CN104062349A - 一种黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，包括如下步骤：步骤一、分别提取多只黑斑蛤蚧和多只红斑蛤蚧的蛋白质样品，之后将蛋白质样品结合于芯片上制成蛋白质芯片，利用飞行时间质谱仪阅读蛋白质芯片，得到黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的蛋白质质谱图，分析筛选出质谱峰的峰值存在显著差异的17个蛋白，计算出17个蛋白用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的峰值，并利用17个蛋白及计算出的鉴定用的峰值建立决策树模型；以及，步骤二、利用与步骤一中相同的方法得到待鉴定蛤蚧的蛋白质质谱图，利用决策树模型比较待鉴定蛤蚧的17个蛋白的质谱峰的峰值，判断出待鉴定蛤蚧的品种。依照本发明的方法，解决了中药药材的规范性检测的问题。

Description

一种黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种从蛋白质谱水平对黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧进行分析，找到差异，通过现代分析方法对蛤蚧这种动物性来源的中药的假冒品、伪劣品、近缘品等进行鉴定的方法，特别涉及一种黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法。

背景技术

中药蛤蚧是壁虎科动物蛤蚧的干燥体，其味咸、性平，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精的功效，被用于制备定喘药物。传统上用于治疗哮喘的入药蛤蚧为产于我国的黑斑蛤蚧(也称黑斑蛤蚧)，随着人们生活水平的提高以及哮喘发病率连续20多年呈上升趋势，近年来黑斑蛤蚧逐渐的减少，大量来自东南亚的红斑蛤蚧占据药品市场，红斑蛤蚧的药效远远不如黑斑蛤蚧。红斑蛤蚧与黑斑蛤蚧在形态上非常接近，干燥体完全无法用肉眼区分，很难从药材本身特别是制成粉末之后的药材来确定动物的品种来源和质量，故目前无规范性的检测方法。

发明内容

为此，本发明提供一种黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，利用表面增强激光解析/电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)进行蛤蚧品种的鉴定，解决了中药药材的规范性检测的问题。需要说明的是，本发明的申请人进行研究的前提并非认为蛋白为蛤蚧有效成分，仅基于蛤蚧为整体入药的动物，抛开其有效成分，单独从中药材个体真伪鉴定而言。

本发明提供的技术方案为：

一种黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，包括如下步骤：

步骤一、分别提取多只黑斑蛤蚧和多只红斑蛤蚧的蛋白质样品，之后将蛋白质样品结合于芯片上制成蛋白质芯片，利用飞行时间质谱仪阅读所述蛋白质芯片，得到黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的蛋白质质谱图，分析筛选出质谱峰的峰值存在显著差异的17个蛋白，计算出17个蛋白用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的峰值，并利用17个蛋白及计算出的鉴定用的峰值建立决策树模型；

步骤二、利用与步骤一中相同的方法得到待鉴定蛤蚧的蛋白质质谱图，利用决策树模型比较待鉴定蛤蚧的17个蛋白的质谱峰的峰值，判断出待鉴定蛤蚧的品种。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，

所述的步骤一中，利用17个蛋白中的四个蛋白质及对应地计算出的鉴定用的峰值建立决策树模型；

所述步骤二中，利用决策树模型比较待鉴定蛤蚧的所述四个蛋白质的质谱峰的峰值判断出待鉴定蛤蚧的品种；

其中，所述四个蛋白质的质荷比分别为6683.75m/z、1483.00m/z、25558.0m/z、和1191.71m/z，所述四个蛋白质的四种。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，

所述步骤一中，17个蛋白中的两个蛋白质及对应地计算出的鉴定用的峰值建立决策树模型；

所述步骤二中，利用决策树模型比较待鉴定蛤蚧的所述两个蛋白质的质谱峰的峰值判断出待鉴定蛤蚧的品种；

其中，所述两个蛋白质的质荷比分别为6683.75m/z和25558.0m/z。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，所述决策树模型中以质荷比为6683.75m/z的蛋白质的用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的质谱峰的峰值为根结点，以其他蛋白质的用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的质谱峰的峰值为枝结点。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，蛋白质的用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的质谱峰的峰值为一确定数值或一数值范围。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，所述步骤一中，所用的芯片为CM10芯片，

