이브리드(hybrid)를 형성하는 것을 의미한다. 표적 핵산이 이중 가닥인 경우, 검출 프로브와의 혼성화 반응을 일으키기 위해서 표적 핵산을 단일 가닥으로 분리하여야 하는 데, 이러한 방법으로서, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 또는 글리콕살 처리, 효소적 방법, 결합 단백질 등이 알려져 있으나, 본 발명의 실시 예 설명에서는 히터(300)에 의한 열처리에 의해서 달성하는 것으로 이해해도 좋다.

형광염료(fluorescent dye)는 특정 파장의 빛을 흡수 및 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 표적 핵산 검출 기술분야에 있어서, 표적 핵산과 검출 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인하는 데 사용된다.

이러한 형광 염료는 플루오레신 (fluorescein), 플루오레신 클로로 트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 형광 물질을 사용할 수 있다.

여기서 사용하는 형광염료는 특정 파장의 빛을 흡수 및 방출하는 특성이 있으므로, 적절한 파장의 빛을 흡수하여 형광 빛을 방출되게 하여야 하며, 본 발명에 따르면, 양자점(QD : quantum dot)이 형광염료의 형광 빛을 방출시키기 위한 적절한 파장의 광을 제공한다.

한편, 검출 프로브와 표적 핵산 사이 혼성화 여부에 따라 형광 특성, 즉, 형광 빛을 방출하거나 형광 빛을 소광하는 특성이 달라지도록, 혼성화 여부에 따라 형광염료의 상태 변화(예를 들면 도 1,2에 예시한 혼성화 전후의 상태 변화)를 유도하여 하며, 이를 위해 본 발명의 실시 예에서는 소광자(quencher)를 사용한다.

소광자(quencher)는 형광염료에서 방출하는 형광 빛을 흡수하여 형광 세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 형광염료와의 거리에 따라 소광(quenching) 량이 달라지며(즉, 외부로 방출되는 형광 빛 세기가 달라지며), 그 종류에 따라 상이하지만 소정 거리 이내로 형광염료와 근접할 시에 광학계로 식별 가능한 소광 특성을 발휘한다.

이러한 소광자는 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 그 종류에 따라 형광세기를 감소시키는 범위가 다르므로 이를 고려하여 선택 사용할 수 있다.

도 4에 예시한 본 발명의 실시 예에 따르면, 일측 단부에 형광염료를 표지하고 타측 단부에 소광자를 결합한 검출 프로브를 사용하여, 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화되기 이전에는 검출 프로브의 특성에 따라 형광염료와 소광자 사이의 거리가 근접하므로, 외부 광(본 발명에서는 양자점의 방출 빛)을 흡광하더라도 형광염료의 형광 빛이 소광자에 의해 소광된다. 그렇지만, 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화될 시에 펴져 표적 핵산과 결합하게 되므로 형광염료와 소광자 사이의 간격이 멀어지고, 이에, 소광자에 의한 소광 특성을 발휘할 수 없게 되고, 외부 광에 의한 형광염료의 형광 빛이 방출된다. 이러한 검출 프로브는 예를 들어 선행기술문헌 공개특허 제10-2015-0139096호에 개시된 것을 사용하여도 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

도 5에 예시한 본 발명의 실시 예에 따르면, 일측 단부에 형광염료가 표지되어 있되, 소광자에 흡착되는 검출 프로브를 사용한다. 이에 따르면, 외부 광에 의한 형광염료의 형광 빛을 소광하고, 검출 프로브가 표적 핵산에 혼성화될 시에 소광자로부터 분리되며 혼성화되므로, 소광 특성이 발휘되지 아니하고, 외부 광에 의한 형광염료의 형광 빛이 소광되지 아니함에 따라 방출된다. 이러한 검출 프로브 및 소광자는 예를 들어 선행기술문헌 등록특허 제10-1496671호에 개시된 것을 사용하여도 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 도면으로 도시하지 아니하였고 선행기술문헌으로 언급하지는 아니하였지만, 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하는 방법으로서, 공개특허 제10-2017-0058780호의 도 3에 예시한 바와 같이 형광염료 및 소광자가 결합된 검출 프로브가 표적 핵산과 혼성화할 시에 형광염료가 결합된 부위가 분리되게 하는 방법, 또는 검출 프로브와 표적 핵산의 혼성화에 따라 형성된 이중 가닥의 하이브리드에 흡착하여 소광하는 형광물질을 사용하는 방법 등에서도 양자점을 분산광원으로 하는 본 발명을 적용할 수 있을 것이다.

바람직하게는 검출 프로브의 변형은 없으면서 상태 변화에 따라 형광 빛의 발광 및 소광이 결정되게 하는 도 4 또는 도 5의 검출 프로브를 사용하는 것이고, 더욱 바람직하게는 양자점을 분산광원으로 한다는 점을 고려하여 검출 프로브와 양자점을 함유한 혼합액을 사용하는 도 4의 검출 프로브를 사용하는 것이라 하겠다.

이하, 설명의 편의를 위해서 도 4에 예시한 바와 같이 말단에 형광염료 및 소광자를 구비한 검출 프로브를 사용하는 것으로 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 형광염료의 상태 변화를 유도하는 여타 다른 방법에도 적용될 수 있음은 자명하다. 또한, 도 4에 예시한 바에 따르면 혼성화에 따라 형광 빛 세기가 감소하지만 여타 다른 방법에 적용할 경우 혼성화에 따라 형광 빛 세기가 증가하기도 하는 데, 이를 고려 분석 기술도 본 발명의 기술이 속한 기술분야에서 공지되어 있는 바 자명하다고 하겠다.

양자점(QD : quantum dot)은 나노 사이즈의 입자로서, 입자 크기별로 빛 파장이 다르게 나타난다.

종래 핵산 검출 기술분야에 있어서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 기반으로 양자점을 활용하기 위해 양자점을 프로브에 접합 또는 링크시켜야 하였으나, 본 발명에 있어서는 FRET 기반으로 하지 아니하므로, 프로브와의 접합 또는 링크가 필요치 아니한다.

즉, 본 발명의 실시 예에 따르면, 양자점은 검출 프로브 혼합액 내에 독립적으로 고르게 산재되어 있어 검출 프로브와 결합되지 아니하게 하고, 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화할 시에도 혼성화에 따라 발생한 하이브리드와 함께 각자 고르게 산재되어 있게 한다.

이에, 혼성화 이전 검출 프로브가 함유된 수용액 내에서 뿐만 아니라 혼성화가 이루어지는 수용액 내에서도 양자점이 독립적으로 고르게 산재되어 있도록 하기 위해서, 본 발명의 실시 예에서는 수용성(water-soluble)을 나타내도록 양자점을 표면 처리한다. 이때의 양자점 표면 처리는 히드록시기(-OH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), 티올기(-SH) 등의 친수성 작용기로 표면 개질(modification)하는 것일 수 있다.

그리고, 양자점을 여기시켜 양자점을 발광시킴으로써 분산광원 역할을 하게 하고, 양자점에서 방출되는 빛이 사방으로 조사됨에 따라 주변 형광염료에 흡광되어 형광염료 고유의 형광 빛을 발하게 한다.