将预湿的CM10芯片、100μg蛋白质样品和体积为所述100μg蛋白质样品2倍的CM10芯片的结合缓冲液混匀，震荡1h后除去液体，使用CM10芯片清洗缓冲液清洗CM10芯片3次，再使用1mM HEPES清洗1次，待干后，即制成蛋白质芯片。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，制成蛋白质芯片后，还包括：在所述蛋白质芯片的每个加样孔分两次加入饱和SPA溶液，每次加0.5μL，之后利用飞行时间质谱仪阅读所述蛋白质芯片。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，所述步骤一中，飞行时间质谱仪阅读蛋白质芯片的条件设置为：

激光强度：250；

检测敏感度：9；

分子量优化范围：1000-50000m/z，最佳聚焦中心为8000m/z；

数据采集参数范围20～80，收集点数为100次。

优选的是，所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法中，所述步骤一中，利用30只黑斑蛤蚧和30只红斑蛤蚧提取蛋白质样品，

提取前，将所述30只黑斑蛤蚧和30只红斑蛤蚧分成若干组，取每组内蛤蚧的四肢、躯干和尾部的组织，将每组内相同部位的组织混匀后作为一个样本用来提取蛋白质样品。

针对蛤蚧是动物来源的中药，且动物机体中富含蛋白质这一个特点，本研究采用表面激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI)对红斑蛤蚧与黑白蛤蚧进行谱图比较分析，找到特异的峰值的蛋白峰建立模型，用此对蛤蚧的品种分别进行验证。据此认为，该技术可推广用于蛤蚧的假冒品、伪劣品、近缘品等进行分辨，同时为其他动物药材的质量鉴定开辟新的途径。

长期以来，如蛋白质电泳技术、DNA分子标记技术等各种生物技术被应用到动物类贵重药材的鉴定中。而近年来，液质联用技术应用于中药质量的监控，从中药“全成分”快速表征的视角揭示中药近缘品种差异和化学多样性方法一花独秀，显示出良好的应用前景，因此用质谱的方法建立中药蛋白质指纹图谱是解决中药质量控制最为有效的方法。，为将蛋白质谱用于不同种属的动物中药个体的真伪鉴定提供了可能，对于其它动物类的中药的鉴定提供了参考

中药药效成分和机制研究是中药现代化研究的重要组成部分，但由于中药是一个复杂的生命和物质体系，揭示中药特别是动物药的有效成分还需要借助高通量并行的先进技术。利用新的技术和方法比较分析不同样本或组织整体蛋白质表达的差异，并对差异蛋白进行鉴定和定量，筛选与药理作用相关的蛋白标记，以这类蛋白为依据，可以有效的分析和评价中药的有效成分。目前可用于该类研究目的的蛋白组学研究优势正在受到关注，蛋白组学研究方法较普通的研究方法具有巨大的优势。本发明的研究手段也可用于此种用途上，从整体上筛选蛤蚧的具药用价值的相关蛋白。