양자점의 입자 크기는 여기될 시에 형광염료의 특정 입사 파장대의 빛을 방출하도록 형광염료의 입사 파장대에 맞게 선정한다. 이와 같이 양자점을 형광염료에 매칭시킴으로써, 양자점은 특정 파장대의 빛을 흡광하여 고유의 형광 빛을 방출하는 형광염료를 타겟으로 하여 빛을 방출함으로써 타겟이 되는 형광염료의 형광 빛을 방출되게 할 수 있다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 시료 내에 2 종류 이상의 표적 핵산이 존재하여 각 종류의 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 2 종류 이상의 검출 프로브를 사용하는 다형의 표적 핵산 검출 방법에 적용할 수 있으며, 이를 위해서, 검출 프로브의 종류별로 흡광(흡수 또는 수광) 빛의 파장대는 물론이고 방출 형광 빛의 파장대도 상이한 형광염료를 표지하며, 검출 프로브의 종류별로 표지한 서로 다른 형광염료와 일대일 매칭되는 상호 다른 크기의 양자점을 투입 사용한다. 이에, 2 종류 이상의 검출 프로브는 각각 자신과 상보적인 표적 핵산과 혼성활할 시에 표지된 형광염료의 흡광 파장대의 빛을 발산하는 양자점의 빛을 받아 형광 빛을 방출하게 되어서, 다중 검출(multiplex detection)이 가능하다.

물론, 서로 다른 크기의 양자점을 투입 사용하더라도 넓은 흡수 스펙트럼을 갖는 양자점의 특성에 의해서, 서로 다른 크기의 양자점을 단일 여기 광으로 동시 여기시킬 수 있다.

이와 같이 양자점이 주변에 산재되어 있는 상황에서, 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화되면, 형광염료가 소광자로부터 이격되어 형광 빛을 방출할 수 있는 상태로 되므로, 혼성화 여부를 형광 빛으로 검출할 수 있고, 결국, 표적 핵산을 검출할 수 있게 된다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 양자점을 여기시키기 위한 여기 광은 형광 빛과 간섭을 일으키지 아니하는 자외선 또는 레이저로 한다. 이에, 광학계는 하나의 대물렌즈를 통해 여기 광의 광축과 검출을 위한 형광 빛의 광축을 일치시키더라도 형광 빛을 정확하게 검출할 수 있다.

광학계(또는 광학 시스템)에 따르면, 도 4 및 도 5에 간소하게 도시하였지만 도 3에 구체적으로 도시한 바와 같이, 양자점이 산재되어 있는 상황에서 검출 프로브와 표적 핵산이 혼성화되는 수용액에 조사되는 여기 광의 광축과 수용액 내에서 방출되는 형광 빛의 광축을 일치시키되, 이때의 일치된 광축 선상에 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 설치하여 여기 광 조사를 돕는다.

즉, 여기 광이 다이크로익 미러에 반사되어 수용액에 조사되고, 수용액 내에서 발생하는 형광염료의 형광 빛은 다이크로익 미러를 투과하여 형광 빛 검출부(예를 들어 CCD 센서 또는 PMT)에 의해 검출된다.

여기서, 다이크로익 미러는 특정 파장을 초과하는 빛을 모두 통과시키고, 그 이하의 파장을 갖는 빛은 반사시키는 특성이 있으며, 여기 광 파장대 이하의 파장대를 갖는 빛은 반사시키고, 여기 광 파장대을 초과하는 파장대의 빛은 모두 통과시키는 것으로 선택 적용한다.

한편, 여기 광으로 여기시켜 분산광원으로 사용하는 양자점의 방출 빛도 다이크로익 미러를 투과하여 검출될 수 있으므로, 검출부와 다이크로익 미러의 사이에 추가로 다이크로익 미러를 설치하여 양자점의 방출 빛을 반사시키고, 형광 빛을 투과되게 한다.

이를 통해, 양자점의 방출 빛을 검출함으로써, 양자점이 분산광원으로서의 역할을 제대로 하는지 검증할 수 있고, 또는, 혼성화 이전과 혼성화 이후의 빛을 비교하여 혼성화 전후의 상황 변화를 비교 분석할 수도 있다.

본 발명의 실시 예에 따르면, 형광염료의 형광 빛을 검출하여 표적 핵산을 검출하는 방법은 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)에 의해 이루어진다.

융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)은 온도를 높일수록 검출 프로브와 표적 핵산 간의 혼성화 강도가 약해지고, 소정 온도 이상으로 높이면 분리되는 특성을 이용하는 분석 방법으로서, 온도를 점차 높여가며 형광 빛 세기의 변동율을 산정하여 얻는 융해곡선을 패턴 분석(실제로는 융해 피크 분석)하여 표적 핵산의 유무, 또는 표적 핵산 중의 변이 유무 등을 판정할 수 있다. 일반적으로 융해곡선의 융해 피크(melting peak)가 형성되는 부분의 온도를 융해점 또는 Tm (Melting Temperature) 값으로 하여 판정한다.

물론, 형광염료의 형광 빛 및 양자점의 발광 빛을 검출할 시에는 각각 해당 빛의 파장대를 선별적으로 투과하는 필터로 필터링한 후 해당 빛을 측정한다.

<구체적인 실시 예>

본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 적용하여 KRAS G12D 돌연변이를 검출한 실시 예를 도 6 내지 도 9를 참조하며 설명한다.

먼저, 준비단계(S10)를 수행하였다.

이 단계에서는, KRAS G12D 돌연변이의 증폭을 위한 PCR 증폭 시약 20㎕과 KRAS G12D 돌연변이를 함유한 시료 5㎕를 순차적으로 제1 웰(111)에 넣고(S11, S12), 검출 프로브를 함유한 시약 36.8㎕와 키트의 구성품인 양자점의 희석액을 순차적으로 제2 웰(112)에 넣었다(S13, S14).

구체적인 실시 예에서는, KRAS 돌연변이 종류 중에 G12D 및 G12V를 동시 검출하기 위해 각각 타겟으로 하는 돌연변이와 혼성활할 수 있도록 염기서열이 상이한 2종의 PNA 검출 프로브를 사용하였다.

검출 프로브 중에, G12D의 검출을 위한 검출 프로브에는 HEX 형광염료를 표지되어 있고, G12V의 검출을 위한 검출 프로브에는 텍사스 레드 형광염료가 표지되어 있으며, 소광자는 답실(Dabcyl)을 사용한 것으로 하였다. 이러한 검출 프로브는 본 발명의 출원인이 특허출원한 공개특허 제10-2015-0054633호에서 보여준 PNA 프로브을 활용하여 본 발명에 적합하게 한 것으로 하였다.

그리고, HEX 형광염료를 여기시키기 위한 530 QD와, 텍사스 레드 형광염료를 여기시키기 위한 590 QD로 이루어지는 2종의 양자점을 사용한다. 각각의 양자점은 증류수로 1/100로 희석한 후 6.6㎕씩 제2 웰(112)에 넣었다.

다음으로, 조립 단계(S20)를 수행하였다.

이 단계에서는, 커버(120)로 유동 칩(110)을 덮고(S21), 실링 테이프(125)로 투광창(121)을 막아(S22), 유동 칩(110)을 실링하였다. 즉, 끼움부(124)를 함몰부(114)에 억지 끼워넣는 방식으로 커버(120)를 유동 칩(111)에 고정하여 제1,2 웰(111, 112) 및 유로(113)의 상부 열린 개구를 커버(120)로 덮어 실링한다. 이때, 역류방지 돌기(123)에 의해 유로(113)가 막혀 있게 되며, 담금 부재(112)는 일부 제2 웰(112)에 담겨 있게 된다. 한편, 투광창(121)을 실링 테이브(125)로 미리 막아둔 커버(120)를 유동 칩(110)에 고정하여도 좋다.

다음으로, PCR 단계(S30)를 수행하였다.

이 단계에서는 키트(100)를 안착대(301)에 안착한 후, 제1 웰(111)을 히터(300)로 가열 및 냉각하는 사이클을 반복하여 표적 핵산(여기서는 G12D)을 증폭하였다. 구체적인 PCR 증폭 사이클은 예를 들어 본 발명의 출원인이 특허 출원한 공개특허 제10-2015-0054633호에서 KRAS 돌연변이 유전자 검출에 적용한 실시 예를 응용하였다.

이와 같이 양자점이 함유된 제2 웰(112)의 검출 시약을 제1 웰(111)에 투입하기 이전, PCR 증폭하므로 PCR 증폭에 따른 양자점의 열화 문제는 발생하기 아니한다.