依照本发明的方法能迅速准确地鉴别出蛤蚧的品种，使中药行业的原材料的选取质量得到保障，使中药药材得到了规范性的检测。

附图说明

图1为本发明所述的差异蛋白的质谱峰的部分截图；

图2为本发明所述的以两个蛋白建立的决策树模型的模式图；

图3为本发明所述的以两个蛋白建立的决策树模型的ROC曲线；

图4为本发明所述的以四个蛋白建立的决策树模型的模式图；

图5为本发明所述的以四个蛋白建立的决策树模型的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例一：

(一)材料与方法

1、实验仪器、试剂和耗材

ProteinChip Biosystems(Ciphergen Protein Biogical System IIc plusSELDI-TOF-MS)；

M-PERR Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo78505)；

Protease Inhibitor Cocktails(Amresco M221)：

PierceR BCA Protein Assay Kit(Thermo23225)；

蛋白质芯片CM10(Bio-Rad)；

all-in-one校正芯片(Ciphergen公司)；

基质(SPA，芥子酸)(Bio-Rad)；

HPLC水，蛋白酶抑制剂。

2、实验材料

实验用黑斑蛤蚧产自广西的大新、马山等十多个县，红斑蛤蚧产自越南。

3、蛤蚧样品的选取(动物的选择和分组)

为了避免在提取和分离蛋白质的过程中出现个体差异的蛋白质点被筛选出来，本申请的发明人采取标本混合策略，每5个蛤蚧分为一组，每组取相同部位混合后提取蛋白质。

4、蛤蚧组织的取样

红斑蛤蚧和黑斑蛤蚧放于无水酒精中溺死，-20℃冰箱冷藏。取样前将蛤蚧置于4℃冰箱解冻，每个蛤蚧单体，在复融时用手术刀迅速切取上肘部、体部(即躯干部)以及尾部三个部位的组织，并用手术刀迅速刮切下肌肉组织。

5、蛋白提取

将蛋白组织样品装于玻璃试管，并将试管置于冰粒上进行组织匀浆，细胞浆中蛋白提取使用Thermo公司的M-PERR Mammalian Protein ExtractionReagent试剂盒(试剂盒编号：78505)，并在提取过程中加入蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktails M221)，提取步骤严格和蛋白酶抑制剂加入量按两个试剂盒的说明书进行。

6、蛋白定量

所提取的蛋白样品用Thermo公司的PierceR BCA Protein Assay Kit(编号：23225)定量，操作步骤按照试剂盒说明书进行，于酶标仪上测定光吸收值，对比以BSA为标准的标准曲线计算蛋白浓度后，将各用于制备蛋白芯片样本的总蛋白量调节至100μg。

7、蛋白芯片制备

将预湿的CM10芯片、100μg蛋白质样品和体积为蛋白质样品2倍的CM10芯片结合缓冲液混匀，震荡1h后甩出液体，首先用CM10清洗缓冲液清洗芯片3次，使用1mM HEPES(pH4.0)溶液清洗一次，风干后，在每个加样孔上加0.5μL饱和SPA作用，共加2次，待干后，上机测定。每个样本在不同批次CM10芯片的芯池中重复加样三次。

8、仪器校正

用点于NP-20芯片的all in one标准品对飞行时间质谱仪进行校准，操作按Ciphergen公司all-in-one芯片说明书中提供的方法和程序进行。

9、质谱条件以及数据采集方法

质谱检测时设置的仪器参数为：激光强度：250，检测敏感度：9，分子量优化范围为：1000-50000m/z，最佳聚焦中心为8000m/z，数据采集参数范围20～80，收集点数为100次。用Ciphergen proteinchip3.2.1和BiomarkerWizard软件对各检测样品所得蛋白质图谱进行比对分析。

10、数据分析、建模以及盲筛方法

采用SPSS16.0对Biomarker Wizard软件统计的各个峰值进行方差分析，在黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧中筛选出多个差异峰，利用Biomarker Pattern软件建立决策树模型，然后用随机抽取的测试组蛋白样本数据信息对该模型进行盲法验证，以判断模型判断的准确性、特异度和灵敏度，

(二)结果

1、CM10芯片蛋白质谱检测数据

30例黑斑蛤蚧和30例红斑蛤蚧的原始蛋白图谱标准化后，用BiomarkerPattern软件质荷比1000m/z-50000m/z范围内共检测到88个蛋白峰，以M6683.75(表示质荷比为6683.75m/z的蛋白质)为例，见图1。其中17个蛋白在黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧的比较中具有显著性差异(P＜0.05)，见表1。与红斑蛤蚧蛋白质谱相比，黑斑蛤蚧中有4个标志分子高表达，13个标志分子低表达。