또한, 제1 웰(111)은 실링 테이프(125)를 포함한 커버(120)에 의해 밀폐되고, 역류방지 돌기(123)에 의해서도 제2 웰(112)과의 통로인 유로(113)가 막혀 있으므로, PCR 증폭과정에서 증발에 의한 시료의 유실도 방지한다.

다음으로, 혼성화 단계(S40)를 수행하였다.

이 단계에서는 커버(120)에 구비된 담금 부재(122)를 형상 유지부(122a)가 제2 웰(112)의 내부 바닥에 닿을 때까지 눌렀다. 즉, 제2 웰(112)의 검출 시약은 유로(113)를 통해 제1 웰(111)을 향해 흐르려는 압력을 받게 되고, 역류방지 돌기(123)를 탄성 변형 시켜 유로(113)를 개방하며 제1 웰(111)로 투입되었다

이에, 제1 웰(111) 내에서는 양자점이 산재되어 있는 혼합액 내에서 검출 프로브와 표적 핵산(즉, G12D) 간에 혼성화가 진행되었다.

다음으로, 검출 단계(S50)를 수행하였다.

이 단계에서는, 히터(300)를 제어하여 제1 웰(111)의 온도를 서서히 증가시키는 온도 변화를 주며, 광학계(200)로 형광 빛을 검출하여 얻은 융해곡선을 하였다. 여기서, 실링 테이프(125)를 제거하더라도 융해곡선 분석 과정에서 증발 등의 문제가 큰 영향을 주지 아니한다면, 실링 테이프(125)를 제거한 상태에서 검출 단계(S50)를 수행하여도 좋다.

이때의 광학계(200)는 자외선 또는 레이저를 제1 웰(111) 내로 조사하면서 검출되는 형광 빛 및 양자점 방출 빛을 검출한다. 또한, 융해곡선을 얻을 시에는 0.5℃ 간격으로 온도를 상승시키며 형광 빛을 측정함으로써, 융해 피크의 정밀도를 높이는 것이 좋다.

2종의 양자점을 사용하였지만, 넓은 입사 스펙트럼을 갖는 양자점의 특성에 의해, 모든 양자점을 여기시켜 분산광원 역할을 하게 할 수 있다. 그리고, 2종의 양자점은 각기 그 크기에 대응되는 협대역의 빛을 방출하게 되므로, 각자 타겟으로 하는 형광염료를 방출 빛으로 여기시켜 고유 형광 빛을 방출되게 한다.

구체적인 실시 예에서는 405nm 파장대역을 갖는 자외선으로 양자점을 여기시켰다.

도 7은 KRAS G12D 돌연변이(Mutant) DNA와 야생형(wild) DNA의 비율 변화에 따른 결과 그래프로서, KRAS G12D 돌연변이(Mutant) DNA의 비율이 0%, 0.5%, 1%, 10%, 100%인 경우마다 도 6,7 에 도시한 표적 핵산 검출 방법을 반복 수행하여 얻은 결과를 보여준다. 이에 따르면, 융해 피크(melt peak)의 Tm은 45℃ 내지 52℃ 범위 내로 수렴되므로, 이 온도 범위를 KRAS G12D 돌연변이의 판정기준으로 선정하였다.

한편, KRAS G12V의 검출을 위한 검출 프로브 및 590 QD에 의해 검출되는 형광 빛은 유의미한 크기 이하로 미미하였다.

실제 임상샘플에 적용하여 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 검증하였다.

이를 위해서, 인천성모병원 인체유래물질 자원은행에서 임상 검체를 제공받아 본 발명에 따른 표적 핵산 검출 방법을 적용한 결과, 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)에 따른 도 9의 그래프를 얻었다.

도 9의 그래프를 살펴보면, 융해 곡선 중에 융해 피크(melt peak)의 Tm이 48℃인 곡선이 존재하고, 상기한 판정기준 내에 들어가므로, KRAS G12D 돌연변이가 검출되는 것으로 판정 내릴 수 있다.

한편, KRAS G12V 돌연변이의 검출을 위해 투입한 검출 프로브 및 590 QD에 의해 검출되는 융해 곡선 그래프도 나타나기는 하지만, 융해 피크(melt peak)의 Tm이 G12V의 판정범위에 들지 않기 때문에 KRAS G12V 돌연변이가 존재하지 않는 것으로 판정할 수 있다. 또한 융해 피크(melt peak)의 Tm이 판정범위안에 들 경우에도 융해 피크(melt peak)의 최소높이를 지정하여 KRAS G12V 돌연변이는 존재하지 아니하는 것으로 판정 내릴 수 있다. 예를 들어, noise의 판정 기준은 KRAS G12V 돌연변이가 존재하지 아니하는 시료를 검출할 시에 나타나는 융해 피크를 얻어 돌연변이 존재 여부의 판정기준으로 사용할 융해 피크의 threshold 값을 590 QD의 량에 따라 미리 정하여 사용할 수도 있다.

이상에서 본 발명의 기술적 사상을 예시하기 위해 구체적인 실시 예로 도시하고 설명하였으나, 본 발명은 상기와 같이 구체적인 실시 예와 동일한 구성 및 작용에만 국한되지 않고, 여러가지 변형이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 실시될 수 있다. 특히, 키트는 핵산 검출용도에 한정하지 아니하고, 다양한 시료와 시약의 반응 분석을 위한 키트로서 활용될 수 있다. 따라서, 그와 같은 변형도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주해야 하며, 본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 결정되어야 할 것이다.

100 : 키트
110 : 유동 칩 111 : 제1 웰 112 : 제2 웰
113 : 유로 113a : 경사면 114 : 함몰부
120 : 커버 121 : 투광창 122 : 담금 부재
122a : 형상 유지부 123 : 역류방지 돌기 124 : 끼움부
125 : 실링 테이프
200 : 광학계
210 : 대물렌즈부
220 : 제1 다이크로익 미러 221 : 여기 광원
230 : 제2 다이크로익 미러 231 : 양자점 빛 검출부 232 : 필터
240 : 형광 빛 검출부 241 : 필터
300 : 히터 301 : 안착대