2、黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧的决策树模型的建立与验证

采用Ciphergen公司Biomarker Pattem软件对来经过Bomarker Wizard处理后的数据进一步分析发现，没有任何一个单独的标志峰能100％区分黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧。通过对原始图谱的初步判断，从筛选出的17个差异蛋白中选择建模型用的2个蛋白：M6683.75和M25558.0(指质荷比分别为6683.75m/z和25558.0m/z的两个蛋白质)。各蛋白的重要性分值见表2，(VariableImportance即变量的重要性)变量的重要性分值提示在数据挖掘过程中黑斑蛤蚧组与红斑蛤蚧组之间可能有意义的蛋白使用次数，利用这两个蛋白建立起一个模型，共生成3个节点，该模型通过将60例样本反复地分为学习组和验证组，得到一比较合理的决策树模型，该决策树模型可以准确地区分黑斑蛤蚧组与红斑蛤蚧组。该决策树模型如图2所示。如表3所示，在19例黑斑蛤蚧组与22例红斑蛤蚧组中，18例黑斑蛤蚧被判断准确，有1例黑斑蛤蚧被误判为红斑蛤蚧，有1例红斑蛤蚧被误判为黑斑蛤蚧，经计算，如表4所示，决策树模型判断的灵敏度为94.7％，特异度为95.5％，准确率为95.1％。进一步计算该模型的ROC曲线下面积为0.957，如图3所示，证明该模型具有极好的判断效果。这里将判断结果为黑斑蛤蚧定义为阳性，判断为红斑蛤蚧定义为阴性，灵敏度指将实际为黑斑蛤蚧的蛤蚧正确地判定为真阳性的比例，特异度是指将实际为红斑蛤蚧的蛤蚧正确判定为真阴性的比例。

表1黑斑蛤蚧组与红斑蛤蚧组蛋白图谱数据比较

表2黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧决策树模型中2个蛋白的重要性分值

表3黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧决策树模型的评价

表4该模型对黑斑和红斑蛤蚧的判断准确性的分析

实施例二：

决策树模型的建立与检验结果

采用Ciphergen公司Biomarker Pattern软件对来经过Bomarker Wizard处理后的数据进一步分析发现，没有任何一个单独的标志峰能100％区分黑斑蛤蚧与红斑蛤蚧。Biomarker Pattern分析软件自动选取出质荷比为分别为6683.75m/z、1483.0m/z、25558.0m/z、和1191.71m/z的四个标志蛋白建立决策树模型。

随机选取的包括黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧在内的41例样本用于此决策树模型的验证，结果如图4所示，所有样本在根结点处node1被M6683.75标志蛋白划分为两组，峰值＜1.548的14例样本被划分到左侧的枝结点node2内，由M1483.0标志蛋白继续划分，其中的13例样本被划分到叶结点terminalnode1，判断出其为黑斑蛤蚧，而1例被划分到叶结点terminal node2，被判断为红斑蛤蚧；而在M6683.75标志蛋白处峰值＞1.548的27例样本则被划分到右侧的枝结点node3，继续被M25558.0标志蛋白划分，其中的22例样本被分到左侧枝结点由M1191.71划分，另5例样本被划分到叶结点terminalnode5，被判断为黑斑蛤蚧；被M1191.71划分的22例样本中有20例被判断为红斑蛤蚧，有2例未能被正确区分。

如表5和图5所示，采用质荷比为分别为6683.75m/z、1483.0m/z、25558.0m/z、和1191.71m/z的四个标志蛋白的谱峰组合样式建立的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧决策树模型，该模型对黑斑蛤蚧判断的准确性为100.000％，对红斑蛤蚧判断的准确性为95.455％，判断的特异度和灵敏度的ROC值均为0.999。