Claims

시료를 담아둘 제1 웰(111), 시약을 담아둘 제2 웰(112), 및 제2 웰(112)의 시약이 넘쳐 제1 웰(111)로 투입되게 할 유로(113)를 조성한 유동 칩(110);
시약 및 시료가 새지 아니하도록 유동 칩(110)을 덮어 실링하며, 제2 웰(112)을 덮는 부위에 조성되어 눌림에 의해 제2 웰(112)에 담긴 시약을 제1 웰(111)로 투입되게 할 담금 부재(122), 제1 웰(111)을 덮는 부위에 조성한 투광창(121) 및 제1 웰(111)에서 제2 웰(112)로 역류하는 것을 방지하는 역류 방지 수단을 구비한 커버(120);
를 포함하는 키트.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 커버(120)의 역류 방지 수단은 상기 유로(113)를 막은 상태에서 투입되는 시약의 유압에 의해 제1 웰(111) 방향으로 탄성 변형되며 유로(113)를 개방하는 역류방지 돌기(123)로 구성한 키트.
제 3항에 있어서,
상기 유로(113)는 제1 웰(111)과 이어지는 부위를 하향의 경사면(113a)으로 조성하고,
상기 역류방지 돌기(123)는 상기 유로(113)의 경로 중에 상기 경사면(113a)이 조성된 부위를 막는 키트.
제 1항에 있어서,
상기 투광창(121)은 점착성 또는 접착성의 투명 실링 테이프(125)로 폐구하거나 아니면 투명 재질로 막혀있는 키트.
제 3항에 있어서,
상기 커버(120)는 탄성적으로 수축 가능한 재질로 구성되어, 제1 웰(111), 제2 웰(112) 및 유로(113)의 상부 열린 부위를 덮어 실링하는 키트.
제 1항에 있어서,
상기 제2 웰(112)은 상부로 벌어진 형상이고,
상기 담금 부재(122)는 커버(120) 중에 제2 웰(112)의 상부를 덮는 부위로 구성되되, 하부로 돌출된 구조는 상기 제2 웰(112)의 하부측 내부의 형상으로 형태 유지하는 형상 유지부(122a)로 형성되고, 형상 유지부(122a)에 이어진 상부 구조는 형상 유지부(122a)의 눌림에 의해 하부로 늘어나거나 형상 유지부(122a)를 하부로 이동시키는 데 필요한 길이만큼 주름져 있어 제2 웰(122)에 담기게 할 수 있는 키트.
제1항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중에 어느 하나의 항에 기재된 키트를 포함한 표적 핵산 검출 장치에 있어서,
표적 핵산을 함유한 시료 및 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭 시약을 상기 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산의 검출을 위한 검출 시약을 제2 웰(112)에 넣은 후 제1 웰(111)의 온도 변화를 주는 히터(300)에 안착하여, 온도 변화를 주어 제1 웰(111)의 시료를 PCR 증폭하고, 이후, 제2 웰(112)의 시약을 제1 웰(111)에 투입한 상태에서 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)을 위한 온도 변화를 주도록 히터(300)를 제어하게 되어 있으며, 제1 웰(111)의 온도 변화에 따른 시그널 변화를 투광창(121)을 통해 광학계(200)로 측정하여 표적 핵산을 검출하는 표적 핵산 검출 장치.
제 8항에 있어서,
상기 제2 웰(112)의 시약은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브와, 분산광원으로 이용할 양자점이 고르게 산재되어 있고, 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료가 검출 프로브에 표지되어 있으며,
상기 광학계(200)는 자외선 또는 레이저로 양자점을 여기시켜 양자점의 방출 빛에 의해 여기되는 형광염료의 형광 빛을 검출하는 표적 핵산 검출 장치.
제 9항에 있어서,
상기 광학계(200)는 양자점을 여기시키는 여기 광을 반사시키고 형광염료의 형광 빛을 투과시키는 다이크로익 미리(dichroic mirror)의 도움을 받아 여기 광의 광축 및 형광 빛의 광축을 일치시킨 표적 핵산 검출 장치.
제1항, 제3항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중에 어느 하나의 항에 기재된 키트를 이용한 표적 핵산 검출 방법에 있어서,
표적 핵산을 함유한 시료 및 PCR(polymerase chain reaction, 중합효소 연쇄반응) 증폭 시약을 상기 제1 웰(111)에 넣고, 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브가 함유된 시약을 제2 웰(112)에 넣은 후 제1 웰(111)의 온도 변화를 주어 제1 웰(111)의 시료를 PCR 증폭하는 증폭 단계;
제2 웰(112)의 시약을 제1 웰(111)에 투입하여 검출 프로브를 표적 핵산과 혼성화하는 혼성화 단계; 및
제1 웰(111)에 온도 변화를 주며 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)하여 표적 핵산을 검출하는 검출 단계;
를 포함하는 표적 핵산 검출 방법.
제 11항에 있어서,
상기 시약은 표적 핵산에 대해 상보적 염기서열을 갖는 검출 프로브가 양자점과 함께 산재되어 있는 시약으로서, 혼성화 여부에 따라 형광 특성이 달라지는 형광염료의 상태 변화를 유도하게 되어 있으며,
상기 혼성화 단계는 시약을 시료에 투입함에 따라 양자점이 산재되어 있는 환경 하에서 검출 프로브와 표적 핵산을 혼성화시키고,
상기 검출 단계는 자외선 또는 레이저로 양자점을 여기시켜 양자점을 분산광원으로 함으로써, 양자점의 방출 빛에 의해 여기되는 형광염료의 형광 빛을 검출하여 융해곡선 분석(Melting Curve Analysis)하는 표적 핵산 검출 방법.