表5该模型对黑斑和红斑蛤蚧的判断准确性的分析

实施例三：

利用表1中的17个蛋白建立起一个决策树模型，在19例黑斑蛤蚧组与22例红斑蛤蚧组中，19例黑斑蛤蚧被准确判断，22例红斑蛤蚧被准确判断，该决策树模型判断的灵敏度为100％，特异度为100％，准确率为100％。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.一种黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、分别提取多只黑斑蛤蚧和多只红斑蛤蚧的蛋白质样品，之后将蛋白质样品结合于芯片上制成蛋白质芯片，利用飞行时间质谱仪阅读所述蛋白质芯片，得到黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的蛋白质质谱图，分析筛选出质谱峰的峰值存在显著差异的17个蛋白，计算出17个蛋白用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的峰值，并利用17个蛋白及计算出的鉴定用的峰值建立决策树模型；

以及，

步骤二、利用与步骤一中相同的方法得到待鉴定蛤蚧的蛋白质质谱图，利用决策树模型比较待鉴定蛤蚧的17个蛋白的质谱峰的峰值，判断出待鉴定蛤蚧的品种。

2.如权利要求1所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，

所述步骤一中，利用17个蛋白中的四个蛋白质及对应地计算出的鉴定用的峰值建立决策树模型；

所述步骤二中，利用决策树模型比较待鉴定蛤蚧的所述四个蛋白质的质谱峰的峰值判断出待鉴定蛤蚧的品种；

其中，所述四个蛋白质的质荷比分别为6683.75m/z、1483.00m/z、25558.0m/z、和1191.71m/z，所述四个蛋白质的四种。

3.如权利要求1所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，

所述步骤一中，17个蛋白中的两个蛋白质及对应地计算出的鉴定用的峰值建立决策树模型；

所述步骤二中，利用决策树模型比较待鉴定蛤蚧的所述两个蛋白质的质谱峰的峰值判断出待鉴定蛤蚧的品种；

其中，所述两个蛋白质的质荷比分别为6683.75m/z和25558.0m/z。

4.如权利要求1～3任一项所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，所述决策树模型中以质荷比为6683.75m/z的蛋白质的用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的质谱峰的峰值为根结点，以其他蛋白质的用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的质谱峰的峰值为枝结点。

5.如权利要求4所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，蛋白质的用于鉴定黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的质谱峰的峰值为一确定数值或一数值范围。

6.如权利要求5所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中，所用的芯片为CM10芯片，

将预湿的CM10芯片、100μg蛋白质样品和体积为所述100μg蛋白质样品2倍的CM10芯片的结合缓冲液混匀，震荡1h后除去液体，使用CM10芯片清洗缓冲液清洗CM10芯片3次，再使用1mM HEPES清洗1次，待干后，即制成蛋白质芯片。

7.如权利要求1或5任一项所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，制成蛋白质芯片后，还包括：在所述蛋白质芯片的每个加样孔分两次加入饱和SPA溶液，每次加0.5μL，之后利用飞行时间质谱仪阅读所述蛋白质芯片。

8.如权利要求1所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中，飞行时间质谱仪阅读蛋白质芯片的条件设置为：

激光强度：250；

检测敏感度：9；

分子量优化范围：1000-50000m/z，最佳聚焦中心为8000m/z；

数据采集参数范围20～80，收集点数为100次。

9.如权利要求1所述的黑斑蛤蚧和红斑蛤蚧的鉴定方法，其特征在于，

所述步骤一中，利用30只黑斑蛤蚧和30只红斑蛤蚧提取蛋白质样品，

提取前，将所述30只黑斑蛤蚧和30只红斑蛤蚧分成若干组，取每组内蛤蚧的四肢、躯干和尾部的组织，将每组内相同部位的组织混匀后作为一个样本用来提取蛋白质样品。